红霉素发酵工艺研究及进展.doc

09食安4班小组成员：徐萌0938421 陆吉林0938423 仇沙磊0938420 周炳楠0938422红霉素发酵工艺研究及进展一、红霉素简介与发酵发展现状 红霉素属大环内酯类抗生素，其水溶液呈强碱性,0 .0 66%的红霉素溶液pH为8.010 .5 ,8.5 %浓度的乳糖酸盐pH亦达6.07.5。具有广谱抗菌作用，其抗菌谱与青霉素类似，对革兰氏阳性菌尤其敏感，对葡萄球菌，化脓性链球菌，绿色链球菌，肺炎链球菌，白喉杆菌等都有较强的抑制作用。临床主要用于扁桃体炎，猩红热，白喉，淋病，皮肤组织感染等，对于军团肺炎和支原体肺炎可以作为首选药物。也可用于上下呼吸道感染。特别对于不耐青霉素的人也适用。红霉素被收入中国药典外，还被收入美国，日本，等药典。近年来，在竞争激烈的抗生素市场上，红霉素及其衍生物产量还在不断增长，销售节节上升，后市拓展仍有广阔空间。红霉素最早于1952年的J.M.Mcguire等人在菲律宾群岛土样中分离到的红霉素经发酵制得，美国礼莱公司和Abbott公司最先生产并将产品推向市场多年来红霉素生产稳定增长，20世纪80年代全世界产量已达到800吨，占全球抗生素产量的3.2%20世纪90年代以来，国际市场上红霉素畅销，促进了生产，产量有了较大副增长。1995年产量达到1500吨，1996年达到3200吨，目前为6000吨左右，成为世界抗生素市场上除头孢类和青霉素类以外的第三大抗生素药物。我国红霉素发酵水平属低水平重复操作，与发达国家相比差距较大。目前国外发酵单位已达8 00012 000 gml，而国内大多企业红霉素发酵水平却一直在4 0005 000gml 。由于国外企业的技术封锁，国内红霉素生产的发酵水平一直比较落后。红霉素发酵水平主要受工作菌种、培养基组成、发酵条件控制以及后期的分离提纯条件等多方面因素的影响，国内很多科技工作者从红霉素发酵相关参数和调控人手，希望提高红霉素发酵水平。目前，响应面法和正交试验法是微生物发酵培养基优化常用的方法，单个因素和多种因素相互作用都会对红霉素的生物合成产生不同程度的影响。二、红霉素的发酵工艺菌种及活化菌种：红色链霉菌，红色链霉菌的菌丝体，红色链霉菌的孢子菌种活化：先使用一级种子罐使用，然后使用的是二级种子罐。将所保藏的菌种孢子进行活化。种子制备种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。发酵接种方法：火圈接种法、压力差法。该厂现使用的是火圈接种法，每次接种34瓶（250ml烧瓶）发酵周期：一级12天，二级种子2天，三级发酵23天，周期67天。发酵温度：3233发酵终点：PH升高、粘度增加、效价不再提高红霉素发酵液的提取与精制硫氰酸钠萃取法发酵液放罐后，经碱化和絮凝处理后，用板框过滤，滤液再用复合溶媒萃取，溶媒相加入硫氰酸钠和冰醋酸，使硫氰酸红霉素结晶出来，晶体经过洗涤、烘干，既得硫氰酸红霉素。此工艺应用时间较久，工艺稳定。超滤法首先发酵液放罐后，用碱调节pH到8，加入0.03%甲醛溶液，进行超滤过滤，再经过连续离子交换树脂脱色和进一步纯化后，用纳滤膜进行浓缩，当浓缩液效价达到20000u/ml，进后工艺处理，浓缩液加入一定量的碱或NaSCN，得到红霉素碱或者硫氰酸红霉素结晶，晶体过滤后，再用丙酮溶解，去除不溶物，在丙酮液中加入水使红霉素结晶出来，晶体烘干得到成品，而丙酮溶液用三达EA技术回收丙酮，剩余母液可以返回浓缩工序利用或返回到离交工序。