禽流感核酸检测试剂(通用型)技术性能评估(华农)20121211.docx

一实验内容：试剂盒亚型覆盖和特异性实验测试实验样本：猪流感H1N1病毒、甲型H1N1流感病毒、H3亚型病毒、H5N2病毒、H5N1（不确定分支）、H5N1（2.3.2a分支）、H5N1（2.3.2b分支）、H5N1（2.3.2c分支）、H5N1（2.3.4分支）、H5N1（7分支）、H6亚型病毒、H7N9病毒、H9N2病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒。样本标号样本标号猪流感H1N1病毒1H5N1（2.3.4分支）9甲型H1N1流感病毒2H5N1（7分支）10H3亚型病毒3H6亚型病毒11H5N2病毒4H7N9病毒12H5N1（不确定分支）5H9N2病毒13H5N1（2.3.2a分支）6传染性法氏囊病毒14H5N1（2.3.2b分支）7传染性支气管炎病毒15H5N1（2.3.2c分支）8新城疫病毒16试剂盒：名称批号数量禽流感病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒201311051实验方法：1. 分别抽提各个病毒的RNA（按提取说明书操作）。2. 分别配制禽流感通用型、H5亚型、H7亚型、H9亚型的反应液。3. 上机检测（ABI7500）禽流感通用型反应液检测1-16号样本；禽流感H5亚型反应液检测4-16号样本；禽流感H7亚型反应液检测6-9，12-15号样本；禽流感H9亚型反应液检测6-9，12-15号样本；实验结果：禽流感通用型检测结果样本CT值样本CT值猪流感H1N1病毒8.95H5N1（7分支）9.72甲型H1N1流感病毒11.75H6亚型病毒12.05H3亚型病毒10.67H7N9病毒6.88H5N2病毒7.47H9N2病毒7.35H5N1（不确定分支）6.19传染性法氏囊病毒无H5N1（2.3.2a分支）10.36传染性支气管炎病毒无H5N1（2.3.2b分支）14.13阳性对照17.25H5N1（2.3.2c分支）13.46阴性对照无H5N1（2.3.4分支）8.84实验结论：禽流感病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒能够覆盖H1N1病毒、甲型H1N1流感病毒、H3亚型病毒、H5N2病毒、H5N1（不确定分支）、H5N1（2.3.2a分支）、H5N1（2.3.2b分支）、H5N1（2.3.2c分支）、H5N1（2.3.4分支）、H5N1（7分支）、H6亚型病毒、H7N9病毒、H9N2病毒。并与传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒不存在交叉反应，特异性良好。二实验内容：试剂盒精密度测试样本：H7N9样本（10-3，10-5稀释），H5N2（10-3，10-5稀释），H9N2（10-3，10-5稀释）。试剂盒： 名称批号数量禽流感病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒201311031201311041201311051201311131201311141实验方法：每批次试剂盒分别检测相应病毒的高低两个浓度（10-3，10-5稀释），每个批次试剂至少做6个平行孔，至少做三个批次。根据每个孔的CT值算出批内变异系数与指间变异系数（CV,%）。实验结果：禽流感病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒H7N9样本10-3稀释H7N9样本10-5稀释批次201312032013120420131205201312032013120420131205CT值18.2518.218.0924.4625.425.3818.2518.5318.2924.7424.9825.3418.1618.3618.1625.1725.3125.0418.3118.2418.2524.2825.0625.118.1118.1218.1425.2324.5925.0317.9618.2718.1725.4524.625.26平均值18.1718.2918.1824.8924.9925.19标准差0.120.140.0730.460.340.15变异系数0.00690.00780.00400.0180.0130.0061从实验结果可以看出禽流感病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒检测高浓度的批内变异系数平均为0.62%,批间变异系数为0.67%.低浓度的批内变异系数平均为1.29%,批间变异系数为1.40%。总体变异系数均小于5%，有较好的精密度。三灵敏度实验样本：H7N9样本（9.1ng/L），H5N2（5 ng/L），H9N2（9.2 ng/L）。试剂盒： 名称批号数量禽流感病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒201311031201311041201311051201311131201311141实验方法：1. 每批次试剂盒分别检测相应病毒样本的低浓度核酸（原始样本稀释107倍），每个批次至少做8个重复孔，至少重复三批试剂。计算每个试剂盒对相应样本浓度的检测阳性率是否达到95%。该核酸浓度可做为该试剂盒的分析灵敏度。实验结果：1. 禽流感病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒检测结果：禽流感病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒检测结果样本类型H7N9核酸浓度0.91fg/ml批次201312032013120420131205CT30.9130.9330.7130.7530.3730.8330.4430.4430.7629.5530.0629.8529.9828.8329.5629.3329.229.429.3829.328.8728.2128.4528.41从实验结果可以看出禽流感病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒对核酸浓度为0.91fg/ml的阳性样本的检测阳性率达到100%,该试剂盒的分析灵敏度可以达到0.91fg/ml。综上所述：1. 禽流感病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒性能评估如下：特异性：对禽流感病毒阳性参考品进行测定，结果为阳性。检测一定数量的不含被测物的样本，结果为阴性。检测可能引起非特异反应的样本，如传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、新城疫病毒，结果为阴性。亚型覆盖：检测国内常见的亚型样本如猪流感H1N1病毒、甲型H1N1流感病毒、H3亚型病毒、H5N2病毒、H5N1（不确定分支）、H5N1（2.3.2a分支）、H5N1（2.3.2b分支）、H5N1（2.3.2c分支）、H5N1（2.3.4分支）、H5N1（7分支）、H6亚型病毒、H7N9病毒、H9N2病毒，结果均为阳性。测量精密度：检测高浓度的批内变异系数平