糖原合酶激酶3β和腺瘤性结肠息肉病蛋白在气道上皮细胞.pdf

生理学报 Acta Physiologica Sinica April 25 2007 59 2 197 203 197 研究论文 Received 2006 11 23 Accepted 2006 12 27 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China No 30470757 Corresponding author Tel 86 27 83692619 Fax 86 27 83650729 E mail renliangwu 糖原合酶激酶糖原合酶激酶 3 和腺瘤性结肠息肉病蛋白在气道上皮细胞 机械损伤修复过程的时空分布 和腺瘤性结肠息肉病蛋白在气道上皮细胞 机械损伤修复过程的时空分布 朱 敏 李建莎 田 丹 马 燕 李娜萍 吴人亮 华中科技大学同济医学院病理学系 卫生部呼吸系统疾病重点实验室 武汉 430030 摘摘 要 要 为了探讨糖原合酶激酶3 glycogen synthase kinase 3 GSK3 和腺瘤性结肠息肉病 adenomatous polyposis coli APC 蛋白在气道上皮细胞 airway epithelial cells AECs 损伤和修复中的作用 我们采用机械划线损伤的方法建立体外气道 上皮损伤修复模型 采用Western blot 免疫荧光双标共聚焦成像和免疫沉淀的方法观察损伤修复过程中APC蛋白和GSK3 在AECs 中表达及分布的动态变化 结果显示 1 用Western blot 方法观察到划线损伤0 5 h 后即有GSK3 磷酸化增强 P 0 05 6 h 达到高峰 P 0 05 持续到12 h P 0 05 24 h 开始下降 而 GSK3 总量大致保持一致 2 在免疫荧光双标 共聚焦成像实验中 划线损伤0 h 组APC 蛋白主要表达于胞浆 而划线损伤6 h 后 APC 蛋白主要聚集于损伤前沿区的迁移 活跃细胞 3 免疫共沉淀的实验结果显示 划线损伤 0 h 时GSK3 和 APC 蛋白能共同沉淀 但在划线损伤 6 h 之后 两 者发生了分离 以上结果表明 划线损伤后 AECs 立即启动修复过程 此时 GSK3 的活性被抑制 促使 APC 蛋白游离 出来 游离出来的APC 蛋白则与微管正极结合 增加了微管的稳定性 从而调节细胞骨架运动 促进气道上皮的损伤修复 关键词 关键词 糖原合酶激酶 3 腺瘤性结肠息肉病蛋白 气道上皮细胞 损伤修复 中图分类号 中图分类号 R322 3 Spatial temporal distribution of glycogen synthase kinase 3 and adenomatous polyposis coli protein are involved in the injury and repair of airway epithelial cells induced by scratching ZHU Min LI Jian Sha TIAN Dan MA Yan LI Na Ping WU Ren Liang Department of Pathology Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology and Key Laboratory of Pulmonary Disease of Ministry of Health of China Wuhan 430030 China Abstract To investigate the roles of glycogen synthase kinase 3 GSK3 and adenomatous polyposis coli APC protein in wound repair of airway epithelial cells AECs we established a wound model of airway epithelium in vitro Then the following tests were undertaken 1 Western blot was used to detect the levels of total GSK3 and phosphorylated GSK3 in human bronchial epithelial 16HBE cells 2 The localizations of APC protein was observed by using immunofluorescence technique 3 Immunoprecipitation was used to investigate the relationship between APC protein and GSK3 during the repair of 16HBE cells The results were as follows 1 The level of