米糠多糖的提取研究及米糠中水溶性维生素的测定.doc

米糠多糖的提取研究及米糠中水溶性维生素的测定 （江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡214122）摘要：微波浸提法研究了米糠多糖的提取，HPLC法同时测定了米糠中4种水溶性维生素。料液比为1：8在50微波火力条件下浸提30min，三氯乙酸去蛋白，两步去淀粉，30醇沉，米糠多糖得率达1.41%。以体积比为88:12的0.1磷酸水溶液-甲醇为流动相，以0.6 mL/min流速等度洗脱，在266nm波长下检测。各组分在8min能基线分离。米糠中VB1、VB6、烟酸和烟酰胺的含量分别为7.710-6 g/g、1.310-6g/g、14.910-6 g/g、16.210-6 g/g。关键词：米糠；多糖；微波浸提；水溶性维生素；高效液相色谱Study on Microwave Assistant Extraction of Rice Bran Polysaccharides and Determination of Water-Soluble Vitamins in Rice BranAbstract: Microwave assistant extraction has been applied for polysaccharides in rice bran samples. The best technology were that the material-water ratio was 1:8, the time of microwave assistant extraction was 30 min under 50% firepower. It was proved that -amylase could wipe off amylum effectively by two steps, and trichloroacetic acid method was the best way to wipe off albuminoid. And the ethanol concentration was 30%, the extraction rate of the water-soluble polysaccharides of rice bran was 1.41%.High performance liquid chromatography (HPLC) has been applied for the simultaneous determination of four kinds of water-soluble vitamins including vitamin B1, vitamin B6, nicotinic acid, and nicotinamide in rice bran. The separation was performed on a Hypersil C18 column (250 cm4.6mm i.d., 5.0 m) with a mobile phase of 0.1% H3PO4- methanol (88:12, V/V) at flow rate of 0.6 mL /min, and detection wavelength was 266 nm. Baseline separation of four vitamins can be achieved within 8 minutes.The content of 7.710-6 g/g、1.310-6g/g、14.910-6 g/g、16.210-6 g/g for vitamin B1, nicotinic acid ,vitamin B6 and nicotinamide.Key words: rice bran; polysaccharides; microwave assistant extraction; water-soluble vitamins; high performance liquid chromatography米糠是一类具有广泛开发潜力的高附加值资源，含有稻米的64营养物质及90人体所需要的各种营养元素1，包括维生素、米糠多糖、氨基酸、脂肪酸、矿物质，还有二十八碳烷醇、神经酰胺等生理功能卓越的活性物质2。米糠多糖（Rice Brain polysaccharide，RBP）存在于稻谷的颖果皮层里，主要是指分子量不等的一类非淀粉多糖。采用不同的提取工艺会得到不同的米糠多糖组分。米糠多糖具有广泛的生理活性，在抗肿瘤，增强免疫力，降血糖，降脂方面有显著效果；水溶性维生素是一类重要的营养成分，在各种保健品3，功能型饮料中得到应用。烟酸和烟酰胺能够促进头皮血液循环，防止脱发；VB6具有美发功效；VB1具有滋养与深层清洁的作用，因此化妆品中也常添加微量的维生素4。因此，本实验对这两种活性成分进行了研究。多糖提取的方法有微波浸提法，热水蒸煮法，超声波提取法等。实验中考察了米糠多糖的提取方法及去除杂质方法。