培养基制作.doc

四、培养基的制备（一）背景知识介绍细菌和其它生物体一样，在进行培养增殖的过程中，需要一个营养丰富、环境条件适宜的场所。培养基是由适合于细菌生长繁殖的营养物质配制而成的营养基质。制备培养基的目的在于给细菌创造良好的营养条件。由于细菌具有不同的类型，人们对细菌的研究目的也不同，应配制适合不同细菌生长以及按实验要求设计的不同培养基。但从营养角度分析，培养基一般均应含有满足细菌生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐类等。另外，培养基还应具有适宜的酸碱度（pH值）和一定的缓冲能力。1.培养基的类型由于培养基名目繁多，种类各异。一般按培养基的成分、培养基的外观状态、培养基的功能把培养基分为不同的类型。按培养基成分的了解可分为：（1）天然培养基：（基本培养基）是指利用动、植物或其提取物制成的培养基，例如，培养细菌的肉膏蛋白胨培养基、培养酵母菌的麦芽汁培养基等。此种培养基取材方便、营养丰富、种类多样、配制方便。但是其中的成分不甚清楚，不利于做精确的科学实验。我们的实验常使用此类培养基。（2）组合培养基：（合成培养基）是指用多种高纯化学试剂配制成的、各成分的量都确切知道的培养基。例如培养细菌的葡萄糖铵盐培养基；培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基。此培养基价格较贵，配制较烦琐，有利于做精确的科学实验。我们的实验一般都不用。（3）半合成培养基：是在天然培养基中加入少量已知的化学物质配制而成的。如培养细菌的牛肉膏蛋白胨培养基。按培养基外观的物理状态，可分为：（1）固体培养基：在液体培养基中加入12琼脂作凝固剂，就可以制成遇热可融化、冷却可凝固的固体培养基。琼脂又名洋菜，其熔点是96，凝点是40，所以在一般细菌培养温度下呈固体状态。固体培养基在微生物的科研和实验中，具有极其广泛的用途，如菌种的分离鉴定、菌落计数、菌种的保存等。前面的细菌实验研究中，我们主要用此培养基。（2）液体培养基：是指未加凝固剂、呈液态的培养基。其组成成分均匀，细菌能充分接触和利用养料，适宜作生理研究用。（3）半固体培养基：在液体培养基中加入0.20.5的琼脂制成的培养基，可用于观察细菌的运动。按培养基的特殊用途可分为：（1）加富培养基：是指在培养基中加入人血、血清、动植物组织提取液，培养要求比较苛刻的细菌。（2）选择培养基：根据某一种微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学条件的抗性设计的培养基。利用这种培养基可以将所需的微生物从混杂的微生物中分离出来。如根据某菌对碳源、氮源等营养物质的特殊要求设计的培养基，可以分离到能分解某些物质的微生物；在培养基中加入某种化学物质，可以抑制不需要的微生物生长繁殖，如青霉素、四环素、链霉素能抑制细菌和放线菌的生长，结晶紫抑制革兰氏阳性细菌的生长等。选择培养的理化因素有温度、氧气、pH值等。（3）鉴别培养基：是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。2.配制培养基的注意事项首先应注意营养成分的配比要恰当。我们一般按照培养基的配方进行配制即可；其二要注意控制培养条件。各类微生物所要求的pH值不同，细菌生长所需pH值在中性或微碱性（pH在7.07.5）。由于微生物代谢引起培养基酸碱度的变化，往往会造成对生长的抑制。因此，为了保持培养基pH值的相对稳定，要在培养基中加入一些缓冲剂，由K2HPO4和KH2PO4组成的混合物是常用的缓冲剂。