phosphorylated GSK3 increased 0 5 h after scratching P 0 05 reached a maximum at 6 h P 0 05 and maintained until 12 h while the total level of GSK3 remained constant 2 Results of immunofluorescence study showed that APC protein clustered with tubulin in the region of the migrating leading cells 6 h after scratching which was dissimilar with that in the cells 0 h after scratching 3 GSK3b and APC protein were immunoprecipitated and analysed on SDS PAGE We found that GSK3b and APC protein were precipitated indicating that the two proteins existed in a complex After scratching dissociation of the two proteins occurred Taken together we conclude that scratching caused a decrease in phosphorylation of GSK3 and that reduced phosphorylation of GSK3b promoted APC protein to bind to the plus ends of microtubules and stabilize the growing ends These observations suggest that APC 生理学报 Acta Physiologica Sinica April 25 2007 59 2 197 203 198 protein and GSK3 may synergistically play an important role in the repair of airway epithelium Key words glycogen synthase kinase 3 adenomatous polyposis coli protein airway epithelial cells injury and repair 多种因素 机械损伤 香烟烟雾 大气污染和 感染等 均可引起气道黏膜上皮细胞的损伤 从而 引起急性或慢性支气管炎 在损伤修复过程中 气 道上皮细胞 airway epithelial cells AECs 将会发生迁 移 分裂增生和分化 以重新覆盖受损区域 1 而损 伤周围的细胞迁移和增殖都有赖于微管及其相关蛋 白之间复杂的相互作用 2 3 近年研究 3 4 显示 腺 瘤性结肠息肉病 adenomatous polyposis coli APC 蛋 白可以通过其分子羧基末端的微管结合区域与微管 正极直接结合 调节微管组装 引发微管成束以及增 加微管稳定性 被视为一种新的微管相关蛋白 4 5 糖原合酶激酶3 glycogen synthase kinase 3 GSK3 是 一种丝氨酸 苏氨酸激酶 有 和 两种亚型 在 细胞内呈组成性激活 具有广泛的底物 参与物质 代谢 细胞增殖和细胞运动等活动 6 研究表明 GSK3 能够使多种微管相关蛋白磷酸化 减弱它们 稳定微管的能力 进而影响损伤修复中细胞迁移等 细胞活动 7 APC 蛋白为 GSK3 的底物之一 被 GSK3 磷酸化之后与微管的结合减少 不利于微管 的稳定 8 我们的前期工作显示 GSK3 在肺组织中 广泛表达 在AECs 中尤为丰富 9 并且参与吸烟 所致大鼠气道上皮损伤修复过程 10 提示GSK3 可 能在 AECs 的生长 增殖和分化等过程中发挥作 用 因此 我们通过体外机械损伤 AECs 建立气 道上皮损伤修复的模型 采用 Western blot 荧光 双标共聚焦成像和免疫沉淀方法研究AECs 损伤后 GSK3 的活性 APC 蛋白的分布变化 进一步探 讨二者在AECs 损伤修复中的可能机制 1 材料与方法材料与方法 1 1 主要试剂主要试剂 DMEM F12 1 1 和新生牛血清为 Gibco产品 蛋白酶抑制剂cocktail购自Calbiochem 公司 BCA试剂盒和增强化学发光 enhanced chemi luminescence ECL 试剂盒为Pierce公司产品 蛋白 分子量标准购自Invitrogen公司 兔抗鼠APC蛋白 多克隆抗体 兔抗鼠 GSK3 多克隆抗体 辣根过 氧化物酶 HRP 标记羊抗小鼠IgG 羊抗兔IgG 和 FITC 标记羊抗鼠 IgG 均购自 Santa Cruz 公司 抗 磷酸化GSK3 Ser 9 