「饱和硫酸铵纯化」.doc

饱和硫酸铵纯化血清中抗体1 实验原理此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。2 实验试剂与器材2.1 实验试剂：硫酸铵、氨水、盐酸、1XPBS溶液（PH7.4）、2% NaHCO3 、1mmol/LEDTA(PH8.0)、1mol/LNaOH、氯化钡、蒸馏水2.2 实验器材：磁力搅拌器、低温离心机、4冰箱、PH计、离心管、锥形瓶、搅拌棒、量筒、烧杯、漏斗、移液器、电磁炉、铝锅、剪刀、试剂瓶、透析袋夹子2.3 样品 抗血清3 实验步骤3.1 配制溶液3.1.1 配制饱和硫酸铵溶液，25时饱和溶解度是767g/L，0时为676g/L(见附表)。配制1000ml饱和硫酸铵，将800g左右的硫酸铵加入到1L水中，加热搅拌到大部分固体溶解，趁热过滤并室温冷却，仍会有晶体析出，再用氨水调节PH至8.5，4保存备用（可以根据所需量按比例调整所配溶液量）。3.1.2 配制1XPBS溶液（PH7.4）取1.44gNa2HPO4（或3.63gNaHPO4.12H2O），0.24gKH2PO4，8gNaCl，0.2gKCl，加入800ml水中，用盐酸调PH至7.4，补蒸馏水至1000ml，高压蒸汽灭菌。4保存。3.1.3 配制2% NaHCO3，2g NaHCO3加入到100ml蒸馏水中。3.1.4 配制1mol/LNaOH，4gNaOH慢慢加入80ml蒸馏水中，边加入边搅拌，完全溶解后定容至100ml，室温保存，无需除菌。注意放热反应，塑料烧杯储存。3.1.5 配制1mmol/LEDTA(PH8.0)， 先配储存液：EDTA(0.5mol/L)：Na2EDTA2H2O 37.2g +20g NaOH 配成大约80ml溶液（注：液体+粉末混合体积会增加），再用NaOH溶液调节PH为8.0，定容至100ml，可以在水浴50中溶解。临用前稀释至1mmol/L。3.2 透析袋处理3.2.1 将透析管剪适当长度（20-30cm），即形成透析袋。3.2.2 在2%（m/V）NaHCO3和1mmol/LEDTA(PH8.0)中将透析袋煮沸10min。3.2.3 将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。3.2.4 将透析袋置于1mmol/LEDTA(PH8.0)中将透析袋煮沸10min。3.2.5 将透析袋冷却，4存放备用，应确保透析袋始终浸没在液体中。3.3 沉淀（此步在4下进行）3.3.1 抗血清离心去除细胞碎片，保留上清液测定体积，并加入等体积PBS溶液（PH 7.4）稀释。3.3.2 边搅拌便逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋白充分沉淀。3.3.3 搅拌均匀后4静置1h，10000rpm/min离心20min，弃上清取沉淀。3.3.4 PBS溶液（PH 7.4）溶解沉淀。3.3.5 继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液（饱和度达33%），搅拌均匀。3.3.6 4静置1h，10000rpm/min离心20min，弃上清取沉淀。3.3.7 PBS溶液（PH 7.4）溶解沉淀。3.3.8 重复以上步骤3次或进行亲和层析纯化，以得到纯度较高的产品。3.4 透析 （此步在4下进行）3.4.1 取出备用的透析袋，用蒸馏水彻底漂洗干净。3.4.2 一端封闭，检查有无漏液，如无漏液，将上一步制备的蛋白溶液转入透析袋中，用透析袋夹子最后封闭末端开口。3.4.3 在PH7.4的1XPBS中透析12-24h（1:20），每3-6h换一次透析液，以彻底去除硫酸铵。检测硫酸铵去除是否彻底，可取少量样品加入10%氯化钡，如检测不到沉淀，即透析完毕。3.5 保存分装到合适的离心管中，即时用可4保存，备用-20保存。硫酸铵饱和度的常用表1调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25）硫整硫酸铵终浓度,%饱和度10202530333540455055606570758090100每1升溶液加固体硫酸铵的克数硫酸铵初浓度，%饱和度05611414417619620924327731335139043047251656166276710578611813715018321625128832636540644949459269420295978911231551902252623003403824245206192530496193125158193230267307348390485583301930629412716219823527331435644954633124374107142177214252292333426522353163941291642002381783194115064031639713216820524528537546945326599134171210250339431503366101137176214302392553367103141179264353603469105143227314653470107190275703572153237753611519880771579079 在25下，硫酸铵溶液由初浓度调到终浓度时，每升溶液所加固体硫酸铵的克数。2调整硫酸铵溶液饱和度计算表（0）在 0 硫 酸 铵 终 浓 度，% 饱 和 度硫 酸 铵 初 浓 度 ， 饱 和 度20253035404550556065707580859095100每 100ml 溶 液 加 固 体 硫 酸 铵 的 克 数010.613.416.419.422.625.829.132.636.139.843.647.651.655.960.365.069.757.910.813.716.619.722.926.229.633.136.840.544.448.452.657.061.566.2105.38.110.913.916.920.023.326.630.133.737.441.245.249.353.658.162.7152.65.48.211.114.117.220.423.727.130.634.338.142.046.050.354.759.22002.75.58.311.314.317.520.724.127.631.234.938.742.746.951.255.7250 2.75.68.411.514.617.921.124.528.031.735.539.543.647.852.23002.85.68.611.714.818.121.424.928.532.336.240.244.548.83502.85.78.711.815.118.421.825.429.132.936.941.045.34002.95.88.912.015.318.722.225.829.633.537.641.84502.95.99.012.315.619.022.626.330.234.238.35003.06.09.212.515.919.423.026.830.834.85503.06.19.312.716.119.723.527.331.360