第四章_灭菌与除菌★★★★.ppt

第四章工业发酵灭菌 现代发酵技术 完整发酵生产工艺流程 1 原料的选择和预处理 2 微生物菌种的选育和种子扩大培养 3 培养基的配制和灭菌 4 无菌空气的制备 5 发酵 6 产物的分离提取 7 产物的精制干燥 8 废物的回收利用 现代发酵技术 染菌的危害 一 经济上巨大损失 消耗营养 分解产物 抑制产生菌生长 产物合成下降 影响提取 影响产品外观及内在质量 扰乱生产秩序 破坏生产计划 影响工人的情绪和生产积极性 现代发酵技术 染菌的危害 二 生产危害 杂菌使生产菌菌体自溶产生大量泡沫 影响发酵过程的通气搅拌 造成逃液 发酵液发粘 过滤时不能或很难形成滤饼 过滤困难 染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白和其它杂质 采用有机溶剂萃取的提炼工艺 则极易发生乳化 很难使水相和溶剂相分离 影响进一步提纯 现代发酵技术 染菌的危害 实例 谷氨酸发酵过程中混入放线菌 则放线菌分泌的抗生素就会使大量的谷氨酸棒状杆菌死亡 染芽孢杆菌 芽孢耐热 不易杀死 往往一次染菌后会反复染菌 青霉素发酵染菌绝大多数杂菌都能被青霉素诱导而产生青霉素酶 不论在发酵前期 中期或后期 染有能产生青霉素酶的杂菌 都能使青霉素迅速破坏 现代发酵技术 工业发酵灭菌 消除杂菌要求 培养基灭菌发酵罐及附属设备灭菌空气灭菌 现代发酵技术 第一节灭菌的方法 定义 灭菌 指用化学或物理方法杀灭或除掉物料及设备中所有生命体的工艺过程 包括微生物的营养体和芽孢 消毒 用物理化学方法杀死环境中的病源微生物 现代发酵技术 第一节灭菌的方法 分类加热灭菌化学药品灭菌辐射灭菌过滤除菌 现代发酵技术 一热灭菌法 现代发酵技术 现代发酵技术 干热灭菌 1 干热灭菌法 将金属制品或清洁玻璃器皿放入电热烘箱内 在150 170 下维持1 2小时后 即可达到彻底灭菌的目的 在这种条件下 可使细胞膜破坏 蛋白质变性 原生质干燥 以及各种细胞成分发生氧化 灼烧 是一种最彻底的干热灭菌方法 但它只能用于接种环 接种针等少数对象的灭菌 现代发酵技术 2 湿热灭菌法 湿热灭菌法比干热灭菌法更有效 多数细菌和真菌的营养细胞在60 左右处理5 10min后即可杀死 酵母菌和真菌的孢子稍耐热些 要用80 以上的温度处理才能杀死 而细菌的芽孢最耐热 一般要在120 下处理15min才能杀死 现代发酵技术 干热与湿热穿透力及灭菌效果比较 现代发酵技术 蛋白质含水量与凝固所需温度 现代发酵技术 蒸汽压力与蒸汽温度换算关系 现代发酵技术 常见的湿热灭菌法 煮沸灭菌法巴氏灭菌间歇灭菌高压蒸汽灭菌 现代发酵技术 A 常压法 煮沸灭菌法 100 下保持15 20分钟 一般不能杀死芽孢 巴氏消毒法是一种低温消毒法低温 60 62 下保持30分钟可进行牛奶消毒 高温 72 下保持15分钟即可 现代发酵技术 间歇灭菌法 又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法 适用于不耐热培养基的灭菌 方法是 将待灭菌的培养基在80 100 下蒸煮15 60分钟 以杀死其中所有微生物的营养细胞 然后置室温或37 下保温过夜 诱导残留的芽孢发芽 第二天再以同法蒸煮和保温过夜 如此连续重复3天 即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果 现代发酵技术 B 加压法 盛有适量水的加压蒸汽灭菌锅加热煮沸 彻底驱尽后将锅密闭 再继续加热至121 