GSK3 兔多克隆抗体为Cell Signal Technology公司产品 TRITC标记山羊抗兔 IgG 和Hoechst 33258 购自美国Pierce 公司 鼠抗 人 tubulin单克隆抗体购自福州迈新生物公司 1 2 AECs 的培养的培养 人气道上皮细胞 human bronchial epithelial 株16HBE由广州医学院化学致癌 研究所蒋义国教授惠赠 用含10 新生小牛血清 100 U mL青霉素和100 g mL链霉素的DMEM培养 基 置于 37 5 CO2中培养 每 1 2 d 换液 一次 并以 0 25 胰蛋白酶消化传代 待培养的 细胞生长至70 90 融合状态时进行实验 每次 实验均采用同一代细胞 并用不同批次的细胞重复 实验 1 3 气道上皮损伤修复模型的建立气道上皮损伤修复模型的建立 参照Desai 等 11 的方法 用微量加样器吸头 2 L tips 在培养 的单层上皮细胞上划多条宽约300 m的 伤痕 诱导细胞的损伤修复过程 相差显微镜下可见划线 后3 h 即有细胞爬出 6 h 最为显著 24 h 时迁移 细胞基本可以掩盖划痕 1 4 Western blot 检测检测 AECs 中中 GSK3 和磷酸化 和磷酸化 GSK3 的表达 的表达 1 样本收集 取出各组处理细 胞 PBS 洗涤两遍后 0 1 胰酶 0 02 EDTA消 化 PBS洗涤 收集细胞于1 5 mL离心管中 4 000 r min 离心 3 min 弃上清 PBS 重悬沉淀 再次 离心收集细胞 尽量吸弃 PBS 加入50 60 L 冰 冷的裂解液 50 mmol L Tris HCl pH 8 0 100 mmol L NaCl 1 mmol L EDTA 1 mmol L DTT 1 Triton X 100 0 1 SDS 50 mmol L NaF 1 mmol L NaVO3 蛋白酶抑制剂 重悬细胞团 补足裂解液 至100 120 L 振荡10 s 置于冰上 10 min 然 后超声破碎细胞 60 W 3 5 次 接着12 000 g 4 离心 10 15 min 取上清分装 即为细胞总蛋 白 2 SDS PAGE 电泳及转膜 提取的蛋白样本 用 BCA 法测蛋白浓度 取等量蛋白上样 标准方 法电泳 再转移蛋白于硝酸纤维素膜上 3 免疫显 色反应 硝酸纤维素膜用含有5 脱脂奶粉的TBST 室温封闭 1 h 分别与 GSK3 1 1 000 和磷酸化 GSK3 1 500 抗体4 孵育过夜 然后将硝酸纤维 素膜置于 HRP 标记的相应二抗溶液中 室温 1 h 按照ECL试剂盒说明书进行反应 X线胶片曝光洗 199 朱 敏等 GSK3 和APC 蛋白在气道上皮细胞机械损伤修复过程的时空分布 片 胶片条带经扫描 编辑和打印 1 5 荧光双标共聚焦成像观察荧光双标共聚焦成像观察APC蛋白和b蛋白和b tubulin 在在AECs中的分布中的分布 培养于爬片上的细胞用冰PBS 漂洗后 纯甲醇 20 固定5 10 min 室温下自然 风干后 20 保存备用 或PBS洗片 加5 BSA 0 2 Triton X 100 室温下封闭30 min 吸弃封闭 液 加封闭液稀释的抗 APC 蛋白兔多克隆抗体 1 100 和抗b tubulin鼠单克隆抗体 1 100 4 过夜 PBS洗 5 min 3 次 加封闭液稀释的TRITC 激发 红色荧光 标记山羊抗兔IgG和FITC 激发绿色荧光 标记羊抗鼠IgG 室温下孵育1 h 避光 PBS洗 5 min 3 次 加PBS 稀释的1 g mL Hoechst 33258 复染15 min PBS洗2 3遍 PBS甘油 pH 9 0 封片 共聚焦显微镜 OlympusFV500 观察和拍照 APC蛋 白为细胞质出现颗粒状红色 b tubulin 阳性反应为 特异性微管纤维状绿色荧光 用Adobe Photoshop 7 0 编辑图像 打印或冲洗成像片 1 6 免疫共沉淀检测免疫共沉淀检测AECs损伤修复中损伤修复中APC蛋白和蛋白和 GSK3b 的关系b 的关系 划线损伤后0 h 和6 h 的细胞用 含有1 mmol L NaVO3的4 PBS漂洗数遍后 0 1 胰酶 0 02 EDTA 消化 PBS 洗涤 收集细胞于 1 5 mL离心管中 4 000 r min离心3 min 弃上清 然后加入70 mL 4 的nonidet P 40裂解液 10 mmol L Tris HCl pH 7 5 140 mmol L NaCl 1 mmol L orthovanadate 1 nonidet P 40 2 mmol L PMSF 10 mmol L EDTA 2 g mL PIC 4 裂解3 h 接着 12 000 g 4 离心 取上清 去掉细胞核 在上 清中加入protein A agarose 4 孵育1 h 以去除非 特异性蛋白 再分别加入特异性抗APC蛋白多克隆 抗体 抗 GSK3 多克隆抗体 4 孵育过夜 次 日再加入protein A agarose 4 继续孵育3 h 离 心收集免疫沉淀物 分别在 