牡丹籽粕中提取芍药苷方法的.ppt

牡丹籽粕中提取芍药苷方法的研究 菏泽尧舜牡丹生物科技有限公司 主要内容 一 课题选择的背景 本项目研究目的是开发油用牡丹籽粕的附加值 首先对牡丹籽粕中生物活性成分进行分析评估 探索开发利用的方法 从而延长牡丹产品的产业链 以高新技术促进牡丹生物产业发展 本课题以本公司生产牡丹籽油后的牡丹籽粕为原料 对其水醇提取液进行了高效液相 质谱分析首先确定了含有芍药苷成分 进一步确认了芍药总苷含量约在2 65mg g 后续研究了从牡丹籽提取芍药苷的提取工艺及纯化工艺 二 研究的意义 芍药苷是来源于赤芍白芍的一种药物 是一种单萜类糖 国内外研究其药理作用广泛 具有扩张血管 扩张冠脉血管 对抗急性心肌缺血以及抑制血小板凝聚等多方面作用 镇痛镇静 抗炎抗溃疡 解热解痉 利尿 抗应激性溃疡病 市场产品有芍药苷胶囊 主治类风湿性疾病 疗效非常显著 芍药苷传统的主要来源是毛茛科植物芍药的根 含量以赤芍为高 含量约3 以植物根部为主 一次性利用 且植物生长周期为5 6年 生产周期长 本课题以牡丹籽粕为芍药苷的来源 每年都可以收获种子 且种子产量高 有明显的经济效益和社会效益 我国是世界上最大的牡丹种植国家 研究表明 牡丹籽亩均产籽300 400公斤 目前产量高达5万吨左右 居世界第一位 目前牡丹产业化利用报到较少 主要集中于牡丹籽油的生产工艺 质控和用途研究方面 而牡丹籽油生产过程中产生的籽粕的开发利用未见详细的研究报到 三 研究内容 三 1 牡丹籽粕中芍药苷类成分的分离纯化和结构鉴定 取1Kg牡丹饼粕过40目筛 用30 乙醇冷浸提取3次 合并提取液 减压浓缩 再用高浓度乙醇沉淀 取上清液浓缩回收溶剂 得到480mL混悬液 过HPD 200A型大孔吸附树脂柱 用50 乙醇洗脱 流出液合并后 各洗脱馏分用半制备型高效液相色谱分离纯化 三 1 牡丹籽粕中芍药苷类成分的分离纯化和结构鉴定 各洗脱馏分用半制备型高效液相色谱分离纯化 分别得到主要的化学成分 包括化合物1 380mg 2 700mg 3 100mg 4 400mg 5 320mg 和6 140mg 图1饼粕提取物的LC MS色谱图 三 1 牡丹籽粕中芍药苷类成分的分离纯化和结构鉴定 对提取物进行LC MS分析 经质谱碎片分析得出 化合物1和3为同分异构体 相对分子质量为642 2和4为同分异构体 相对分子质量为480 对6种化合物进行H NMR分析 谱图见附表 结合文献初步确定了这6种化合物的化学结构 它们分别是 化合物1 6 O D葡萄糖芍药内酯苷 2 芍药内酯苷 3 gentiobiosylpaeoniflorin 4 芍药苷 5 苯甲酸 6 芍药苷元 6种化合物H NMR图 1 6 O D葡萄糖芍药内酯苷 5 苯甲酸 3 gentiobiosylpaeoniflorin 6 芍药苷元 4 芍药苷 2芍药内酯苷 三 2 牡丹籽饼粕中芍药苷类的含量分析 以上述试验中制备出的6种成分的纯品为对照品 建立了一种直接测定牡丹籽饼粕中芍药苷类成分的HPLC分析方法 其色谱条件如下 流动相 A 500 L L甲酸水溶液 B 甲醇含500 L L的甲酸 梯度洗脱程序 min B 0 40 4 40 8 60 15 60 16 40 20 40 DAD检测器 检测波长 230nm 流速 0 8mL min 温度 30 进样量 5 L 峰面积外标法定量 三 2 牡丹籽饼粕中芍药苷类的含量分析 精确称取1 2 3 4 5 6号物质的对照品溶于40 甲醇中 配制成一定浓度的混合对照品贮备液 取上述对照品贮备液 用40 甲醇稀释合适的倍数 按上述的色谱条件重复进样分析 n 5 以评价方法的精密度 取上述对照品贮备液 用40 甲醇稀释 配制不同浓度的系列标准溶液 按上述的色谱条件分析 以进样质量为自变量 X g 峰面积为因变量 Y mv