维持15 20分钟 也可采用在较低的温度115 下维持30分钟的方法 此法适合于一切微生物学实验室 医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材 物料的灭菌 现代发酵技术 湿热法灭菌要点 注意事项 排净冷空气 灭菌终了 缓慢降压 灭菌结束 趁热取出物品 现代发酵技术 C 连续加压灭菌法 在发酵行业里也称 连消法 此法只在大规模的发酵工厂中作培养基灭菌用 主要操作 将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热 维持和冷却 然后才进入发酵罐 培养基一般在135 140 下处理5 15秒钟 现代发酵技术 高温灭菌的操作 高温短时间灭菌高压蒸汽灭菌能有效地杀灭杂菌 也能破坏营养成分 热的作用下 某些营养还相互发生反应 甚至生成毒物 灭菌中 温度升高 菌体死亡速率的增加远大于营养成分破坏的增加 现代发酵技术 二 辐射灭菌 紫外线 X射线等 原理 高能量的电磁辐射和微粒辐射使核酸 蛋白质和酶变性 适用 表面 局部空间 现代发酵技术 三 化学物质灭菌 甲醛 苯酚 高锰酸钾 洁尔灭等 原理 蛋白质变性 酶失活 破坏细胞膜透性 适用 厂房 无菌室 器具等的消毒 现代发酵技术 四 臭氧灭菌 无污染消毒剂 原理 利用臭氧的氧化作用灭菌 适用 洁净室及净化设备 现代发酵技术 五 过滤灭菌 醋酸纤维 尼龙 聚丙烯等 原理 微孔滤膜 适用 热敏性物质 空气 现代发酵技术 第二节培养基和发酵设备的灭菌 灭菌方法 湿热灭菌一培养基灭菌条件1 灭菌温度和时间的选择2影响培养基灭菌效果的因素二 发酵培养基的灭菌 一 分批灭菌 二 连续灭菌 现代发酵技术 高温对培养基成分的有害影响及其防止 现代发酵技术 1 灭菌温度和时间的选择 a 微生物的热致死温度应高于该温度 通常以芽孢为准 b 营养成分的破坏灭菌的过程实质上也是营养成分破环的过程 保证灭菌效果的前提下 尽可能减少培养基中营养成分的破坏 应采用高温短时灭菌 现代发酵技术 1 灭菌时间的确定在一定温度下 微生物热死遵循分子反应速度理论 因此对数穿透定律是指在灭菌过程中 活菌数逐渐减少 其减少量随残留活菌数的减少而递减 也就是说微生物的死亡速率与任一瞬间残存的活菌数成正比 dN dT kN 现代发酵技术 一级反应动力学 dN dT kNN 残留的活菌数K 灭菌死亡速率常数 S 1或min 1T 灭菌时间 s或min 现代发酵技术 在恒定灭菌温度下 对某一种微生物而言k可为常数 对两边积分 得对数残留定律公式 dN dT kN 现代发酵技术 例1 有一发酵罐内装40m3培养基 在121 温度下进行实罐灭菌 原污染程度为每1ml有2 105个耐热细菌芽孢 121 时灭菌速度常数为1 8min 1 求灭菌失败机率为0 001时所需要的灭菌时间t 解 N0 40 106 2 105 8 1012 个 Nt 0 001 个 k 1 8min 1 则 灭菌时间 现代发酵技术 应注意的问题 1 灭菌时间取决于污染程度 N0 灭菌程度 Ns 2 灭菌程度即残留菌数 如果要求完全灭菌 即Ns 0 则t接近于无穷大 这在事实上是不可能的 故在工程上进行灭菌设计时常以Ns 10 3 也就是每处理1000批培养基只允许一次失败作为计算的依据 3 灭菌速率常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据 随物种和灭菌温度而异 在相同温度下 k值越小 微生物越耐热 