7 5 和 10 SDS PAGE 上电泳分析 其余步骤同Western blot 相应 步骤 1 7 数据统计数据统计 实验数据均以 mean SD 表示 采用SPSS12 0 统计分析软件进行one way ANOVA 分析 P 0 05 为有统计学差异 2 结果结果 2 1 气道损伤修复过程中气道损伤修复过程中 AECs 形态学变化形态学变化 相差显微镜下 培养的 16HBE 细胞呈现立体 的 稍微凸起的 细胞间紧密连接的 铺路石状 的典型上皮细胞形态 图 1A 在机械性损伤后 AECs 可呈片状单向迁移 其迁移方向垂直于划痕 方向 损伤 3 h 细胞形态即发生显著改变 形成 具有特征性的极化形态学改变 图 1B 损伤6 h更 为显著 图1C 损伤24 h后迁移的AECs 能掩盖划 线部分 图 1D 2 2 AECs损伤修复过程中损伤修复过程中GSK3 和磷酸化 和磷酸化GSK3 的表达变化 的表达变化 为研究 GSK3 在 AECs 损伤修复过程中的作 用 我们通过检测损伤前后磷酸化GSK3 的水平 反映 GSK3 的活性 结果显示 机械损伤 0 h 即 有基础的GSK3 磷酸化水平 损伤0 5 h 时GSK3 磷酸化开始增强 6 h达到高峰 一直持续到12 h 24 h 开始减弱 而 GSK3 总量大致保持一致 图 2 提示机械损伤能引起 GSK3 活性改变 即使 其发生抑制性磷酸化 图 1 气道损伤修复过程中上皮细胞形态学变化 Fig 1 Morphologic characteristics of airway epithelial cells After scratching the cells were observed under phase contrast microscope Cultured 16HBE cells showed a classic cobblestone epithelial morphology that was three dimensional slightly raised and closely adherent A After scratching bronchial epithelial cells moved unidirectionally as sheets or groups perpendicular to the direction of the wound and subsequently differentiated and proliferated B C The wound gap was approximately closed 24 h after scratching D Scale bar 50 m 生理学报 Acta Physiologica Sinica April 25 2007 59 2 197 203 200 2 3 AECs 损伤修复过程中损伤修复过程中 APC 蛋白的分布变化蛋白的分布变化 为探讨APC蛋白在AECs损伤修复中的作用 我 们采用荧光双标记法 分别标记APC蛋白和微管 tubulin在损伤前后的定位关系 共聚焦显微镜下观 察到 机械损伤0 h 时 APC 蛋白红色荧光颗粒在 AECs 胞质内均匀弥散分布 损伤 6 h 时 红色荧 光颗粒与绿色荧光颗粒 tubulin 主要聚集于损伤前 沿区的迁移活跃细胞 图 3 图 3 气道上皮细胞损伤修复过程中APC 蛋白的分布变化 Fig 3 Scratching induced redistribution of APC protein in the airway epithelial cells using confocal imaging Cultured 16HBE cells were grown on glass coverslips and double stained with rabbit polyclonal anti APC and anti tubulin antibodies In the confocal imaging system red or green indicated the expression of APC protein or tubulin respectively and blue denoted nuclei stained by Hoechst 33258 Scale bar 20 m 图 2 机械损伤引起气道上皮细胞中GSK3 的抑制性磷酸化 Fig 2 Scratching resulted in the inhibitory phosphorylation of GSK3 in airway epithelial cells After 16HBE cells were scratched and incubated for the indicated time whole cell lysates were subjected to Western blot analysis using antibodies specific for