安全生产_食品安全仪器检测技术教材

第三章食品安全仪器检测技术 第三章 概述 色谱法是混合物最有效的分离 分析方法 俄国植物学家茨维特在1906年使用的装置 色谱原型装置 如右图 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程 其中的一相固定不动 称为固定相 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体 气体或液体 称为流动相 请指出由图中什么是固定相 什么是流动相 3 1气相色谱法 3 1 1概述 概述 色谱法 气相色谱法 液相色谱法 其他色谱法 按分离柱不同可分为 填充柱色谱和毛细管柱色谱 液固色谱 液液色谱 按固定相的不同又分为 气固色谱和气液色谱 薄层色谱 纸色谱 凝胶色谱法 超临界色谱 高效毛细管电泳 3 1气相色谱法 3 1 1概述 概述 色谱法的特点1 分离效率高复杂混合物 有机同系物 异构体 手性异构体 2 灵敏度高可以检测出 g g 1 10 6 级甚至ng g 1 10 9 级的物质量 3 分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析 4 应用范围广气相色谱 沸点低于400 的各种有机或无机试样的分析 液相色谱 高沸点 热不稳定 生物试样的分离分析 不足之处 被分离组分的定性较为困难 3 1气相色谱法 3 1 1概述 气相色谱 用气体作流动相 液相色谱 用液体作流动相 气相色谱法 gaschromatography简称GC 是色谱法的一种 以惰性气体为流动相 以固定液或固体吸附剂作为固定相的色谱法称为气相色谱法 GC 气相色谱法由于所用的固定相不同 可以分为两种 以固体吸附剂作为固定相的色谱称为气固色谱 以固定液作为固定相的色谱称为气液色谱 气液色谱的固定相是在化学惰性的固体颗粒表面上 涂一层高沸点有机化合物的液膜或直接将高沸点有机化合物均匀地涂敷在毛细管的内壁 并形成一层均匀的液膜 3 1气相色谱法 3 1 1概述 3 1 2原理 3 1气相色谱法 原理 气相色谱主要利用各组分在流动相 气相 和固定相之间的分配系数的不同以达到分离的目的 这与色谱过程的热力学性质有关 同时 两组分的分离效能还与其在色谱柱中传质和扩散行为即色谱动力学有关 3 1 3色谱分离条件的选择 1 固定相的选择气 固色谱 固定相一般是表面具有一定活性的固体吸附剂 在选择时 可根据样品的性质 参考各种吸附剂特性和应用范围选择合适的吸附剂 气 液色谱 固定相由担体和固定液组成 固定液是一种高沸点的有机物 一般根据样品的性质 可按照 相似相容 的原理选择固定液 2 载气及流速的选择载气选用惰性气体 如H2 H2 He Ar等 3 1 3色谱分离条件的选择 曲线的最低点 塔板高度H最小 柱效最高 其相应的流速是最佳流速 从图可知 当u较小时 分子扩散项B u是影响板高的主要因素 此时 宜选择相对分子质量较大的载气 N2 Ar 以使组分在载气中有较小的扩散系数 当u较大时 传质阻力项Cu起主导作用 宜选择相对分子质量小的载气 H2 He 使组分有较大的扩散系数 减小传质阻力 提高柱效 在实际工作中 为了缩短分析时间 往往载气流速要稍大于最佳流速 3 1 3色谱分离条件的选择 3 柱温的选择柱温是一个重要的操作变数 直接影响分离效能和分析速度 首先要考虑到每种固定液都有一定的使用温度 柱温不能高于固定液的最高使用温度 否则固定液挥发流失 柱温对组分分离的影响较大 提高拄温使各组分的挥发靠拢 不利于分离 所以 从分离的角度考虑 宜采用较低的柱温 但柱温太低 被测组分在两相中的扩散速率大为减小 分配不能迅速达到平衡 峰形变宽 柱效下降 并延长了分折时间 选择的原则是 在使最难分离的组分能尽可能好的分离的前提下 尽可能采取较低的柱温 但以保留时间适宜 峰形不拖尾为度 具体操作条件的选择应根据不同的实际情况而定 3 1 3色谱分离条件的选择 4 进样时间和进样量进样速度必须很快 一般用注射器或进样阀进样时 进样时间都在一秒钟以内 若进样时间过长 试样原始宽度变大 半峰宽必将变宽 甚至使峰变形 进样量一般是比较少的 液体试样一般进样0 1 5 L 气体试样0 1 10mL 进样量太多 会使几个峰叠在一起 分离不好 但进样量太少 