4 同一种微生物在不同灭菌温度下 k值不同 灭菌温度越低 K值越小 灭菌温度越高 K值越大 现代发酵技术 培养基灭菌温度的选择 培养基灭菌过程中 除微生物被杀死外 还伴随着培养基成分被破坏 在加热下氨基酸及维生素等受破坏 在生产中必需选择既能达到灭菌目的 又能使培养基成分破坏减至最少的条件 灭菌过程微生物死亡是属于一级反应动力学类型 在其它条件不变时 反应速度常数 与温度的关系可用阿累尼乌斯方程式表示 A为比例常数 E为杀死细菌所需活化能 R为气体常数 T为绝对温度 K 现代发酵技术 以lgk对1 T标绘得一直线 其斜率为截距为lgA 从斜率和截距可求得A和E 现代发酵技术 培养基成分受热破坏是化学分解反应 符合一级动力学反应 可用下式表示 t 培养基成分受热破坏是化学分解反应 符合一级动力学反应 可用下式表示 c为反应物浓度 mol L t为反应时间 min k 为化学反应速度常数 min T为绝对温度 K 现代发酵技术 在化学反应中 其他条件不变时 反应速度常数与温度的关系也可用阿累尼乌斯方程式表示 在灭菌时 当温度变化 菌体死亡速度常数k和培养基成分破坏速度常数k 都发生了改变 温度由T1升高到T2 k值分别为 现代发酵技术 同样 灭菌时 培养基成分的破坏也可得类似关系 所以 现代发酵技术 杀灭细菌芽孢的活化能E大于B族维生素破坏的活化能E 见下表 因此 大于 即随着温度上升 灭菌速率常数增加倍数大于培养基成分分解的速度常数的增加倍数 也就是说 温度升高 菌死亡速率大于培养基成分破坏的速率 达到相同的灭菌效果 提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间 并可减少培养基因受热时间长使营养成分遭到破坏的损失 不同温度的灭菌时间及培养基营养成分的破坏情况 见表 现代发酵技术 在实际生产中以芽胞的死亡作为灭菌的依据 不可能绝对杀灭微生物 无活菌残留 一般要求微生物污染降低到处理1000罐中只残留1个活菌 此数已能满足生产的要求 现代发酵技术 二 影响培养基灭菌的因素 1 培养基成份 油脂 糖类及一定浓度的蛋白质会提高微生物的耐热性 高浓度有机物会在细胞周围形成一层薄膜 影响热的传入 所以灭菌温度高些 例如 大肠杆菌在水中加热60 65 便死亡 在10 糖液中 需70 4 6min 在30 糖液中70 30min 1 2 的NaCl溶液对微生物有保护作用 随着浓度的增加 保护作用减弱 如浓度超过8 10 则微生物的耐热性降低 现代发酵技术 二 影响培养基灭菌的因素 2 培养基的物理状态 液体培养基中除热的传道传递外 还有对流 所以比较容易灭菌 而固体则比较难于灭菌 培养基中的颗粒小 灭菌容易 颗粒大 灭菌难 一般含有小于1mm的颗粒对培养基灭菌影响不大 但颗粒大时 影响灭菌效果 应过滤除去 现代发酵技术 3 pH值的影响pH值对微生物的耐热性影响很大 pH为6 0 8 0时微生物最不易死亡 pH 6 0时氢离子易渗入微生物的细胞内 现代发酵技术 4 培养基中微生物数量微生物数量越多 灭菌需要的时间越长 灭菌难度越大 5 微生物细胞中含水量微生物含水量越高 细胞内的蛋白质凝固温度越低 越容易受热而丧失生命力 6 微生物细胞的菌龄年轻细胞含水量高 年老细胞含水量低 所以年老细胞不容易被杀死 现代发酵技术 7 微生物的耐热性不同微生物的耐热性不同 细菌芽孢最强 营养体最弱 放线菌 霉菌比细菌营养体要强 8 空气排除情况 现代发酵技术 二 培养基的灭菌方法 分批灭菌连续灭菌 现代发酵技术 