流式细胞分析在临床血液学中的应用.ppt

流式细胞分析在临床血液学中的应用西南医院检验科黄君富 1 白血病免疫分型 FAB主要依据形态学和细胞化学进行分型 MIC方案在FAB方案基础上结合了免疫学和细胞遗传学 M 形态学I 免疫学C 细胞遗传学 免疫分型与FAB的关系 FAB分型受检查者的主观因素影响大 符合率有一定限制 免疫标志能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信息 而这种变化常常是细微的 以至于常规FAB方法不能分辨 免疫分型是MIC的重要组成部分 它是对FAB分型的补充 属于同一种FAB型的病例 可能具有不同的免疫表型 免疫表型在AML和ALL上与FAB的不一致并不减低免疫分型在白血病患者的应用价值 相反 免疫表型使我们对血液肿瘤细胞的生物学特征有了更深入和更精确的认识 免疫表型对肿瘤的诊断 治疗策略的制定 预后判断及肿瘤发病机制的研究都具有重要作用 免疫分型的两个阶段 根据白血病细胞表达的系列相关抗原 确定其系列来源 如 淋系T B 粒单系 红系 巨核系等 根据白血病细胞表达的系列分化其相关抗原进一步分型 如 早前B 前B 普通B 急性白血病的四大免疫类型 单表型急性白血病表达某一个系列抗原为主的急性白血病双表型 双克隆急性白血病未分化型急性白血病 急性白血病的免疫学系列分型类型系列积分B系T系粒单系巨核系红系1 单表型纯B ALL 20000纯T ALL0 2000纯AML00 200纯AML M600 2 2 2纯AML M700 2 2 2 急性白血病的免疫学系列分型类型系列积分B系T系粒单系巨核系红系2 单表型为主My B ALL 20 200My T ALL0 2 200Ly AML 2 2 2 2 2T B ALL 2 2000注 My 髓系抗原阳性 Ly 淋系抗原阳性 急性白血病的免疫学系列分型类型系列积分B系T系粒单系巨核系红系3 双表型 双克隆型T B 2 2000T M0 2 200B M 20 2004 未分化型AUL 2 2 2 2 2 B细胞系ALL的免疫分型 T细胞系ALL的免疫分型亚型CD7CD2TdTFAB分型早前T ALL L1 L2T ALL L1 L2 免疫分型的价值 确定ALL的细胞类型 B细胞或T细胞 和ALL的分化阶段 鉴定AML的特征 对形态学上未分化的急性白血病有助于鉴定细胞类型 诊断一些少见类型的白血病 如 M6 M7 M0等 诊断双表型 混合细胞型急性白血病 鉴别诊断ALL伴有髓系抗原表达 My 或AML伴有淋系抗原表达 Ly 鉴别急性白血病与其他造血系统和非造血系统恶性肿瘤 根据一些特殊的免疫表型特征诊断与某核型异常相关的亚型 如 M3 t 15 17 M2 t 8 21 M4Eo inv 16 等 慢性白血病免疫分型 慢性粒细胞性白血病主要用于急变期的分型 同急性白血病免疫分型 慢性淋巴细胞性白血病除了鉴别是T还是B淋巴细胞型外 还用于与反应性淋巴细胞增多症的鉴别 以及与部分淋巴瘤的鉴别诊断 一些少见的白血病如 毛细胞白血病 浆细胞白血病 恶性组织细胞性白血病等的诊断与鉴别诊断 2 再生障碍性贫血的研究 AA是一组由不同发病机制介导的骨髓造血功能障碍综合征 其发病机制复杂 目前尚未完全明了 但越来越多的临床和实验证据表明 免疫介导的造血抑制AA最常见的病理机制之一 而且 具有免疫表型异常 如 CD4 CD8倒置 CD8 活化T细胞或TCR 异常增高等 的患者 临床表现相对严重 但免疫抑制治疗相对有较好的疗效 常用的淋巴细胞表面标志物 淋巴细胞亚群T细胞 CD3 TCR CD4 Th Ti CD8 Ts Tc B细胞 CD19 NK细胞 CD3 CD16 CD56 淋巴细胞亚群细分 T细胞 Ts CD8 CD28 Tc CD8 CD28 Th CD4 CD29 Ti CD4 CD45RA B细胞 B1 CD5 CD19 B2 CD5 CD19 活化淋巴细胞亚群 活化总T细胞 CD3 HLA DR 静止总T细胞 CD3 HLA DR 活化CD4 细胞 CD4 HLA DR 活化CD8 细胞 CD8 HLA DR 活化诱导分子 CD69白细胞介素2低亲和力受体 CD25CD25 CD3 活化T细胞CD25 CD3 静止T细胞 根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同 CD4 Th1 CD4 IFNr Th2 CD4 IL4 Th0 CD4 IFNr IL4 CD8 Tc1 CD8 IFNr Tc2 CD8 IL4 Tc0 CD8 IFNr IL4 Th1细胞 介导细胞免疫 细胞毒性T细胞的生长和活化 巨噬细胞的活化 介导迟发型过敏反应 其功能亢进将导致炎症慢性迁延 器官特异性自身免疫病 