其三配制培养基时注意营养物质要有适合的浓度。浓度太低时不能满足生长需要；太高由于渗透压太大，也能抑制生长。3.配制培养基的过程称量溶化调节pH值过滤分装塞棉塞和包扎灭菌。（1）称量：按照培养基配方，准确称取各成分放入烧杯中。有些原料用量少，不易称量，可先配成高浓度溶液，再按比例换算后，取一定量加入烧杯中。（2）溶化：加入所需要的水量搅匀，然后加热使其溶解。有些原料不易溶解，如蛋白胨、牛肉膏等，可先在小容器中加水少许，加热溶解后倒入烧杯中。配制固体培养基时，在琼脂熔化过程中要不断搅拌，并控制火力，防止培养基溢出或烧焦。当培养基完全熔化后要补足水分。（3）调酸碱度（pH值）：先用pH试纸进行比色。如果偏酸或偏碱，可用10HCI和10NaOH调整pH值至所需范围。（4）过滤：培养基中有些成分没完全溶解，则需过滤。常用滤纸、纱布（叠成6层）或纱布间加脱脂棉花过滤。加琼脂的培养基要趁热过滤。（5）分装：根据需要将培养基分装各种不同的容器中。固体培养基都要趁热分装，各容器的量如下：三角瓶：一般不超过1/2；试管：视需要而定，若制斜面一般装管高的1/5或1/4；倒平板一般是用时再倒。分装时应避免培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞而引起污染。（6）塞棉塞和包扎：分装后试管口及瓶口都要塞好棉塞。做棉塞用普通棉花，其形状、大小、松紧与管口和瓶口要吻合，棉塞1/3露于管外，2/3塞进管内。棉塞的制作和塞入的正确方法见图4-7。棉塞塞好后，外包厚纸（牛皮纸一层或用旧报纸二层），用绳捆扎。包扎的作用是避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞，并防止接种前培养基的水分散失或污染杂菌。（7）灭菌：经过分装、包扎的培养基应立即进行灭菌。灭菌的方法一般采用高压蒸汽灭菌，如果没有高压灭菌锅，可采用间歇灭菌法。高压蒸汽灭菌：是常用的灭菌方法，一般培养基、水、玻璃器皿、用具都可用此方法灭菌。其灭菌的原理是：水的沸点可随压力的增加而提高，当水在密闭的高压锅中沸腾时，其蒸汽不能溢出，致使压力增加，水的沸点和温度也随之增高。高压蒸汽灭菌时蒸汽压与温度的关系如下表。在热蒸汽的条件下，细菌的芽孢在120，经2030分钟可全部被杀死。因此，一般培养基灭菌时，在15磅/英寸2蒸汽压、121温度下，30分钟即可达到灭菌目的。如果培养基中有葡萄糖、乳糖、牛奶等不耐高温的物质时，可在8磅/英寸2经1520分钟也可使用，但这样灭菌的培养基，应经过保温培养，检查无菌生长后，及时使用，不宜存放。间歇灭菌：在没有高压灭菌锅时，可采用此方法。其方法是在普通蒸锅中放入培养基，在100的温度下蒸3060分钟。然后放入2530环境中24小时后，再蒸第二次；蒸后再放入2530环境中24小时，然后再蒸第三次。（二）课题提出细菌是单细胞，其个体又小，所需营养并不多，但非常容易受环境影响。又由于微生物除了细菌外，还有放线菌、真菌等，它们和细菌混杂在一起，构成自然界的微生物群。这几种微小生物对营养物质的要求、培养所需的pH值等都有较大的差异。如营养物质中的碳源和氮源的比例上（碳/氮），细菌约为碳5/氮1，而霉菌则为碳10/氮1。而且碳源和氮源的物质也有区别。细菌所需酸碱度为中性或微碱性（7.07.5），霉菌偏酸牲（4.56.0）。我们可以根据细菌对营养等方面的要求和与其它微生物的区别，配制不同的培养基，选择我们需要的菌种。就细菌本身来讲，在营养、温度等方面，不同的细菌也有区别。