1 分批灭菌 实罐灭菌 定义 将配置好的培养基加入发酵罐内 直接用蒸汽加热 达到灭菌要求的温度和压力后维持一定的时间 再冷却至发酵所需温度 优点 不需要其他附属设备 操作简便 是国内外生产中常用方法 缺点 加热和冷却时间长 营养成分有一定损失 罐利用率低 不能采用高温快速工艺 现代发酵技术 1 分批灭菌 实罐灭菌 过程分批灭菌三个过程 升温 保温和冷却 发酵罐容积越大 加热和冷却时间越长 这两段时间也在灭菌 灭菌主要在保温过程 t总 t1 t2 t3 t1 t2和t3分别表示加热 维持和冷却所需要的时间 现代发酵技术 3灭菌的主要步骤 1 培养基的输送 通过专用管道输入发酵罐中 2 灭菌前的准备工作 检查水 电 气以及发酵罐的密封性是否正常 将空气过滤器灭菌 灭菌后将过滤器装上发酵罐 现代发酵技术 3 加热 控制进水阀和出水阀 调节水压使水压表指针指示在0 25 0 3之间 使水充满加热器 防止烧坏加热器 打开发酵罐的总电源 打开搅拌器的电源开关 使搅拌器转速控制在300 350rpm 打开温度控制器的电源开关 现代发酵技术 4 保温 121 灭菌30min 5 冷却 灭菌结束后 发酵罐会自动降温 当温度低于90 时 通过无菌操作 安装好已灭菌的空气过滤器 然后 通入无菌空气 使培养基快速降温 并使发酵罐保持一定的正压 以减少污染 当温度低于35 时即可接种发酵 现代发酵技术 二 连续灭菌 连消 定义 培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌 冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程 主要操作 将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热 维持和冷却 然后才进入发酵罐 培养基一般在135 140 下处理5 15秒钟 现代发酵技术 二 连续灭菌 连消 优点 可用高温快速灭菌发酵罐利用率高热能利用合理 自动化控制缺点 不适合粘度大或固型物含量高的培养基 增加操作环节 增加染菌机会 现代发酵技术 培养基预热 配制罐或预热罐 60 75 C 避免料液与蒸汽温差过大而产生水汽撞击 连续灭菌 连消塔 126 132 C 20 30S 保温 维持罐 5 7min 冷却 冷水喷淋冷却至40 50 C 3 培养基连消工艺流程 现代发酵技术 1 连消塔加热灭菌的连续灭菌流程 现代发酵技术 套管式连消塔 现代发酵技术 维持罐 现代发酵技术 不同灭菌方式温度的变化 连消 实消 现代发酵技术 第三节空气除菌 发酵中的通气每立方米发酵液每分钟通气0 8m3 培养周期170h 每个周期需通气2 86 105m3 空气成分氧气 氮气 二氧化碳 惰性气体 水蒸气及灰尘 细菌等 空气中的微生物每立方米大气中约有103 104个微生物 城市多于农村 夏季多于冬季 通常细菌芽孢 霉菌孢子居多 空气中的微生物一般附着在尘埃 雾滴上 现代发酵技术 一 空气除菌方法 1 加热灭菌 采用加热手段 电 蒸汽 空压机 将空气加热到灭菌温度进行灭菌 2 静电电除菌 被电离的空气离子在向电极快速移动过程中撞击上空气中的尘埃 菌体后 使菌体 尘埃移向电极 最终沉降吸附在电极上 以达到除尘除菌的目的 3 介质过滤除尘 除菌把空气中的各种微粒和极少量的游离微生物用过滤介质捕集起来予以清除方法 现代发酵技术 1 加热灭菌 蒸汽 电 既不经济 又不安全 空气压缩机 可行 对于无菌程度要求不高 利用空气压缩产热灭菌 