PAMAM的合成及在生物医药领域中的应用.doc

PAMAM的合成及在生物医药领域中的应用林晓娟，叶亚平*，（北京科技大学应用科学学院，北京100083）摘要: 聚酰胺胺(PAMAM) 树状大分子是一类新型纳米生物材料,这类分子可通过有机合成的方法精确控制分子的结构和相对分子质量。其独特的分子结构使之在许多领域获得广泛应用。本文着重介绍了PAMAM树状大分子的合成和在生物医学方面的应用。关键词：:聚酰胺胺，树状大分子，药物载体1概述PAMAM是Poly (amide amine) 的缩写，是最早合成的树枝形聚合物之一1。其相对分子质量可被严格控制，呈单分散性，内部具有空腔，可以包裹药物分子，PAMAM 树枝状高分子高浓度的末端官能团能与许多有机、无机、生物物质等发生化学反应。通过修饰引进阴离子、阳离子及疏水基团，从而提高生物相容性、生物利用度和靶向性。很多弱酸性难溶性药物有一定的毒性和刺激性且难溶于水，传统的制剂在减小剂量、维持血药浓度以及有效到达靶部位之间存在着矛盾。PAMAM 载体对弱酸性难溶性药物具有增溶和包合作用。这些特点使之有希望成为新一代药物载体。本文着重介绍PAMAM的合成及在生物医药方面的应用11 PAMAM的基本结构聚酰胺胺类树枝形聚合物制备，一般是可以由氨或二胺为引发核与CH2CH2CONHCH2CH2N为重复单元合成得到，若以乙二胺为中心核，其结构如图1-1所示 图1-1 以乙二胺为核的4.0GPAMAM的结构示意图12 以乙二胺为核的理想PAMAM分子的性质：以乙二胺为核的010代PAMAM树枝形聚合物的理想特征如下表所示：表1-1 以乙二胺为核的氨端基PAMAM树枝形聚合物的分子特征分子代数理论分子式端基数理论相对分子质量分子直径(nm)0C2H8N22601C22H48O10N445171.42C62H128O58N12814301.93C142H288O58N281632562.64C302H608O122N603269093.65C622H1248O250N12464142154.46C1262H2528O506N252128288265.77C2542H5088O1018N508256580487.28C5102H10208O2042N10205121164938.89C10222H20448O4090N204410242333839.810C20462H40928O8186N4092204846716211.4图1-2是PAMAM树枝状大分子的分子直径、分子量、末端官能团数以及表面官能团密度随代数的变化关系。由图可以看出，PAMAM树枝状大分子的分子量和外围官能团数目随着代数的增加按指数增长，但其直径却随着代数的增加大致呈线性增长。每增加一代就在聚合物上添加一层，记着G0G10表面胺基团数倍增，直径按10nm增加，即从G0到G10的直径范围10130nm，但其表面官能团数目却由2代的8个增加到10代的4096个。低层数的G0G4呈平面的椭圆形，高层树分子G4G10因树枝状压缩呈球形，从G4代开始，内部形成疏水区可包被复合物，发挥药物运输或其他潜在功能。2. PAMAM的合成PAMAM合成采用扩散法，即从引发核开始合成。亲核引发核一般为氨、乙二胺等。其合成路线主要有两步：1）用合适的核（氨或乙二胺）与丙烯酸甲酯进行Michael加成反应得到半代数的PAMAM树枝状分子（G0.5,1.5,2.5,）4；2）用半代数分子与过量的乙二胺进行酯基的酰胺化反应得到整代数树枝状分子（G1.0,2.0,3.0,）。Michael加成反应在室温下反应迅速，具有很高的选择性，不会出现酰胺化反应；第二步的酰胺化反应，在室温下反应，且反应温度不易过高，否则会发生“桥联”5，如图1-3所示。两步反应都有很高的产率，在最佳的反应条件下，产率可以达到98100%，几乎是定量聚合。