废水处理在早期主要采用“混合稀释，再生化处理”的处理方法，现多采用“预处理厌氧好氧”的处理方法3、 工艺存在问题及解决方法（1） 培养基优化培养基作为微生物养料的直接来源，是影响微生物生命和生理代谢活动的最主要的因素。平时我们做实验主要为获得某种单菌落，对培养基的要求比较简单，即只需要其能够满足相应菌的生长代谢需求即可。但发酵培养基的要求条件就比较多，要实现产业化生产就要考虑到原料的因地制宜，价格低廉，资源丰富，便于采购运输，适合大规模贮藏，能保证生产上的供应。还要考虑到发酵后的副产物要尽可能的少，而且，所选用的培养基应能满足整体工艺的要求，如不影响通气、提取、纯化及废物处理等等。因此要获得高产量的红霉素，我们要尽可能找到一个最适合其菌种生长的培养基，这包括培养基成分和各组分含量的配比等确定，即对培养基进行优化。目前，响应面法 和正交试验法是微生物发酵培养基优化常用的方法，单个因素和多种因素相互作用都会对红霉素的生物合成产生不同程度的影响。因此，笔者拟采用响应面法和正交试验法对红色糖多孢菌产红霉素的发酵培养基进行优化，以期获得交互影响最为显著的因素及最佳配比，提高红霉素的发酵水平。具体优化探索如下：材料与方法11 菌种红色糖多孢菌UL5由四川理工学院微生物实验室保藏。12 培养基及培养条件121 改进高氏培养基。可溶性淀粉2 ，NaC1 005 ，硝酸钾01 ，磷酸二氢钾005 ，硫酸镁005 ，硫酸亚铁0001 ，重铬酸钾7o一80 rn1，青霉素2530 ml，琼脂15 25 ，pH 7476(NaOH调)。33培养7 d。122 改进斜面培养基。可溶性淀粉l ，硫酸铵03 ，玉米浆12 ，NaC1 03 ，碳酸钙03 ，琼脂15 一25 ，重铬酸钾708O ml，青霉素2530 Ixgml，pH 75(NaOH调)。33培养7 d。123 种子培养基。淀粉30 ，黄豆饼粉25 ，蛋白胨05 ，糊精3O ，葡萄糖10 ，NaC104 ，硫酸铵075 ，碳酸钙06 ，硫酸镁0025 ，磷酸二氢钾002 ，pH 75(NaOH调)。121灭菌25 min。挖取新鲜活化菌种平板(1am2 Cll1)接到装有50 rn1种子培养基的250 ml摇瓶中，培养温度33 ，220 rmin，置于摇床上培养2 d。124 初始发酵培养基。黄豆饼粉30 ，淀粉4O ，糊精30 ，硫酸铵02 ，碳酸钙06 ，葡萄糖10 ，磷酸二氢钾004 ，pH 68，121灭菌25 rain。接种量5(二级种子)，250 ml摇瓶装液量为50 ml，220 rmin培养2 d，300 rrain培养3 d，150 rrain培养2 d，31 培养2 d，33培养3d，29培养2 d。13 红霉素生物效价测定采用管碟法 。14 培养基优化方法141 响应面试验。在前期完成的单因素试验研究结果下，采用响应面法 对培养基组成成分进行优化。142 验证试验。对响应面试验优化结果确定的最佳值及预计结果进行验证，进行可靠性分析，得到最优结果。143 正交试验。根据响应面试验和单因素试验得到的结果，再对硫酸铵、碳酸钙、玉米浆和磷酸二氢钾4种成分进行正交试验。实验具体过程及数据（略），通过对以上实验可得出如下优化结果：最终得到最佳培养基配方为黄豆饼粉289 ，淀粉3025 ，糊精204 ，葡萄糖197 ，碳酸钙07 ，硫酸铵01 ，玉米浆12 ，磷酸二氢钾004 。