又会使含量少的组分因检测器灵敏度不够而不出峰 最大允许的进样量 应控制在峰面积或峰高与进样量呈线性关系的范围内 3 1 3色谱分离条件的选择 5 气化温度进样后要有足够的气化温度 使液体试样迅速气化后被载气带人柱中 在保证试样不分解的情况下 适当提高气化温度对分离及定量有利 尤其当进样量大时更是如此 一般选择气化温度比往温高30 70 3 1 3色谱分离条件的选择 6 检测温度为了使色谱柱的流出物不在检测器中冷凝而污染检测器 检测温度需高于柱温 一般可高于柱温30 50 或等于汽化室温度 3 1 3色谱分离条件的选择 7 柱长和内径由于柱长与分离度的平方成正比 所以增加柱长可以使分离度提高 但增加柱长会使各组分的保留时间增加 延长分析时间 因此在满足一定分离度的条件下 应尽量使用较短的柱子 增加色谱柱的内径 可以增加分离的样品量 但由于纵向扩散路径的增加 会使柱效降低 3 1 4气相色谱仪器简介 1 载气钢瓶 2 减压阀 3 净化干燥管 4 针形阀 5 流量计 6 压力表 4 针形阀 5 流量计 6 压力表 7 进样器 8 色谱柱9 热导检测器 10 放大器 11 温度控制器 12 记录仪 载气系统 进样系统 色谱柱 检测系统 温控系统 1 载气系统包括气源 净化干燥管和载气流速控制 常用的载气有 氢气 氮气 氦气 净化干燥管 去除载气中的水 有机物等杂质 依次通过分子筛 活性炭等 载气流速控制 压力表 流量计 针形稳压阀 控制载气流速恒定 3 1 4气相色谱仪器简介 2 进样系统 3 1 4气相色谱仪器简介 液体进样器 不同规格的专用注射器 填充柱色谱常用10 L 毛细管色谱常用1 L 新型仪器带有全自动液体进样器 清洗 润冲 取样 进样 换样等过程自动完成 一次可放置数十个试样 气化室 将液体试样瞬间气化的装置 无催化作用 3 分离系统 3 1 4气相色谱仪器简介 分离系统有色谱柱组成 是色谱仪的核心部件 它的作用是将多组分样品分离为单个组分 色谱柱分为填充柱和毛细管柱两类 填充柱 内径2 6mm 柱长0 5 10m 相对较短 分离效率较低 毛细管柱 内径0 1 0 5mm 柱长15 100m 渗透性好 分离效率高 可用于分离复杂的混合物 4 温控系统 3 1 4气相色谱仪器简介 温度是色谱分离条件的重要选择参数 气化室 分离室 检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温度 气化室 保证液体试样瞬间气化 检测器 保证被分离后的组分通过时不在此冷凝 分离室 准确控制分离需要的温度 当试样复杂时 分离室温度需要按一定程序控制温度变化 各组分在最佳温度下分离 4 检测系统 3 1 4气相色谱仪器简介 色谱仪的眼睛 通常由检测元件 放大器 显示记录三部分组成 被色谱柱分离后的组分依次进入检测器 按其浓度或质量随时间的变化 转化成相应电信号 经放大后记录和显示 给出色谱图 3 1 5气相色谱检测器 常用检测器 热导池检测器氢火焰离子化检测器电子捕获检测器火焰光度检测器氮磷检测器 3 1 6气相色谱定性与定量分析 定性与定量分析 定性分析气相色谱本身不具备鉴定功能 定性分析的主要依据是保留值 气相或液相操作中 当仪器的操作条件保持不变时 任一物质的色谱峰总是在色谱图上固定的位置出现 即有一定的保留值 这给定性分析带来一定难度 气相色谱与质谱 光谱等联用 既充分利用色谱的高效分离能力 又利用了质谱 光谱的高鉴别能力 加上运用计算机对数据的快速处理和检索 为未知物的定性分析开辟了一个广阔的前景 柱温是非常重要的色谱参数 直接影响到分离效能和分析速度 定性分析 1 利用保留值的定性分析 利用已知纯物质对照定性 在一定操作条件下 任何组分都有一个确定的保留值 基于这一特征 样品和纯物质保留值的直接比对可以作为定性的依据 如果样品较复杂 可在未知混合物中加入已知纯物质 通过未知物中峰的变化 来确定未知物中成分 利用保留值的经验规律定性 实验证明 在一定柱温下 同系物的保留值对数与分子中的碳数成线性关系 即为碳数规律 在同一族的具有相同碳数的异构体的保留值对数与其沸点成线性关系 即为沸点规律 利用相对保留值定性 利用保留值定性 样品和纯物质的分析条件必须一致 只要保持柱温 固定液不变 即使载气流速等条件有所变化 也不会影响相对保留值 因此 利用相对保留值定性比直接用保留值定性更为方便 