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逆转录实验说明一、反转录酶的选择1 Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。2 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。4MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。二、合成cDNA引物的选择1 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。2 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。3 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。RNA保存：为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000g离心5分钟。 第二章 增加RT-PCR灵敏度分离高质量RNA 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(A)+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+ RNA会增加检测的灵敏度。 图2. 总RNA和poly(A)+ RNA在RT-PCR中的比较 以5或1g Hela细胞总RNA（分别为泳道1和2）或500ng和50ng Hela细胞poly(A)+ RNA（分别为泳道3和4）。使用oligo(dT)引物和SuperScript逆转录酶合成cDNA。扩增对象为DNA聚合酶mRNA 5端377bp片段和复制酶A mRNA的643bp片段，两者都为中等丰度。将1/10的cDNA合成反应产物使用Taq DNA聚合酶扩增30个循环。 为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000g离心5分钟。 在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。 使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶 逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。 SuperScript逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆转录酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA（图3）。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多（图4）。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScrip显著提高了长RT-PCR产物的产量（图5）。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42的温度下进行。 图3 逆转录酶对cDNA第一链产量的影响 在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10Ci的-PdCTP。第一链的总产量使用TCA沉淀法计算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。 图4 逆转录酶对RT-PCR灵敏度的影响 图5 逆转录酶对长模板RT-PCR灵敏度的影响 以oligo(dT)为引物，使用ThermoScript或AMV，在50下由Hela细胞总RNA合成cDNA。使用Platinum Taq DNA聚合酶和人DNA聚合酶引物进行35个循环。 人tuberous scherosis mRNA（5.3kb）和人DNA聚合酶mRNA的全长cDNA的合成由SuperScript和MMLV催化。利用oligo(dT)为引物，由5g Hela细胞总RNA合成cDNA。样品使用RNaseH处理，然后使用ELONGASE? Enzyme Mix将1/10的cDNA合成反应产物扩增35个循环。 RNaseH产生的障碍 RNaseH对第一链cDNA的影响。RNaseH在cDNA合成期间降解RNA:DNA复合体中的RNA。红色箭头代表潜在的酶切位点。 提高逆转录保温温度 较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用ThermoScript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增（图6）。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时（见第三章）。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60前在25保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。 图6 温度对不同模板的影响 使用ThermoScript或AMV，以18S rRNA基因特异性引物，由10ng大豆总RNA在所示温度合成cDNA。将1/10的cDNA反应产物使用高保真Platinum Taq DNA聚合酶进行40个PCR反应循环。 表2. 逆转录保温温度 Reverse Transcriptase Incubation Temperature AMV 37C-45C M-MLV 37C SuperScriptII RT 37C-50C ThermoScript RT 42C-65C RNA在高于65时开始水解，对于1kb的RNA第一链合成温度可以为70，对于1kb的RNA则需要65。 Tth热稳定聚合酶在Mg存在条件下 作为DNA聚合酶，在Mn存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65条件下保温。然而，PCR过程中Mn的存在会降低忠实性，这使得Tth聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。 促进逆转录的添加剂 包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20的甘油或10的DMSO而不影响SuperScript或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20的甘油而不降低活性。为了在SuperScript逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10的甘油并在45保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4，这不足以抑制PCR。 RNaseH处理 在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosis（图7）。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了SuperScript或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。 图7 RNaseH处理对RT-PCR的影响 使用SuperScript（S）、M-MLV（M）或AMV（A），由5g Hela RNA合成人tuberous sclerosismRNA（5.3kb）的全长cDNA，反应产物的一半使用RnasH处理30分钟，使用ELONGASE Enzyme Mix对相当于起始RNA 0.5的经处理及未处理逆转录产物进行35个循环的扩增。 小量RNA检测方法的提高 当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250g/ml。 在使用SuperScript的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度（图8），而且对于小量RNA，减少SuperScript的量并加入40单位的RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScript进行逆转录反应时加入BSA或RNase抑制剂。 图9 一步法RT-PCR的灵敏度 使用SuperScriptOne-Step RT-PCR System从0，0.1，1，10，102，103pg Hela总RNA（分别为泳道1-6）扩增-actin片段。反应在50保温30分钟；942分钟；然后9415秒，5530秒，6890秒进行40个循环；随后在68保温5分钟。反应中包含200 nM正义和反义引物。 两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点（表3）。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增（图9）。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。 表3. 一步法和两步法RT-PCR的比较 两步法步骤 一步法步骤 起始第一链cDNA合成使用： 起始第一链合成使用 Oligo(dT) GSP引物 随机六聚体 GSP引物 优点 优点 灵活 方便 引物选择 扩增酶同逆转录酶预先混合 扩增酶的选择 转管步骤少，减少污染可能性 困难RT-PCR的优化能力 高灵敏度 同Platinum酶结合提高特异性 适用于大量样品分析 同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性 适用于定量PCR 适用于在单个样品中检测几个mRNA 关于扩增酶和产物大小应注意： 对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶 对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity 对于大于12kb的产物使用ELONGAE Enzyme Mix 对于一步法RT-PCR，如果产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果产物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。 图9 一步法RT-PCR的灵敏度 使用SuperScriptOne-Step RT-PCR System从0，0.1，1，10，102，103pg Hela总RNA（分别为泳道1-6）扩增-actin片段。反应在50保温30分钟；942分钟；然后9415秒，5530秒，6890秒进行40个循环；随后在68保温5分钟。反应中包含200 nM正义和反义引物。 第三章 增加RT-PCR特异性第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20l反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。 Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20l反应体系使用0.5g oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。 基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计（见第五章）。GSP可以同与mRNA3最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20l的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。 提高逆转录保温温度 为了充分利用GSP特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性