GSK3 phosphorylated at Ser 9 and total GSK3 n 3 P 0 05 vs 0 h by one way ANOVA 201 朱 敏等 GSK3 和APC 蛋白在气道上皮细胞机械损伤修复过程的时空分布 2 4 APC蛋白和蛋白和 GSK3 在 在 AECs损伤修复中的关系损伤修复中的关系 上述结果显示 在AECs受机械损伤后 GSK3 活性发生改变 APC蛋白的定位也发生了改变 而 APC又是GSK3 的底物之一 因此我们推测GSK3 活性可能促使APC蛋白发生了定位改变 在本实验 中 我们采用免疫沉淀方法检测二者在损伤前后的 关系 以揭示二者在 AECs 伤修复中的作用机制 免疫沉淀结果显示 细胞划线损伤0 h 时在沉淀的 GSK3 蛋白中能检测到APC 蛋白的存在 反之亦 然 说明两者能共同沉淀下来 存在于同一复合体 中 但在划线损伤 6 h 时 在沉淀的 GSK3 蛋白 中 APC 蛋白的量减少 反之亦然 提示两者在细 胞损伤后发生了分离 图4 我们在沉淀的APC 蛋 白中并没有检测到磷酸化 GSK3 这进一步说明 GSK3 的磷酸化导致了它与APC蛋白的分离 建立和维持细胞极化依赖于微管 微丝与微管 相关蛋白之间复杂的相互作用 2 3 微管正极示踪蛋 白 plus end tracking proteins 属于微管相关蛋白 包 括 APC 蛋白 EB1 end binding protein CLIP cytoplasmic linker protein 如CLIP 170 等 它们结 合于微管的正极 参与微管动力学和功能的调节 14 15 在细胞迁移过程中 微管可延伸到细胞前缘 而且 其正极面对迁移方向 从而维持迁移过程 近年研 究 8 16 显示 APC 蛋白可以通过其分子羧基末端的 微管结合区域与微管正极直接结合 在体内外均可 稳定微管 维持微管长度 GSK3 是一种丝 苏氨 酸蛋白激酶 能对细胞内外的多种刺激发生反应 其活性改变可影响细胞的生长 分化 凋亡以及迁 移等多种生命过程 17 18 同时GSK3 具有广泛的作 用底物 参与多种信号途径的调节 APC 蛋白是 GSK3 的作用底物之一 其分子结构中存在GSK3 的磷酸化位点 被GSK3 磷酸化之后与微管的结合 减少 不利于微管的稳定 可导致微管解聚 17 19 本实验结果显示 AECs 在机械损伤 0 5 h 即有 GSK3 磷酸化水平增高 表明在AECs 损伤后立即 出现GSK3 活性的抑制 损伤6 h 时GSK3 磷酸 化水平达到高峰 提示GSK3 活性达到最大程度的 抑制 此时 荧光共聚焦成像观察到 APC 蛋白在 AECs中主要与微管共同聚集于损伤前沿区域的迁移 细胞 以上结果提示AECs 受损后立即启动修复过 程 通过抑制GSK3 活性 减少对APC 蛋白的磷 酸化 从而保证 APC 蛋白与微管正极结合 APC 蛋白一般在细胞中的分布较为广泛 免疫学定位方 法已确定内源性APC蛋白可以出现在细胞的各种部 位 包括细胞浆 并且大部分在细胞膜的侧面处皮 质区 在此它主要位于微管的末端 或者位于皮质 肌丝 20 Mimori Kiyosue等 21 发现 在细胞迁移过 程中 微管主要延伸至迁移细胞的前缘 leading edge 并使其正极端对向迁移方向 我们的实验 也观察到此现象 图 3 而在细胞迁移过程中 Nathke 等 16 报道 APC 蛋白定位于细胞迁移活跃区 域 并且主要在细胞前缘质膜下微管正极末端聚集 此处亦是细胞的侧面区 在早期体内实验中 10 我 们利用荧光共聚焦成像观察到APC蛋白在AECs腔面 和侧面质膜下呈簇状聚集 与Nathke等报道一致 然而 我们的体外实验结果仅仅观察到APC蛋白在 划线损伤后主要表达在迁移活跃的细胞的侧面处皮 质区 并未显示APC蛋白在微管正极末端聚集的现 图 4 气道上皮细胞损伤修复中GSK3 与APC 蛋白的关系 Fig 4 GSK3 physically associated with APC protein in scratching induced injury and repair of airway epithelial cells The cells were lysed 0 h and 6 h after scratching GSK3 and APC protein were immunoprecipitated IP by the protein A agarose beads and ana lyzed on 6 SDS PAGE with anti GSK3 or anti APC antibody respectively 3 讨论讨论 在损伤修复过程中 迁移的细胞扮演了重要的 角色 此时细胞形态发生显著改变 形成具有特征 性的形态学改变 细胞极化 12 Etienne Manneville 等 13 研究认为细胞极化的特点之一就是胞膜突起 protrusion 的定向 损伤边缘的细胞朝垂直于伤口 的方向迁移 本实验在相差显微镜下观察到培养的 16HBE细胞呈现立体的 