3M快速金黄色葡萄球菌数测试片操作以及判读.doc

3M快速金黄色葡萄球菌数测试片操作以及判读一、测试金黄色葡萄球菌数 操作方法1、未拆封包请冷藏于8，并在保存期限内使用完。在高温度的环境中可能出现冷凝水，最好在拆封前将整包回温至室温。2-3、已开封时，将封口已胶带封紧，存放于25/湿度50%以下,并于一个月内使用完. 请勿将已开封包冷藏于冰箱4、使用无菌的容器置入样品，已备将样品作10倍或更大倍数的稀释。5、加入适量的无菌稀释液:Butterfield s phosphate buffer(IDF phosphate buffer,0.0425g/L of KH2PO4 adjusted to pH 7.2),0.1%peptone water ,people saltdiluent (ISO method 6887),saline solution (0.85-0.90%),bisulfite-free letheen broth,或无菌蒸馏水。 不可用buffered peptone water 或buffered 含有citrate ,bisulfite,or thiosulfate ;它们可能抑止菌生长。6、搅拌或均质样品。 调整样品稀释液的pH值至6.57.5。请以1N NaOH调整酸性产品pH值，以1N HCI调整碱性产品。7、将测试片放置在平坦的外表面，揭起上层膜。使用吸管将1ml样品垂直低在测试片的中央处。8、小心卷会上层膜，避免气泡进入。不要让上层膜直接盖回。9、使用压板放置在上层膜中央处。轻轻的压下，是样品液均匀覆盖于圆形的培养面积上。且勿扭转或滑动亚板。拿起亚板，静置1分钟以使培养基凝固。10、测试片的透明膜朝上可堆叠至10片，培养于351或371下，242小时。11、培养之后，菌落可能生长，但在检测片上看不到，因为指示剂是含在金黄色葡萄球菌检测反应片上。12、检测片移至362培养箱，培养14小时。注意：如果菌落需要进一步测试，检测片培养不要超过一个小时。13、使用无菌镊子取出圆形的反应片，再掀开检测片上层膜小心置入反应片。在江上层膜放下。14、为了确定反应片与培养胶均匀接触及避免夹带任何气泡，可以使用一个弯曲的玻璃棒（L玻璃棒）轻压检测片。15、将已置入反应片的金黄测葡萄球菌检测片培养于351或371，13小时。16、可目视或使用菌落计数器并可参读判读卡计算菌落数。17、菌落可以分散做为进一步的鉴定，掀起上层膜，有培养胶上挑起菌落。二、测试金黄色葡萄球菌数 判读方法快速金黄色葡萄球菌检验测试片（Petrifilm RSN）由两部分组成，第一部分是金黄色葡萄球菌培养基片，次检验片含有修正Baird-Pdker 营养物几一冷水可溶解的胶质，第二部分是热安定核酸酶（TNase）反应片，包含有DNA，Toludine RSN-O（甲苯胺篮）及四唑指示剂(Terazolium),此一指示剂有助于菌落的计数及确定葡萄球菌热安定核酸酶的存在.热安定核酸酶是一种金黄色葡萄球菌的酵素产物,在高温下能维持稳定, 热安定核酸酶的检测象凝固酶反映一样,是一种鉴定金黄色葡萄球菌的方法. 在Petrifilm RSN 检测片上，热安定核酸酶反应看起来像是粉红色环带包围着的一个红色、或篮子菌落.Petrifilm RSN 检测片必须与Petrifilm热安定核酸酶反应片一起使用,单独使用将不会显示菌落,因为具有辅助计数菌落的指示剂是在反应片上,而不是在Petrifilm RSN检测片上。S.aureus count=22本图片显示一个典型的petrifilm RSA检测片上的金黄色葡萄球菌的菌落,计算所有粉红色环带的菌落既是S.aureus,菌落可能是红色或蓝色.S.aureus count=0图2显示一个置人petrifilm 热安定核酸酶反应片的petrifilm RSA 检测片,在这检测片上看不到菌落或热安定核酸酶环带.S.aureus count=4热安定核酸酶反应的一种指示剂造成金黄色葡萄球菌呈红色菌落,第二种指示剂使得热安定核酸酶环带显示粉红色.S.aureus count=36因为有些金黄色葡萄求菌只生产少量的热安定核酸酶,所以无论大小计算所有的Tnase环带菌落为金黄色葡萄球菌.Petrifilm RSA 检测片上Tnase环带的适当计数范围大约是15-100个菌落.计数范围高低端视 金黄色葡萄球菌生产Tnase环带量的多寡及其他菌相生长状况.S.aureus count = 38有些金黄色葡萄球菌产生大量的热安定核酸酶.这一类的金黄色葡萄球菌,于最后一阶段培养时,只需30分钟培养既可计算.因为已形成可目测的Tnase环带.注意:图4与图5有大约相同的菌落数.至于Tnase环带大小的差异,可能来自菌株的不同或最后阶段培养时间长短的差异.Estimated s.aureus count = 150Petrifilm 图形的生长面积大约30平方公分.可以 估算方式,先数三个方格内粉红色环带的数量,在乘以10,即为所有在图形培养范围内的菌落数.S.aureus count = TNTC当大量的金黄色葡萄球菌出现时,粉红色Tnase 环带可能重叠造成整个检测片变成粉红色.图7显示一个检测片中,因菌落过多无法计数(TNTC).建议进一步稀释样品来鉴定正确的菌落数.S.aureus count = 3偶尔水化培养基的菌株会长在检测片上.他们呈不规则形的红色菌落,而且周围无粉红色Tnase环带.亦不视为金黄色菌落但无粉红色Tnase环带,亦不视为金黄色葡萄球菌(如圆圈2).若有大的食物颗粒存在,反应片不易与培养基均