现在对食用细菌的研究、病原细菌的研究及与工业农业有关的细菌研究上，科研人员都是利用细菌的这些特点，培养和筛选出对人们有利的细菌。我们也可以围绕这方面设计一些课题进行研究。如进行水质调查时和土壤细菌的分离时，能否配制不同的培养基，观察哪种对细菌有利；还可以配制不同的酸碱度，了解细菌最适的pH值是多少；还可以改变培养条件如温度、氧气浓度等，都能作为课题进行研究。（三）活动范例1.活动范例1【活动课题】 鉴别细菌培养基的配制。【课题概述】 土壤中微生物的种类、数量都很多，其中细菌的量是最多的。那么土壤细菌在哪一种培养基中容易生长呢？【活动过程】（1）样品的采集：在肥沃的土壤据地表35cm深度采集新鲜土壤，放入干净的容器中。（2）制备培养基：按下面配方称量。培养基：牛肉膏0.3g 蛋白胨1gNaCI0.5g 琼脂2gpH7.07.5 水100ml培养基：（高氏1号）可溶性淀粉2g 硝酸钾0.1g磷酸氢二钾0.05g 硫酸镁0.05g氯化钠0.05g 硫酸亚铁0.001g琼脂2g 水100mlpH7.07.5培养基：（察氏）蔗糖2g 硝酸钠0.3g磷酸氢二钾0.1g 氯化钾0.1g硫酸镁0.05g 硫酸亚铁0.001g琼脂2g 水100mlpH4.56.0备注：量太少无法称的，可先按现量的10倍或100倍配制，再从中取一定量加入培养基中即可；称牛肉膏、蛋白胨时，可先将玻璃棒和一小烧杯称重，然后用玻璃棒沾取后一起称即可。将上面三种培养基各按配方称量好后，分别放入烧杯中，在酒精灯上分别加热至完全溶化后再放琼脂。继续加热至琼脂溶化（边加热边搅拌）。然后，趁热放入三角瓶中，塞好棉塞，标明是哪种培养基，用牛皮纸或两层旧报纸包好瓶口准备灭菌。将九套培养皿用牛皮纸包好；接种及稀释土壤用的移液管和无菌用水都包好装好；包装好的、七支各装有9ml水的试管；装有99ml水的三角瓶（包装好）和培养基一起进行灭菌。（3）灭菌：打开灭菌锅盖，向锅内加入适量水。将制备好的培养基和需要灭菌的其它用品，一起放入高压灭菌锅中（装有培养基和水的注意要立着放稳）。不要放得太挤，以免影响蒸汽流通。盖好锅盖，采用对角形式均匀拧紧盖上的螺旋，使锅密闭。打开放气阀，开始加热。当锅内产生蒸汽后，放气阀开始有热气排出，自开始产生热气后约3分钟（锅内冷空气已排尽），再关闭放气阀。此时锅内温度随蒸汽压力增高而上升。待压力上升到15磅/英寸2，温度达到120121时，要控制热源，恒温2030分钟，此时必须注意勿使压力继续上升或下降。停止加热，待压力下降至零时，打开放气阀，排出残留蒸汽，打开锅盖，取出灭菌物品。注意事项：灭菌过程中，一定注意排净锅内的冷空气，冷空气排不净时，锅内温度达不到灭菌温度，会影响灭菌效果；操作时，必须严格按操作规程操作，否则容易发生意外事故，应在教师指导下操作。（4）菌悬液的制备：方法按细菌的分离范例中10倍稀释方法，将土壤稀释成10-5、10-6、10-7的菌悬液。（5）接种：将9套培养皿按下面编号。培养基：10-5、10-6、10-7培养基：10-5、10-6、10-7培养基：10-5、10-6、10-7在酒精灯火焰旁，按编号的稀释浓度用移液管吸取1ml菌悬液，放入相应的培养皿中。然后各倒入15ml温度在50（手模瓶壁感到热但不烫手）的培养基，迅速摇动培养皿，使菌液与培养基混均匀，然后平放待其凝固成平板。（6）培养观察：将制好的平板倒置放在3537的恒温箱中，培养1824小时，待平板上长出菌落后，进行观察。从三种培养基平板上的菌落数和菌落的特点进行观察，看哪一种培养基细菌的菌落数多，哪一种细菌的菌落数少。观察结果统计如下：（7）结果的分析。（8）结论。2.活动范例2【活动课题】 水中大肠杆菌的检查。