可靠 3 1 6气相色谱定性与定量分析 利用保留指数定性保留指数又称Kovats指数 是一种重现性较其他保留数据都好的定性参数 可根据所用固定相和柱温直接与文献值对照 而不需标准样品 双柱 多柱定性不同物质在同一色谱柱上可能具有相同的保留值 用两根或多根不同极性的色谱柱进行分析 考察样品的纯物质保留值的变化作为定性依据 2 与其它方法结合定性气相色谱与质谱 光谱 核磁共振等仪器 以及利用化学方法配合进行未知组分定性 在确定未知化合物结构时是非常有效的途径 3 1 6气相色谱定性与定量分析 定量分析在气相色谱法中的定量分析就是根据色谱峰的峰高或峰面积来计算样品中各组分的含量 常用的定量方法有标准曲线法 外标法 面积归一化法和内标法 3 1 6气相色谱定性与定量分析 1 外标法已知浓度的标准样品与待测样品在完全相同的条件下进行色谱分析 以两者的峰高或峰面积的比较计算样品的含量 有直接对比法和标准曲线法 直接对比法是待测样品与标准样品的峰值直接比较计算样品含量 标准曲线法以标准样品作浓度与峰值关系图 然后根据测得的待测样品峰值从峰值 浓度关系曲线图查浓度 外标法较为简便 不需要校正因子 但进样量要求十分准确 操作条件也需严格控制 3 1 6气相色谱定性与定量分析 3 1 6气相色谱定性与定量分析 3 1 6气相色谱定性与定量分析 3 1 6气相色谱定性与定量分析 3 2高效液相色谱技术 高效液相色谱法原理及分析 液相色谱法的基本原理 液相色谱的分类 定量分析方法 概述高效液相色谱是利用溶质在两相间分配系数 亲和力 吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离 色谱法是一种分离技术 混合物分离过程 试样中各组分在色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配 一相固定不动 称为固定相 另一相是携带试样混合物流过固定相的液体 称为流动相 3 2 1高效液相色谱原理 当混合物进入色谱柱后 就在固定相 流动相之间不断地进行分配平衡 不同的化合物 分子结构不同 理化性质不同 所以在两相中存在的浓度也各不相同 固定相中存在量多的化合物 冲洗出柱子的时间就长 反之则短 这与分配系数K有关 K值小 先流出柱子 K值大的 保留作用强 后流出柱子 3 2 2高效液相色谱原理 3 2 3高效液相色谱分类 按流动相和固定相特征分为正相色谱 反相色谱按分离目的分为分析型 制备型按分离机理分为吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 凝胶色谱等 3 2 3高效液相色谱分类 1 吸附色谱法 固定相 吸附活性强弱不等的吸附剂 硅胶 氧化铝 聚酸胶 等 流动相 各种极性的洗脱剂 用途 非极性溶剂中 具有中等相对分子质量且为非离子型的试样 特别适用于分离异构体 分离原理 物质在固定相上的吸附作用不同 2 分配色谱法 原理 根据各待测物在互不相溶的两溶液中的溶解度不同 因而具有不同的分配系数 在色谱柱中 随着流动相的移动 这种分配平衡需进行多次 造成各待测物的迁移速率不同 从而实现分离的过程 流动相 HPLC分析中 为防止固定相的流失 流动相与固定液应尽量不互溶 或者说二者的极性相差越大越好 因此 根据流动相与固定相极性的差别程度 可将液液色谱分为正相分配色谱 流动相极性小于固定相极性 极性小的先流出 适于极性组分分离 和反相分配色谱 流动相极性大于固定相极性 极性大的先流出 适于非极性组分分离 3 2 3高效液相色谱分类 2 分配色谱法 固定相 原则上 用于气象色谱的固定相也可用于高效液相色谱作固定相 但高效液相色谱固定液易流失 因此常用的只有几种 按极性由高到低为 3 3 氧二丙腈 ODPN 聚乙二醇 PEM 三甲撑二醇 TMG 十八烷 C18 角鲨烷 SQ 3 2 3高效液相色谱分类 2 1正相分配色谱法 固定相 极性的有机基团 CN NH2 双羟基等键合在硅胶表面流动相 非极性或极性小的溶剂 如正已烷 中加入适量极性溶剂 如氯仿 醇等 分离机理 范德华力 诱导力或氢键力用途 多用于分离极性或中等极性化合物 正相分配色谱 固定相极性大于流动相 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是 