急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤 Th2细胞 介导体液免疫 促进B细胞的生长 活化和分化 是IgG1和IgE类抗体的转换因子 其功能亢进将导致特异性过敏反应 参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症 Th1 Th2细胞平衡偏移多见于 感染症 自身免疫病 过敏症 排斥反应 免疫缺陷 肿瘤恶化等 检测Th1 Th2细胞平衡主要是分析疾病发生发展的状况 为临床调整Th1 Th2细胞平衡偏提供正确的治疗依据 3 血栓与止血 血小板糖蛋白血小板质膜糖蛋白GP a CDw49bGP a CD61GP b CD42bGP CD36GP c CDw49fGP CD42aGP a CD29GP b CD41GP a CD31血小板颗粒膜糖蛋白 颗粒 CD62P GMP140 PADGEM 颗粒 溶酶体完整膜糖蛋白CD63溶酶体相关膜糖蛋白 1LAMP 1溶酶体相关膜糖蛋白 2LAMP 2 活化血小板检测CD62P CD63GP b a复合物 CD41 61 GP CD36 PAC 1Thrombospondin血小板内钙离子 遗传性血小板功能缺陷性疾病诊断巨血小板综合症 BSS GPIb CD42a CD42b 缺陷或缺乏血小板无力症 CT GP b a CD41 61 缺陷或缺乏贮存池疾病 SPD下降 4 CD34的绝对计数 随着近年来外周血造血干细胞移植病例的日益增多 外周血造血干细胞的流式定量越来越成为一个突出的话题 如何准确地定量干细胞数量 什么是有效的质量控制成了各大实验室的话题 1989年 欧洲人创建了米兰方案 利用SS与CD34作双参数直方图 计算CD34阳性细胞数 同年 北欧人改进了米兰方案 加入了对照 称之米兰 北欧方案 1995年 血液病治疗及移植国际联合会 theInternationalSocietyofHematotherapyandGraftEngineering ISHAGE 成立了干细胞绝对计数 Enumeration 小组 致力于寻求一种简单 快速 灵敏的流式细胞仪检测方法去定量外周血中的造血干细胞数量 这一方法必须是对于临床实验室中不同的流式细胞仪都有效 而且在不同的移植中心具有可比性 这一方案即在96年问世的ISHAGE方案 至今为止 其他各种方案改进均以此方案为基础 5 多药耐药 MDR 的研究 白血病治疗的失败再很大程度上是由于白血病细胞对化疗药物产生了耐药 因此对白血病耐药机制的研究具有重要的意义 但是耐药的形成过程却很多 主要有几个方面 药物吸收减少 细胞解毒作用增强 靶分子改变 DNA损伤修复能力增强 细胞内药物溢出增多 细胞凋亡的抑制等 常见的流式检测项目 参与药物在细胞内外转运的蛋白 P 170 MRP LRP BCRP MVP参与细胞解毒的酶 ALK GST GSH MS抑制细胞凋亡的蛋白 bcl 2 bax P53药物泵的功能检测 罗丹明123 R123 或柔红霉素 6 阵发性睡眠性血红蛋白尿 PNH 阵发性睡眠性血红蛋白尿 PNH 是由于造血干细胞发生体细胞突变而引起的获得性溶血性贫血 典型病例有发作夜间血红蛋白尿 可伴全血细胞减少 其溶血是由于红细胞膜的获得性缺陷 对激活补体异常敏感所致的一种慢性血管内溶血 随着流式细胞仪的逐渐推广 流式细胞术检测CD55 CD59以能从病理上提供直接的证据而得到广泛的应用 正常人的红细胞 网织红细胞 粒细胞 血小板上CD55 CD59表达完全阳性 而PNH患者细胞则分为三型 依据CD55 CD59缺乏或减少的程度 流式细胞术在PNH诊断中须注意的事项 1 尽量同时检测红细胞和粒细胞的CD55与CD59的表达情况 因为PNH克隆来源的红细胞在溶血后和输血后 红细胞中PNH克隆细胞会减少或检测不到 而对粒细胞则影响很小 同时检测红细胞和粒细胞CD55和CD59可以区分小细胞低色素性贫血和PNH 小细胞低色素性贫血只有红细胞上的CD55和CD59减少 粒细胞上CD55和CD59正常 2 在检测红细胞的CD55与CD59时 可以用全血标记 但必须稀释 而在检测粒细胞的CD55与CD59的表达时 必须先溶血再标记 因为红细胞数远远高于粒细胞 红细胞的存在会与粒细胞竞争对CD55与CD59的结合 7 多发性骨髓瘤 MM 多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生性疾病 正常浆细胞为CD38 CD45dim 使用CD38 CD45双标记检测外周血和骨髓标本 可以准确划定浆细胞群 通常使用CD38和CD45 结合轻链检查 对多发性骨髓瘤细胞进行分析 另外 正常浆细胞的表面标记为CD19 CD56 而多发性骨髓瘤细胞通常为CD19 CD56 这样 使用流式细胞仪对外周血或骨髓标本进行多参数分析 并计算异常浆细胞含量 对于多发性骨髓瘤的诊