选取较优的微波提取法，并对其提取工艺参数进行了进一步优化。测定维生素的方法有紫外分光光度法5、荧光法6和高效液相色谱法（HPLC）7。但HPLC技术用于米糠中水溶性维生素的测定还未见报道。实验采用HPLC建立了米糠中的水溶性维生素的测定方法，对样品前处理方法进行了研究，对测定体系各影响因素进行了优化。方法简便快速，准确可靠，对复杂体系中水溶性维生素的测定具有重要的参考价值。一 米糠多糖的提取研究1. 米糠多糖的提取1.1 实验材料米糠：无锡秦良商贸有限公司耐高温-淀粉酶：无锡酶制剂厂，20000IU/g试剂：无水乙醇、石油醚、三氯乙酸、盐酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。1.2仪器722型可见光分光光度计；LD4-2A型台式离心机；Panasonic微波炉；真空冷冻干燥机。1.3实验方法1.3.1 米糠样品的前处理将米糠用石油醚按1：3比例脱脂1小时，重复3次，自然干燥。1.3.2 用改进的硫酸-苯酚法测米糠多糖含量1.3.2.1 显色剂的制备将50 mL浓硫酸缓缓加入10 mL水中，冷却至室温，加入0.6 g苯酚晶体搅拌使其溶解配成显色液。1.3.2.2 硫酸-苯酚法测米糠多糖含量取1.00 mL稀释一定倍数的糖液于试管中加入5.00 mL显色液振荡混匀；取1.00 mL蒸馏水于试管中加入5.00 mL显色液振荡混匀，得到参比溶液。将标准溶液和参比溶液置于沸水浴中保温3035 min，取出后放在冷水浴中冷却至室温，于490 nm波长处测定其吸光值。传统的硫酸-苯酚测糖法的操作过程是：取1.00 mL样品加1.00 mL水，加1.00 mL 6 %苯酚摇匀后再加入5 mL浓硫酸，振荡显色，静置30 min后，于490 nm处检测其吸光度。加入硫酸时系统显色温度相差较大，而造成相应的偶然偏差。而改进后的方法，由于先把水和硫酸混合，对浓硫酸起到了稀释作用，用冰水冷却最后加入苯酚晶体，配成显色液。通过沸水浴加热来使其显色，保证了反应系统温度一致，很好地解决了检测重现性与准确度的问题。1.3.3去除杂质方法的比较在多糖提取的过程中，蛋白与淀粉的去除会影响到多糖的纯度与得率。因此本实验采用50%微波火力浸提30min，重复两次提取。考察了Sevage法与三氯乙酸法去蛋白法；同时也考察了淀粉一步消化法与两步消化法。正交实验见表1。实验结果见图 1。Sevage法三氯乙酸法一步消化法两步消化法30%醇沉 由此可以看出：淀粉一步消化所得多糖略高于两步消化所得，可能是由于在较短的时间内淀粉未去尽，而淀粉本身就是一种多糖物质，为了得到较纯的米糠多糖，实验优先考虑采用两步消化法；在去蛋白的方法中，比较、得知，采用Sevage法与三氯乙酸法所得米糠多糖含量差别不大，考虑到Sevage法毒性较大，耗时较长，实验优先考虑三氯乙酸法。图 1 正交实验结果1.3.4 米糠多糖提取方法选择1.3.4.1 微波浸提法脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：10混合置于50微波火力下浸提30min，冷却，离心得上层液，重复提取两次，合并上层液。在上层液中加入0.5的耐高温-淀粉酶于70oC的水浴锅中保温消化2小时后，再加入0.25的0.5的耐高温-淀粉酶，在相同的条件下保温消化15小时，离心得上清液。用30的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH4.5（即米糠蛋白等电点，pI），置于4oC冰箱中静置过夜，使得米糠蛋白得以充分沉淀。离心得上清液。在上述得到的上清液中，加入无水乙醇，使其含量为30（V/V），置于4oC冰箱中静置过夜，离心，得到米糠粗多糖RBPa溶液。用722型分光光度计测其吸光值，计算米糠多糖含量。1.3.4.2热水蒸煮浸提法脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：10混合置于110oC水浴锅中，使其保持沸腾状态2小时，期间不断搅拌，定时补入损失的水分，冷却，离心得上层液，重复提取两次，合并上层液。下续步骤同1.3.4.1。1.3.4.3 超声波浸提法 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：10混合，在80oC条件下超声提取30min，冷却，离心得上层液，重复提取两次，合并上层液。下续步骤同1.3.4.1。1.3.5比较结果 上述方法均是参考了有关文献报道，采用的提取率相对较高的实验条件。通过722型分光光计对两种糖含量的测定，见图2。可见，微波法不仅在提取时间而且在糖的浸出率方面更具有优势。因此实验采用微波浸提法，并对提取时间，提取火力进行了研究。 图 2 3种提取方法所得米糠多糖含量1.3.5 微波浸提工艺1.3.5.1 微波提取 脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：8混合，分别在50微波火力条件下浸提30min（），50min（）；100微波火力条件下浸提30min（）、50min（）。