PV nRT 现代发酵技术 2 静电除菌 原理 含灰尘和微生物的空气通过高压直流电场 气体电离 产生的离子使灰尘和微生物等成为载电体 捕集于电极上 特点吸附于电极上的颗粒 油滴和水滴等要定期清洗 特点 能耗低 捕集效率高 设备庞大 现代发酵技术 3 介质过滤除菌 绝对介质过滤深层介质过滤 现代发酵技术 1 绝对过滤 定义介质之间的空隙小于被滤除的微生物 当空气流过介质层后 空气中的微生物被滤除 介质的空隙小于0 5 m 从可靠性 经济性 可操控性上不如深层介质过滤 现代发酵技术 2 深层介质过滤除菌介质 除菌原理惯性冲击作用阻截作用布朗扩散重力沉降静电吸附 现代发酵技术 1 惯性冲击作用 当微生物等颗粒随空气以一定的速度流动在接近纤维时 气流碰到纤维而受阻 空气就改变运动方向绕过纤维继续前进 微生物等颗粒由于具有一定的质量 在以一定速度运动时具有惯性 碰到纤维时 由于惯性作用而离开气流碰在纤维表面上 由于摩擦 粘附作用 被滞留在纤维表面上 这叫做惯性滞留作用当气流达到一定速度时 它是介质过滤除尘的主要作用 现代发酵技术 2 阻截作用 在气流速度在临界速度以下 由于速度很低时 在纤维周边形成一层边界滞留区 在滞留区内气流速度更慢 在滞留区内的颗粒缓慢接近纤维 并与之接触 由于摩擦 粘着作用而被滞留 这种作用称为阻截作用 现代发酵技术 3 布朗运动 很小的颗粒在流动速度很慢的气流中能产生一种不规则直线运动 称为布朗运动4 重力沉降 当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时 微粒就沉降 5 静电吸附 很多微生物都带电荷 譬如枯草芽孢杆菌孢子中20 带正电荷 15 带负电荷 受摩擦产生的静电吸引而沉降 现代发酵技术 各种机理各自所作贡献的大小 一般认为惯性冲击截留 拦截滞留截留和布朗运动截留的作用较大 而重力和静电引力的作用则很小 特点 介质空隙大于微生物 必须一定厚度才能达到过滤除菌的目的 所以称为深层过滤除菌 深层过滤除菌的作用比较 现代发酵技术 深层介质过滤除菌介质 滤材要求 耐高温高压 不易被油水污染 除菌效率高 阻力小 成本低 易更换等 常用 棉花 棒状活性炭 玻璃棉 超细玻璃纤维纸 石棉滤板等 现代发酵技术 空气过滤除菌的介质 滤材要求 耐高温高压 不易被油水污染 除菌效率高 阻力小 成本低 易更换等 常用介质 纤维状或颗粒状过滤介质棉花 玻璃纤维 活性炭 超细玻璃纤维纸 石棉滤板烧结过滤介质新型过滤介质 微孔滤膜类过滤介质 活性炭 微孔滤膜 现代发酵技术 过滤器的失效 过滤介质失效 活性炭灰化 棉花粉末化 造成漏风尘饼堵塞介质造成压降过大 过滤缓慢 现代发酵技术 穿透率 P 为 过滤效率 过滤前空气中的微粒数 过滤后空气中的微粒数 介质除菌效率 实际生产中取N2为0 001 即1000发酵只有一次染菌 现代发酵技术 影响介质过滤的效率 介质种类介质的直径与粒度介质填充厚度介质填充密度空气的流速空气中微粒的大小 现代发酵技术 提高过滤除菌效率的措施 设计合理的空气预处理设备 选择合适的空气净化流程 以达到除油 水和杂质的目的 设计和安装合理的空气过滤器 选用除菌效率高的过滤介质 保证进口空气清洁度 减少进口空气的含菌数 降低进入空气过滤器的空气相对湿度 保证过滤介质能在干燥状态下工作 现代发酵技术 空气过滤器类型 1 分类1 以纤维状物 棉花 玻璃纤维 涤纶 微尼纶等 或颗粒状物质 如活性炭 为介质所构成的过滤器 特点 过滤层厚度大 体积大 压力降大 操作麻烦2 以