这种分子比其它树枝状分子有很多特殊的优点，如良好的生物相容性，在体内可降解等，在生物医学领域引起了广泛地关注。理想生长 非理想生长图1-3 合成PAMAM过程中的生长情况3 PAMAM在生物医学领域的应用31 树枝状大分子用于DNA传递和基因治疗在生理条件下，PAMAM树枝状大分子末端的胺基完全质子化成为带正电荷的铵基正离子。所以大分子的表面有很高的正电荷密度，能与DNA分子主链上带负电的磷酸基团发生静电相互作用，形成复合物。该复合物可将负载在上面的基因片断载入细胞核，使基因片断上的遗传信息得以表达，这在DNA传递和基因治疗领域具有重要的意义。采用这种手段介导DNA片断，除了可在体内或体外获得高水平的DNA转运效率外，还具有一系列优良特性。首先，树枝状大分子/DNA复合物具有很好的稳定性和溶解性，在水溶液中可稳定存在几周；其次，可大大提高DNA转染效率；另外还可以延长DNA在体内的存留时间6。与传统的阳离子脂载体系统介导的转染技术相比，核酸分子（反义核苷酸、反义cDNA质粒与表达质粒等）与树枝状大分子的复合物可在体外转染大量不同的真核细胞，并且具有普遍的高效性。树枝状大分子携带基因材料穿透细胞膜的能力已经被应用于寡核苷酸的狭管效应，这种效应可以抑制m-RNA复制蛋白质。A.Bielinska等研究了PAMAM树枝状大分子在体外转运反义寡核苷酸和反义表达质粒的能力，该转运系统可用于基因表达的定向调制7。树枝状大分子可通过静电相互作用连接到各种形式的核酸上，这种树枝状大分子/DNA复合物能够转移寡核苷酸和质粒DNA，从而具有调节反义抑制的功能。将磷酸二酯寡核苷酸连接到树枝状大分子上以后延长了它们在细胞内的存在时间，这说明树枝状大分子作为载体能够有效地引进调节核酸，并且能抑制特异性基因的表达。32 树枝状大分子在BNCT（硼中子捕获治疗技术）中的应用PAMAM树枝状大分子另一个潜在的应用领域是硼中子捕捉治疗技术。硼中子捕获疗法提供了一种定位破坏肿瘤细胞的潜在方法。它以同位素10B被低能热中子照射产生粒子4He和7Li原子核为基础，10B同位素物质对热中子有格外高的捕捉能力，这种热中子能产生短程的辐射能量。如果足够量的10B原子能够被选择转移进入癌细胞或者与癌细胞结合，那么这些癌细胞就会被10B原子捕获的热中子辐射毁坏，而健康细胞不受损伤。采用这种技术可以在肌体不受侵害的情况下治疗一些不治的癌症。树枝状大分子通过特定的表面修饰后，可以运载大量的10B原子，所以成为该种技术中一种理想的候选材料。1994年，Newcome等人合成了第一种含硼的树枝状大分子。尽管这些树枝状大分子每个分子有共价结合120个硼原子的能力，但是发现它们不能对癌细胞进行识别。最近，Moroder等8人报道合成了一种赖氨酸树突，结构分析表明这些树突含有8个20面的dedeca-o-carboranes（如图1-4），整个分子中共有80个硼原子。分子中的硫基可用来结合能识别癌细胞的抗体片断。对该化合物的活体测试取得了令人鼓舞的结果。图1-4带有大量硼原子的赖氨酸树突的结构示意图33 树枝状大分子用作医学上的造影剂树枝状大分子的另一个应用就是作为造影剂用在磁共振成像方法（MRI）中，这种方法可用于器官、血管、组织的造影定位。这种方法的物理依据是通过在一个确定的非均匀磁场下对体内水的质子核磁共振信号进行测量，来定位水信号的来源。当要描述单个器官或血管时，还需使用对比试剂。重金属离子的顺磁络合体由于偶极-偶极相互作用，可以使质子更快地释放，可用于对比试剂。用对比试剂渲染的区域就可以被非常精确地识别和定位。目前在临床上用小分子和钆形成的络合物来定位血管有很大的缺点，因为这些物质注射进入血管后立刻扩散到血管外，结果起不到对比渲染的作用。而一般的大分子与钆形成的络合物，由于在体内无法通过肾排除干净，所以一直无法应用于临床。Wiener等人发现，采用树枝状结构的对比试剂可以大大增加这些物质在血管里的停留时间，并且能够被肾彻底排除，所以这类结构的对比试剂可以作为理想的定位血管等组织的对比试剂。