【课题概述】 大肠杆菌是肠道的正常菌群，但如果污染了饮用水，就会使人生病，从而影响人们的健康。因此，往往把水中的大肠杆菌数作为水污染的标志。我们利用大肠杆菌分解乳糖时，产生大量的混合酸，能使伊红与美蓝结合成黑色化合物，使大肠杆菌菌落呈紫黑色并带金属光泽的这一特点，检查池水或湖水和自来水中的大肠杆菌。【活动步骤】（1）采集水样：从池塘或湖中取水放入干净的容器中；用干净的容器接取自来水，迅速加盖。（2）制备培养基：称量时称取其配方量的1/10，配制100ml。乳糖 10g 蛋白胨 5gNaCI 5g K2HPO4 2g2伊红水溶液20ml0.35美蓝水溶液20ml琼脂 2g 水 1000mlPh 7.27.4先在水中加入乳糖、蛋白胨、NaCl、K2HPO4，调节pH值后，加入伊红、美蓝水溶液和琼脂。放入三角瓶中，塞棉塞包扎。8磅/英寸2灭菌20分钟。准备6套培养皿；装有9ml水的试管2支；1ml吸管或移液管5支；均包扎好，与培养基一同放入高压锅进行灭菌。（3）水样稀释：自来水不稀释。将池塘或湖水按10倍稀释法稀释成10-1、10-2备用。（4）接种制备平板：先将培养皿编号：池水（湖水）：未稀释、10-1、10-2自来水：、（三个重复）。用吸管各吸取1ml水样，放入相对应的编好号的培养皿中。倒入温度在50的培养基各15ml，摇匀后放置凝固。倒置于37恒温箱中培养24小时。（5）观察：通过培养，培养基表面长出细菌菌落。菌落中心呈紫黑色，发金属光泽的是大肠杆菌菌落。首先应辨认大肠杆菌菌落，然后观察对比池塘水或湖水的培养基中，大肠杆菌菌落数量与自来水的进行比较。（6）结果分析：池塘水或湖水中的大肠杆菌数量标志着水被污染的程度。自来水中应没有或偶尔有一个（标准是不得超过3个/1000ml）。（7）结论。（四）问题与思考1.细菌和其它微生物对酸碱都有一定的要求，在配制培养基时，可将其调成不同的酸碱度，观察在酸性、中性、碱性环境生长状况。观察哪种酸碱度最适细菌生长。2.培养基中的抗菌素会不会对细菌的生长有抑制作用呢？哪种抗菌素的作用最大。可将不同的抗菌素加入培养基中制成平板培养后观察，或进行液体培养后镜检，通过检查细菌的密度判断对细菌的影响。3.对培养基进行灭菌时，要将锅内的冷空气排净，那么，不排净会怎样呢？湿热灭菌时，不等冷气排净即关闭放气阀，并达到灭菌压力。24小时后观察结果。4.培养不同的微生物所需营养物质不同，你培养的细菌最适的培养基是哪一种？除了常用的几种培养基外，根据细菌的营养要求你能设计几种经济、方便、实用的培养基吗？可尝试着作几种进行对比。5.不同的细菌对温度、无机盐的浓度要求不同。可以从不同的地方如冰箱中、室温、高温环境中采取样品，接种在平板上进行培养观察；也可配制不同盐浓度的培养基，接种细菌进行培养，看细菌生长如何。【附录】1.微生物的菌落特征细菌菌落特征：菌落形态包括大小（差异大，从1mm到铺满整个培养皿）、形状（有圆形、不规则形、卷发状、假根状等）、边缘（整齐、泼状、锯齿状）、隆起（扩展、台状、低凸、乳头状等）、光泽（有或无）、质地（较粘、较脆）、表面（光滑、粗糙等）、颜色（一般呈灰色，也有白、黄、红、绿、棕色等）。放线菌菌落特征：由菌丝体组成。质地致密，表面呈较密的绒状或坚实、干燥、多皱，菌落较小而不广泛延伸。菌落与培养基结合较紧，不易被挑起，或整个菌落被挑起而不致破碎。酵母菌菌落特征：与细菌相似，但较细菌菌落大而厚些，菌落表面湿润、粘稠，易被挑起。菌落颜色多呈乳白色，只有少数为红色。霉菌菌落特征：菌落由分支状菌丝组成。菌丝较粗而长，形成的菌落较松，成绒毛状、絮状或蜘蛛网状，一般比细菌的菌落大几倍到几