冷却，离心。各重复两次提取，合并上层液。1.3.5.2 两步消化法去除淀粉 在上层液中加入0.5的耐高温-淀粉酶于70oC的水浴锅中保温消化2小时后，再加入0.25的0.5的耐高温-淀粉酶，在相同的条件下保温消化15小时，离心得上清液。1.3.5.3 三氯乙酸去除蛋白质 用30的三氯乙酸调节上述得到的上清液的pH值4.5（即米糠蛋白等电点，pI），置于4oC冰箱中静置过夜，使得米糠蛋白得以充分沉淀。离心得上清液。1.3.5.4乙醇沉淀米糠多糖在上述得到的上清液中，加入无水乙醇，使其含量为30（V/V），置于4oC冰箱中静置过夜，离心，得到米糠粗多糖RBPa。1.3.5.5 不同提取条件下米糠多糖含量比较 图 3 微波提取4种条件所得米糠多糖含量 由图 3得知，微波提取条件，可见微波火力增大会对多糖造成一定的破坏；提取时间过长也存在同样的情况。当微波辐射时间一定时，微波火力越高，物系吸收微波能越多，物系温度升的越快，固液传质速度亦越快；且温度越高，对物料细胞破坏作用越大，有利于物料有效成分浸出。但当微波火力增加到一定程度时，微波有可能促使米糠多糖分解，反而使米糠多糖提取率下降。1.3.5.6 真空冷冻干燥将微波方法所得的米糠多糖RBPa透析48小时后，冷冻干燥得到RBPa的固体粉末。2讨论因此，脱脂米糠与pH=5的盐酸水溶液以料液比为1：8混合，三氯乙酸法去除蛋白，两步法去除淀粉，在50微波火力条件下浸提30min（）为最佳米糠多糖提取方法。米糠得率为1.41。RBPa为淡黄色絮状固体，无味。苯酚硫酸试剂反应均呈棕红色，与碘反应不显蓝色；易溶于水，不溶于乙醇、乙醚和丙酮，无甜味，无挥发性，水溶液为浅黄色。二、高效液相色谱法测定米糠中的水溶性维生素1 实验部分1.1 仪器、试剂与样品仪器： Waters505高效液相色谱仪（包括2487紫外检测器）， Empower色谱工作站。色谱柱：Hypersil C18（250 cm4.6mm i.d., 5.0m）。超声波振荡器（BRANSON SB 3200T，上海）；固相萃取柱（固相PT-系列，河北省津杨滤材厂）等。试剂： VB6（纯度 99）、烟酰胺（纯度 99）、烟酸（纯度99.5）、VB1（纯度98）。均购自国药集团化学试剂有限公司（上海）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。米糠样品来源于无锡秦良商贸有限公司。1.2 色谱条件色谱柱：Hypersil C18 柱（250 cm4.6mm i.d., 5.0m）, 流动相：A: 0.1 %磷酸水溶液, B:甲醇，以体积比 A:B=88:12等度洗脱；流速为0.6 mL/min。检测波长：266nm；进样量 20 L。1.3试液的制备1.3.1标准溶液的制备精确称取约0.05g的四种维生素标准品，用0.01mol/L盐酸溶解并稀释到50 mL，摇匀，分别得到1.3610-3 g/mL，1.1810-3 g/mL，1.0410-3g/mL和1.00 10-3.g/mL的 VB1，VB6，烟酸和烟酰胺的标准储备液，于4冰箱中保存。储备液用流动相稀释得所需浓度的标准溶液。1.3.2 米糠供试品溶液的制备取10.00g米糠于100mL锥形瓶中，加入20mL混合溶剂（体积比为80:20的甲醇0.01mol/L盐酸溶液）超声提取30min，过滤，滤渣用相同的条件重复提取两次，合并提取液。用旋转蒸发仪蒸发浓缩，浓缩液用无水乙醚萃取两次脱脂，水相经0.45m滤膜过滤，再过固相萃取柱，定容至10mL容量瓶中，即得米糠供试品溶液。2结果与讨论在上述色谱条件下，四种维生素在8min内达到基线分离，得到4种维生素的标样图，见图1t/min图1 水溶性维生素混合标准溶液色谱图 峰标：1.VB1； 2.烟酰胺；3.烟酸；4.VB62.3方法学评价2.3.1 重现性试验取4种维生素的标准储备液等体积混和，然后稀释16倍，在上述优化实验条件下连续5次进样，测得其峰面积及保留时间的相对标准偏差（RSD）均小于2，结果表明其重现性较好。如表1所示表1 重现性试验组分RSD（%） (n=5)保留时间峰面积VB10.040.70烟酸0.050.50VB60.122.0烟酰胺0.040.792.3.2标准曲线及检出限配置了一系列不同浓度的 VB1、VB6、烟酸和烟酰胺的混合标准溶液，在优化的实验条件下，进行了测定，得出各组分的线性回归方程、线性范围，并以3倍信噪比得到检测限，结果如表2所示。结果显示线性范围宽，检测限低。表2 回归方程及检测限组分线性范围/（g/mL）回归方程R2 检测限/ (g/mL）VB18.510-78.510-5Y=5.84107X+28.420.99994.310-7烟酸9.310-76.510-5Y=4.91107X+7.070.99993.210-7VB61.010-67.410-5Y=1.45107X+65.270.99993.410-7烟酰胺6.010-76.210-5Y=6.06107X5.910.99993.010-72.4 样品的测定及回收率实验按1.3.2和1.