正己烷 乙醚 乙酸乙酯 异丙醇 3 2 3高效液相色谱分类 2 2反相分配色谱法 反相分配色谱 固定相极性小于流动相 固定相 采用极性较小的键合固定相 如硅胶 C18H37 ODS C18 硅胶 苯基等 流动相 采用极性较强的溶剂 如甲醇 乙睛 水 水和无机盐的缓冲溶液等 3 2 3高效液相色谱分类 2 2反相分配色谱法 分离机理 疏溶剂作用理论 用途 主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下 H2O 甲醇 乙腈 乙醇 丙醇 异丙醇 四氢呋喃 3 2 3高效液相色谱分类 3 离子交换色谱法 原理 不同待测离子对固定相亲和力的差别 固定相 基质 合成树脂 聚苯乙烯 纤维素和硅胶表面键合离子 阳离子和阴离子交换树脂 流动相 一定pH和盐浓度的缓冲溶液 用途 适用无机离子 有机离子混合物的分离例如氨基酸 核酸 蛋白质等生物大分子 3 2 3高效液相色谱分类 4 凝胶色谱法 又称尺寸排阻色谱法 原理 利用被测组分分子大小不同 在固定相上选择性渗透实现分离 固定相 化学惰性的多孔性材料 如聚苯乙烯凝胶 亲水凝胶 无机多孔材料 流动相 作用不是为了控制分离 而是为了溶解样品或减小流动相粘度 常用流动相 四氢呋喃 甲苯 氯仿 二甲基酸胺和水 3 2 3高效液相色谱分类 4 凝胶色谱法 又称尺寸排阻色谱法 凝胶过滤色谱 以水或缓冲液作流动相主要适合于水溶性高分子的分离凝胶渗透色谱 以有机溶剂作流动相主要适合于脂溶性高分子的分离 用途 特点 固定相与分子间作用力趋于零 柱寿命长相对分子质量差别必须大于10 才能分离 3 2 3高效液相色谱分类 4 凝胶色谱法 又称尺寸排阻色谱法 凝胶的种类很多 按其原料来源可分为有机胶和无机胶 按其制备的方法又可分为均匀 半均匀和非均匀三种凝胶 根据凝胶的强度又可分为软胶 半硬胶和硬胶三大类 根据它对溶剂的适用范围又可分为亲水性 亲油性和两性凝胶等等 按分离机理分为吸附色谱法 分配色谱法 离子色谱法和凝胶色谱法四大类 其实有些液相方法并不能简单的归于这四类 如下表所示 3 2 3高效液相色谱分类 3 2 3高效液相色谱分类 3 2 4高效液相色谱仪简介 HPLC仪器包括 高压输液系统 储液罐 吸滤器 高压输液泵 脱气装置及梯度洗脱装置进样系统 进样器 进样阀分离系统 色谱柱 恒温箱检测系统 检测器记录系统 记录装置 色谱工作站 3 2 4高效液相色谱仪简介 液相色谱仪 3 2 4高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪流程图 3 2 4高效液相色谱仪简介 分析前 选择适当的色谱柱和流动相 开泵 冲洗柱子 待柱子达到平衡而且基线平直后 用微量注射器把样品注入进样口 流动相把试样带入色谱柱进行分离 分离后的组分依次流入检测器的流通池 最后和洗脱液一起排入流出物收集器 当有样品组分流过流通池时 检测器把组分浓度转变成电信号 经过放大 用记录器记录下来就得到色谱图 色谱图是定性 定量和评价柱效高低的依据 3 2 4高效液相色谱仪简介 高压输液系统 1 贮液器 由玻璃 不锈钢或氟塑料制成 容量为1到2L 用来贮存足够数量 符合要求的流动相 2 脱气 超声波脱气或真空加热脱气 溶剂通过脱气器中的脱气膜 相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去 气泡会影响检测 3 高压泵 对输液泵的要求 输出压力高 流量范围大 流量恒定 无脉动 流量精度和重复性为0 5 左右 此外 还应耐腐蚀 密封性好 3 2 4高效液相色谱仪简介 高压输液系统 输液泵种类 恒压型和恒流型恒压泵 类似于风箱 可迅速获得高压 适于柱的匀浆填充 但因泵腔体积大 在往复推动时 会引起脉动 且输出流量随色谱系统阻力 主要是柱填充物 变化而变化 现已较少使用 恒流型溶剂流量恒定 与柱填充情况无关 使用较多 有机械注射式和机械往复式两种 应用最多的是机械往复式恒流泵 见下图 每分钟往复25 100次 因此脉动小 对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰 此时可连接一脉动阻尼器 3 2 4高效液相色谱仪简介 高压输液系统 3 2 4高效液相色谱仪简介 