优化后，UL5菌株发酵液的平均生物效价达5 848 ml，与UL5菌株在原始培养基下效价4 772 ml相比提高了2255。（2 ）发酵过程中参数不控性与模糊控制的应用发酵是抗生素生产过程的一个关键环节，传统的发酵工业操作方式是开环的，具有经验的操作者通过经验知识和生产过程的信息，随时调整补加营养物料和基质的策略，使得微生物的生长代谢沿着理想的轨迹进行；尽管对发酵过程的环境参数，如PH，发酵温度，溶解氧浓度D0都可以控制得很好，但是由于微生物生长过程是高度的非线性和时变性，关键变量，如菌丝浓度、总糖浓度不可在线测量，使发酵过程的控制问题变得很复杂。采用计算机控制技术对抗生素发酵过程进行实时自动控制、管理和优化操作，不但能解决上述存在的问题，而且可减轻操作人员的劳动强度，提高自动化水平，稳定生产，提高发酵系数，降低原耗与能耗。传统控制方法在执行控制时，往往需要取得对象的数学模型，但是红霉素发酵过程由于参数的不确定性、过程的非线性、变量间的耦合性、信息的不完全性和过程关键参数测量的时滞性，无法取得精确的数学模型。在生产实践中，人们发现有经验的操作人员虽然不懂被控对象的数学模型，但却能十分有效地对系统执行控制。这是因为操作人员对系统的控制是建立在直观的经验上的，凭借在实际中取得的经验采取相应的决策就可以很好的完成控制工作。人的经验是一系列含有语言变量值的条件语句和规则，而模糊集合理论又能十分恰当地表达具有模糊性的语言变量和条件语句。因此，可以把人的经验用模糊条件语句表示，然后用模糊集合理论对语言变量进行量化，再用模糊推理对系统的实时输入状态进行处理，产生相应的控制决策。这也就是模糊控制器的工作过程。由此可见，模糊控制器实质上是反映输入语言变量与输出语言变量及语言控制规则的模糊定量关系算法结构。其功能的实现是要先把计算机观测控制过程得到的精确量转化为模糊输入信息，按照总结人的控制经验及策略取得的语言控制规则进行模糊推理和模糊决策，求得输出控制量的模糊集，再经模糊判决得出输出控制的精确量，作用于被控对象。因此，模糊控制器的结构通常是由它的输入和输出变量的模糊化、模糊推理算法、模糊合成和模糊判决等部分组成。培养基优化培养基作为微生物养料的直接来源，是影响微生物生命和生理代谢活动的最主要的因素。平时我们做实验主要为获得某种单菌落，对培养基的要求比较简单，即只需要其能够满足相应菌的生长代谢需求即可。但发酵培养基的要求条件就比较多，要实现产业化生产就要考虑到原料的因地制宜，价格低廉，资源丰富，便于采购运输，适合大规模贮藏，能保证生产上的供应。还要考虑到发酵后的副产物要尽可能的少，而且，所选用的培养基应能满足整体工艺的要求，如不影响通气、提取、纯化及废物处理等等。因此要获得高产量的红霉素，我们要尽可能找到一个最适合其菌种生长的培养基，这包括培养基成分和各组分含量的配比等确定，即对培养基进行优化。目前，响应面法 和正交试验法是微生物发酵培养基优化常用的方法，单个因素和多种因素相互作用都会对红霉素的生物合成产生不同程度的影响。因此，笔者拟采用响应面法和正交试验法对红色糖多孢菌产红霉素的发酵培养基进行优化，以期获得交互影响最为显著的因素及最佳配比，提高红霉素的发酵水平。具体优化探索如下：（3）通过摇瓶发酵试验验证其对红霉素发酵工艺的影响红霉素的产生取决于菌丝的生长活力在营养期内应控制菌丝使其具有较高的呼吸活力和磷酸酶F蛋白酶F淀粉酶等的活力。在合成期要提高红霉素的产量须将菌体控制在最适生长点以下。