例如，他们将叶酸连接到以氨为核的第四代胺基中止的PAMAM树枝状大分子上，再将其与2-(4-异硫氰酸根苄基)-6-甲基二亚乙基三胺五乙酸反应生成螯合物f-PAMAM-TU-DTPA。研究结果表明，细胞在受体特异性的方式下可以结合树枝状大分子的叶酸盐，这说明将树枝状大分子的叶酸盐作为磁共振成像的造影剂是一种很有前途的定位肿瘤的新方法9。A.G.Schering制备了一种可以连接24个钆金属原子的赖氨酸树枝状大分子/钆络合物，这类络合物表现出很好的成像效果，已经用于临床研究。在2001年12月的自然生物技术（Nature Biotechnology）杂志上，约翰霍普金斯大学的J.Bulte等10发表文章说，被磁化标记的树枝状纳米分子可以用来跟踪被移植到活鼠脑内的干细胞。他们合成了连有氧化铁分子的树枝状大分子，并将它们放进含有由干细胞培养出的脑细胞的培养液中，磁化的树枝状大分子被脑细胞吸收，接着将这些脑细胞注射进老鼠的脑内。运用磁共振成像来探测树枝状大分子中的氧化铁，研究者能够追踪被移植脑细胞的位置，从而观察到它们何时在大脑中生成新的组织。34 树枝状大分子用作药物载体作为药物载体，树枝状大分子比其它药物分子有着明显的结构优势。首先，它的表面连有大量的官能团，经过修饰可以连接大量药物分子；其次，高代的树枝状大分子在空间呈球状分布，内部存在着较大的孔腔，这些孔腔里可以包埋药物分子。这些结构特点使树枝状大分子的载药量大大提高。如果在表面官能团上连接具有药物靶向引导功能的基团，树枝状大分子还可以用于药物的靶向控释。而且树枝状大分子的粒径一般在10nm左右，所以在实现药物释放的同时不会造成血栓的形成。 PAMAM树状大分子是聚电解质。在水中末端基的一级胺和内腔中的三级胺均可质子化,质子化的程度取决于溶液的pH。聚电解质的质子化强烈地影响其构象。Chen 等人11 用荧光光谱法研究了6.0G PAMAM树状大分子与探针分子DNS(52二甲胺基212萘酚磺酸) 结合的机理。发现在带正电荷的树状大分子与带负电的DNS 之间是靠静电作用结合的。PAMAM树状大分子的酸性解离一级常数、二级常数分别为pKa1 = 10 和pKa2 = 415。当pH 10 时,PAMAM表面的一级胺很少被质子化。因而不易发生静电作用。随着pH 降低,一级胺的表面开始质子化,到pH 为8.3 时,三级胺也开始质子化。因此,在5.5 pH 10 时,PAMAM树状大分子与DNS 发生静电结合作用。Watkins 等人12 也证明了PAMAM树状大分子在pH = 7 时,对染料nile red 的结合量最大。这与Chen 等人的研究结果是一致的。Watkins 研究小组还发现将乙二胺的亚甲基链增长到12 个碳,其包裹量将远高于乙二胺为核的树状大分子。这是由于在pH = 7 时,相连的两个带电契形物相互排斥,形成一个拉长的树状大分子。这样的结构特点特别利于更多的染料分子阴离子对亲脂性核的接近以发生静电作用。利用这种静电作用,Milhem等人13 将树状大分子用作脂溶性弱酸性药物布洛芬的增溶剂研究。发现比传统的增溶剂SDS 具有更大的增溶效果。4展望 聚酰胺胺（PAMAM）树状大分子的合成目前存在的问题是过程复杂、效率低、多数品种难以得到纯度高和量大的样品。对于发散法合成的关键是要研究更快、更有效的的分离和纯化的方法。国外对其应用的研究主要集中在基因载体、药物缓释材料、纳米复合材料、膜材料、光学材料和作用机理等方面，国内的相关研究也已经开始，但国外已经有商品化的聚酰胺胺（PAMAM）树状分子，国内还没有，这也限制了国内研究人员对其进行更广泛和深入的研究和应用。参考文献：1 梁德青,郭开华,樊栓狮,王如竹. 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