微凸起的 细胞间紧密连 接的 铺路石状的典型上皮细胞形态 而在机械性 损伤后3 h 损伤边缘的AECs 可呈片状单向迁移 除此之外 细胞形态也发生显著改变 呈现具有特 征性的极化形态学改变 并且其迁移方向垂直于损 伤方向 当损伤24 h以后迁移的AECs 能掩盖划线 部分 提示上皮损伤修复过程基本完成 生理学报 Acta Physiologica Sinica April 25 2007 59 2 197 203 202 象 这可能与AECs呈片状迁移 而不是单个迁移有 关 也可能是由于体内 体外实验环境不同造成 另外 GSK3 在静息细胞内呈组成性激活 其 磷酸化水平是较低的 而GSK3 N末端的丝氨酸残 基 Ser 9 的磷酸化可导致其活性抑制 细胞外刺激 通常通过一些激酶引起GSK3 该位点的磷酸化 包 括p70S6 激酶 p90RSK 也称 MAPKAP 1 Akt 也叫 protein kinase B PKB 某些 PKC 亚型和 PKA 特别是Etienne Manneville等 13 报道在迁移的 星形胶质细胞中 划线损伤通过PKC 促使GSK3 发生抑制性磷酸化 因此 我们认为机械损伤作为 一种细胞外的刺激 可以通过上述一种或几种激酶 引起GSK3 N 末端Ser 9 的磷酸化 而我们的实验 观察到GSK3 表达 包括其分布和定量在机械损伤 前后并没有改变 仅仅是损伤后导致其发生磷酸 化 也就是其活性的改变 从而影响 APC 蛋白的 定位 综上所述 机械损伤可导致 GSK3 活性的抑 制 促使其对 APC 蛋白的磷酸化修饰减少 影响 微管动力学和功能的调节 在维持上皮细胞极性 胞膜突起定向以及迁移方向确定等方面发挥作用 从而促进损伤后修复的过程 然而GSK3 是怎样调 节APC蛋白发挥作用的机制尚不清楚 本实验运用 免疫沉淀方法检测二者在损伤前后的关系 以期揭 示二者在AECs 损伤修复中的作用机制 我们发现 细胞划线损伤0 h时 GSK3 和APC蛋白存在于同 一复合体中 但在划线损伤 6 h 时 发生了分离 并且在两者的蛋白沉淀中均没有检测到磷酸化 GSK3 的表达 数据未显示 提示二者的分离是由 于 GSK3 的磷酸化造成的 正常的 APC 蛋白与 Axin GSK3 形成复合物 共同调节 catenin 浓 度 保证 Wnt 信号途径对细胞特化 增殖 极性 以及迁移的正常调节 22 而 AEC s 受损后导致 GSK3 失活 促进APC蛋白从APC Axin GSK3 复 合体中游离出来 这些APC蛋白发生重新定位 与 微管正极结合 发挥其调节微管的作用 从而促进 损伤修复过程 然而细胞迁移形成和维持极化形态 的具体分子机制尚不完全清楚 有待于进一步研 究 所以进一步探讨APC 蛋白和GSK3 在吸烟所 致气道上皮损伤修复中的作用对阐明呼吸系统疾病 的发病机制 逆转病变的进展具有重要意义 参考文献参考文献 1Tesfaigzi Y Processes involved in the repair of injured airway epithelia Arch Immunol Ther Exp 2003 51 283 288 2Wittmann T Waterman Stiter CW Cell motility can Rho GTPases and microtubules point the way J Cell Sci 2001 114 3795 3803 3Rodriguez OC Schaefer AW Mandato CA Forscher P Bement WM Waterman Storer CM Conserved microtubule actin interactions in cell movement and morphogenesis Nat Cell Biol 2001 105 421 424 4Ma ZY 马宗源 LI QF The structure feature of APC and its relationship to cytoskeleton Chin Bull Life Sci 生命科学 2004 16 16 18 Chinese English abstract 5Mogensen MM Tucker JB Mackie JB Prescott AR Nathke IS The adenomatous polyposis coli protein unambiguously localizes to microtubule plus ends and is involved in estab lishing parallel arrays of microtubule bundles in highly pola rized epithelial cells J Cell Biol 2002 157 1041 1048 6Woodgett JR Molecular 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