在红霉素发酵工艺中究竟如何通过温度，PH值，摇床转速控制方式，补料工艺及前体添加等条件产生影响？通过红霉素摇瓶发酵实验来验证其影响，并确定是否有助于工业发酵。摇瓶发酵实验一般分为3级发酵，即l级种子培养，2级种子培养及发酵其完整周期为12 d。对1级种子培养和2级种子培养进行比较，并考虑蒸发原因，结果二者差别不大。为了缩短发酵时间及减少染菌率，一般都省去2级种子培养，而直接采用1级种子进行发酵培养，其完整周期约为10d。3.1温度，PH值对红霉素发酵水平的影响摇瓶发酵实验一般不能在整个发酵周期内只选取一个最合适的培养温度和PH值。根据经验及有关文献报道将发酵后期温度控制在(2905)C，pH值控制在7072之间。采用正交设计进行考察。摇瓶发酵采用2级发酵，转速为220 rmin，全程补料培养。3.2摇床转速对红霉素发酵水平的影响菌体在不同的生长、代谢阶段，其需氧量是不同的 我们设计了4组调节摇床转速的方案，从实验结果来看，采取第2级方案发酵水平最高，效价达318 2个单位，比对照实验提高833.3 补料配方对红霉素发酵水平的影响在摇瓶发酵实验中，通过改变补料培养基配方来考察其对红霉素发酵水平的影响。补料分为补糖即补葡萄糖与补混合料，包括黄豆饼粉、玉米浆、硫酸铵、酵母粉等。着重考察其中5个因素：葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸铵、酵母粉、玉米浆。每个因素取5个水平，采用均匀设计。为提高实验精度，采用拟水平法。每个因素虚拟为10个水平利用U 。(10) 表安排实验。实验结果利用逐步回归法n，求得回归方程为 Y一171 9x +8444x 一35957x3+2 21925，式中： 一红霉素效价； 一葡萄糖浓度 。一黄豆饼粉浓度；z 一硫酸铵浓度。经验证，我们选取优化配方 i l ；，( 表示葡萄糖浓度为第5水平，其余类同)。酵母粉与玉米浆按原配方浓度，结果为3 305个单位，与预测值 3 360个单位较相符。故认为r 薅r 台适 最后，对实验结果与原配方进行对比，最大菌体浓度由40升至41 故化学效价提高约383.4前体添加对红霉素发酵水平的影响在对红霉素生物台成有影响的有机酸及醇类中，发现丙醇有明显作用。我们在摇瓶发酵中+考察了6种不同添加水平的丙醇对红霉素发酵的影响。由实验结果显示，前体添加取第4水平时，对应红霉素效价为4 220个单位，比不加前体时的3 31 6个单位，提高了273总结：(1)通过摇瓶正交实验+得出了红霉素的优化发酵温度和pH值。即发酵前期：71=35，pH=68和发酵中期 7131 C，pH=68。同时，得到优化了的摇床转速控制方式，及前体添加水平。 (2)优化朴料配方使效价提高约3 ，同时得到效债与各基质浓度的回归方程 Y=171gxI+84 44 23595 7x3+2 21925。 (3)优化红霉素发酵水平达到4 2 20个单位，比原始对照实验的2 854个单位提高约473。（4）红霉素协同萃取新工艺研究在红霉素中性络合萃取体系研究的基础上，为了进一步改善红霉素萃取体系的物性，提高萃取能力，降低溶剂成本，进而开发了新的协同萃取体系。关于协同萃取对于金属元素的萃取已多有研究 。所谓协同萃取效应即是指在二元或多元萃取体系中，若被萃取组分的分配系数显著大于每一种萃取剂单独使用时的分配系数之和，则称为正协同萃取效应；反之，称为反协同萃取效应；又当协同萃取体系的分配系数与每一种萃取剂单独使用时的分配系数之和相等时，则无协同萃取效应。