s 分别求出各成分的线性回归方程 相关系数及线性范围 以3倍信噪比 S N 所对应的进样质量求得最低检出限 三 2 牡丹籽饼粕中芍药苷类的含量分析 结果显示 用该方法对饼粕中的芍药苷类成分进行分析 各成分具有较好的分离度 相对标准偏差在1 91 2 72 之间 线性范围在20ng 5000ng之间 最低检出限为3 6ng 16 1ng之间 回归方程的相关系数r介于0 9992 0 9999 6种成分可以在16min之内实现良好分离 HPLC色谱图如图2所示 三 2 牡丹籽饼粕中芍药苷类的含量分析 经与标准品定量分析得出芍药苷的含量大约为15 6mg g 芍药苷同族物总含量大约为26 6mg g 以芍药苷计 1号峰为2 05mg g牡丹籽粕 2号峰为6 95mg g牡丹籽粕 图中成分 1 2 可能是芍药苷同系物 3 未知多酚成分 4 芍药苷 三 3 牡丹籽粕中提取芍药苷的工艺研究 称取一定质量牡丹籽粕 考察不同温度 料液比 乙醇浓度 超声提取时间等因素 以测得样品芍药总苷含量为考察指标 选用L9 34 正交试验 抽滤 残渣按上述条件重复提取一次 抽滤 合并提取液 50 真空水浴浓缩 直至无醇味 4000r min离心15min除去上层悬浮物 备用 三 3 牡丹籽粕中提取芍药苷的工艺研究 通过对表2各因素的综合评价 由表2中极差大小可以看出 影响提取液芍药苷浓度的因素主次顺序为B C D A 随所选水平因素变动 4种因素的最佳组合为A3 B3 C2 D3 这与R的大小排列是一致的 即用10倍于原料的70 乙醇溶液在50 的超声处理30min 芍药苷提取量最高 三 4 芍药苷提取液的纯化研究 95 乙醇处理后树脂 HPD200A HPD100 D 101 D 101A AB 8 做吸附解吸附纯化研究实验 通过静态动力吸附曲线 动态吸附试验筛选树脂 并在此基础上考察上样液浓度对吸附效果的影响和乙醇浓度对洗脱效果的影响 三 4 芍药苷提取液的纯化研究 由表3选用吸附率和解吸率都较高的HPD 200A D101A和HPD100三种树脂 以吸附时间为横坐标 吸附量为纵坐标作图 进行树脂的静态吸附动力曲线分析 结果如图4所示 三种树脂都在1h左右即可达到吸附平衡 但HPD200A吸附量较另两种更高些 所以选用HPD200A进行试验 三 4 芍药苷提取液的纯化研究 上样浓度为8mg ml时泄漏点出现较早且上样量为5倍柱体积时吸附量最大 为88 07mg g 由图可以看出为了使泄露点更早些上样量还可以再大些 如图可以看出20 乙醇不能充分洗脱目标物 40 50 和60 都可将目标物较完全洗出 出于节省试剂和时间以及提高产品纯度的考虑 选用50 乙醇 3 5BV进行洗脱目标物最合适 此条件下芍药苷收率为61 6 芍药苷纯度为50 26 芍药苷同族物总含量占84 2 HPLC法 牡丹籽粕中提取芍药苷工艺流程 牡丹籽粕 糖浆状浸膏 晶体 膏状物 粗品 70 乙醇超声逆流提取 真空浓缩 T 60 用水溶解后石油醚萃取三次 水相真空浓缩 T 60 用洗脱剂 50 乙醇 溶解过硅胶柱真空浓缩放置结晶 重结晶 四 经济效益分析 本项目总投资为1168万元 其中建设投资768万元 流动资金400万元 销售价格90 含量的1 35万元 KG 按年生产6吨计算 本项目生产期年销售收入为8100万元 年平均利税6617万元 年平均税后利润为2835万元 从财务分析数据可见 本项目投资利润率218 60 盈亏平衡点13 53 具有较强的抗风险能力 表明该项目在经济上是可行的 五 专利及查新报告 已受理专利一篇 一种从牡丹籽粕中提取芍药苷的方法 申请号201310044907 3查新结论国内外有从牡丹根 茎 叶中提取芍药苷的报道 除本项目委托单位外 未见与本项目研究内容完全相同的牡丹籽粕中提取芍药苷方法的报道 五 专利及查新报告