高压输液系统 4 梯度淋洗装置 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例 从而使流动相的强度 极性 pH值或离子强度相应地变化 达到提高分离效果 缩短分析时间的目的 梯度洗脱装置分为两类 外梯度装置和内梯度装置 3 2 4高效液相色谱仪简介 高压输液系统 一类是外梯度装置 又称低压梯度 流动相在常温常压下混合 用高压泵压至柱系统 仅需一台泵即可 另一类是内梯度装置 又称高压梯度 将两种溶剂分别用泵增压后 按电器部件设置的程序 注入梯度混合室混合 再输至柱系统 3 2 4高效液相色谱仪简介 高压输液系统 梯度洗脱可提高分离度 缩短分离时间 降低最小检测量和提高分离精度 但在使用中 梯度洗脱也有许多与等度洗脱不同的地方需要注意 梯度洗脱时应注意 1 注意各溶剂间的互溶性 2 对溶剂的纯度要求更高 影响重现性 3 注意梯度变化时系统压力的变化 防止超出限度 4 梯度结束后 用初始流动相冲洗 使柱子平衡一段时间 再生 使系统回复到初始状态 梯度周期 3 2 4高效液相色谱仪简介 高压输液系统 5 低压梯度要注意脱气 混合后容易产生气泡 6 容易出现鬼峰 应作空白试验 7 梯度选择时尽量几相之间相变化要小 否则不易平衡 8 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器 如紫外吸收检测器或荧光检测器 而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器 如示差折光检测器 9 要注意水相中盐的浓度 防止在有机相提升过程中盐的析出 3 2 4高效液相色谱仪简介 进样系统 与GC相比 HPLC柱要短得多 因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些 即 HPLC的展宽多因一些柱外因素引起 这些因素包括 进样系统 连接管道及检测器的死体积 进样装置包括两种 1 隔膜注射进样 使用微量注射器进样 装置简单 死体积小 但进样量小且重现性差 2 高压进样阀 目前最常用的为六通阀 由于进样量可由样品管控制 因此进样准确 重复性好 如图 3 2 4高效液相色谱仪简介 进样系统 3 2 4高效液相色谱仪简介 分离系统 色谱柱 组成 精密管径的不锈钢管 填料 柱接头要求 柱管内壁非常光滑 柱接头设计要保证系统中引入最小死体积 柱前 柱后 能密封高压液体 两端加过滤片 柱体为直形不锈钢管 内径1 6mm 柱长5 40cm 减小填料粒度和柱径以提高柱效 分离系统 色谱柱 柱效的影响因素 填料的颗粒度及其均匀性 柱长 填装的方法与技巧常用 内径2 5mm 4 6mm 柱效一定时 柱长与颗粒度成正比例如 颗粒度5 10um 柱长15 30cm颗粒度3 5um 柱长7 5 15cm 检测系统 在液相色谱中 有两种类型的检测器一类是溶质性检测器 选择型 它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应 属于此类检测器的有紫外 荧光 电化学检测器等 另一类是总体检测器 通用型 它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应 属于此类检测器有示差折光检测器等 功能 连续地将色谱柱中流出的组分随时间变化的情况 转变成大小不同的电信号输入到记录仪中 得到色谱图 检测系统 检测器的性能指标一个理想检测器 必须具备下列条件 灵敏度高 不受温度及流动相流速变化的影响 响应随组分量的变化而线性地变化 稳定性好 操作方便 衡量指标 灵敏度S R Q 噪音 在没有样品情况下 检测器输出的最大振幅 温度 流量 泵 漂移 检测器在一段时间内 基线随时间的增加而产生的偏离 电压 流动相 最小检测限 样品产生两倍于噪音信号时的浓度 检测下限 线性范围 检测信号呈线性变化时 最大和最小进样量之比 检测系统 紫外检测器应用最广 对大部分有机化合物有响应 特点灵敏度高 线性范围宽 流通池可做得很小 1mm 10mm 容积8 L 对流动相的流速和温度变化不敏感 光源 氘灯 和钨灯 波长可选 波长范围 200 400nm常用波长254nm 280nm可用于梯度洗脱 氘灯 光栅 流通池 参比发光二极管 测量光电二极管