设B萃取剂的萃取分配系数为D ，s萃取剂为D ，定义D加和=Ds s+DB(1一Xs)，式中， s表示S组分的物质的量分数，D协为协萃分配系数，并有协萃系数R=D协D加和。显然，R1，有正协同效应；R1，说明该体系是有明显的协萃效应。在实验条件为：水相料液中红霉素浓度1 650umL，水相中平衡pH值为106108，萃取相比(0：A)1：8，萃取温度17 ，两相混合时间3 min，取协萃体系中对应最大R的分配比与醋酸丁酯进行对比后发现由此可见，以上协萃体系的萃取能力远大于醋酸丁酯的萃取能力。2 新萃取体系用于发酵料液的实验结果在所研究的协萃体系中，经综合比较(包括萃取性能，体系的物性、毒性和经济性等)选定B+S协萃体系进行进一步的研究。采用实际发酵滤液进行萃取，而后分别按在有机相内和反萃后在水相内成盐进行了比较研究。可见，新协萃体系在萃取(或 时的损耗量，且水相内成盐时的损耗量低于有机相萃取、反萃)过程中的损耗量远低于醋酸丁酯萃取内成盐时的损耗量，但由于反萃取有一定收率，则水相内成盐的产品回收率会低于有机相成盐时的产品回收率。在最终红霉素碱产品中是否有萃取溶剂的残留以及残留量是多少，这无疑是人们关注的一个问题。为此我们采用协萃体系进行了红霉素的萃取一成盐(在溶剂相中成红霉素硫氰酸盐)一转碱的全流程试验，并对所得红霉素碱产品进行了溶剂残留量的测定测定方法采用气相色谱法心。测定结果表明，其溶剂残留量与对红霉素硫氰酸盐的洗涤条件密切相关。本研究采用了有效的洗涤方法，可使最终成品中的溶剂残留降低至100 mgL以下。3 结论本文研究开发了具有正协同萃取效应的新萃取体系，与醋酸丁酯比较，新体系在萃取过程中损耗少，萃取收率高，而且价格大幅度下降，因此具有明显的技术、经济优越性。新萃取体系可用于有机相内成盐和反萃后在水相内成盐两个工艺流程。水相内成盐具有更低的溶剂损耗量，但产品总回收率受定影响。采用实际发酵滤洗液的实验表明，新萃取体系在萃取过程中乳化趋势小，易于再生复用，因此是一个适用于工业生产的新萃取体系。4、 红霉素发酵前景展望其临床应用领域的扩大和以阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素等为代表的新型半合成红霉素的出现，快速拉动了红霉素原料药的生产需求。据西方经济学家预测，2010年红霉素系列产品的全球市场总规模达70亿美元以上，市场前景乐观。抗生素发酵生产本身是高耗能产业，存在环境污染等问题，发达国家近年来正逐步把抗生素原料药的生产转移到中国等发展中国家。目前，我国是世界上红霉素生产和出口的第一大国，年产量超过7000吨。采用微生物发酵是获取药用抗生素原料的主要途径，而我国作为世界上原料抗生素的主要生产大国，发酵单位偏低、产品质量偏低、缺乏自主知识产权的新型抗生素药物等一系列原因却严重制约了这一产业的发展。自红霉素作为一种广谱抗生素药物进入临床以来，以提高其产生菌种发酵单位为目的的遗传育种工作一直未曾停止。由于对微生物次级代谢产物生物合成的机制了解不多，常规诱变选育的方法存在周期长、效率低和随机性大的缺点，近年来在红霉素高产菌株的筛选方面收效不大。随着分子生物学技术的发展，国际上在红霉素产生菌种的基因工程改造方面进行了诸多尝试；然而，这些研究主要集中在与红霉素产生相关的底物供应或限制因素的改进方面，并未就红霉素生物合成的次生代谢途径做特异性的遗传修饰，因此，在解决红霉素生产中