禽流感病毒变异的分子机制

禽流感病毒变异的分子机制摘要：禽流感（Avian Influenza，AI)）是由正粘病毒科A型流感病毒引起的全身性或呼吸器官性传染病，国际兽疫局（OIE）把该病定为A类烈性传染病。禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)典型的病毒粒子为球形，直径80120nm，有时呈丝状体等多形态，至今A型流感病毒的血凝素（HA）已发现有16种，神经氨酸酶（NA）有10种。其血清型较多，容易变异。常发生在禽，有时也发生在低等哺乳类动物，至今在人仅有偶发病例。禽流感病毒根据其对鸡致病性的不同分为高致病性、中致病性和低/非致病性。禽流感病毒不仅会给养禽、畜牧业带来灾难性的破坏，而且对公共健康也构成了严重威胁1,2。国内外对禽流感病毒的基因组结构、病毒蛋白的结构与功能以及病毒变异的分子机制进行了大量深入研究，现就禽流感病毒变异的分子机制进行综述。关键词：禽流感病毒，血凝素，神经氨酸酶，变异，分子机制1 AIV基因组及其编码蛋白1.1 AIV基因组AIV基因组为单股负链RNA，共有8个独立的RNA节段。通过对某些毒株8个节段的测序，发现它们存在一些共同的特点，即所有基因节段的5端前13个核苷酸均相同，3端也有12个高度保守的核苷酸。另外在每一节段靠近5端1521位核苷酸处有一保守区。其序列为Poly U。这一序列可以在病毒mRNA合成时产生Poly A。1.2 AIV的结构蛋白AIV粒子的结构蛋白共有10种，由8个基因组片段编码，分别为： HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NS2、PB1、PB2、PA。它们分别构成病毒基因组复制所需要的酶类和感染细胞时吸附受体的纤突以及维持病毒形态的基质膜等，分别阐述如下：血凝素(HA) 是构成病毒囊膜纤突的主要成分之一，是典型的1型糖蛋白，在病毒吸附及穿膜过程中以及决定病毒致病力方面均起关键作用，可刺激机体产生中和抗体，是禽流感病毒中最为重要的保护性抗原；还可以刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。此外，HA 在决定病毒的宿主特异性方面也有重要作用。神经氨酸酶( NA)是构成病毒囊膜纤突的另一个重要蛋白成分，属于2 类糖蛋白( 氨基端在囊膜内, 羧基端在囊膜外)。NA不仅在流感病毒复制过程中发挥重要作用, 而且其活性位点在甲型流感病毒上具有高度保守性。因此，目前正在研制的许多新型抗流感病毒药物均以NA 为药物效应的靶点。核蛋白( NP)是一种单体磷酸化的多肽，是构成病毒核衣壳的主要蛋白成分，与3种聚合酶蛋白( PB1、PB2、PA) 和基因组RNA 一起构成核壳体蛋白(RNP)。NP具有特异性, 是流感病毒划分A、B、C 型的主要依据, 在病毒基因组的转录和复制以及决定宿主特异性等方面都有重要作用。基质蛋白( M1、M2 ) 属于非糖基化蛋白，M1是维持病毒形态的结构蛋白，具有型特异性，其抗原性的差异也是流感病毒分型的依据之一。另外， M1在子代病毒粒子的装配方面也有一定的作用，同时对核糖核蛋白起保护作用；M2在病毒子脱核衣壳时具有选择性离子通道作用。非结构蛋白（NS1、NS2）是A 型流感病毒的两种非结构蛋白，NS1参与病毒复制过程，在早期感染中NS1合成并在细胞核内积聚。NS2主要在晚期感染中出现，并主要在胞浆中存在。NS2 具体功能不详，尚待以后的深入研究。聚合酶蛋白( PB1、PB2、PA) 在基因组成和功能上各不相同：PB1由片段2 编码，是在病毒mRNA 合成起始后使之逐渐延长；PB2 由片段1编码，是在病毒mRNA 转录的起始阶段识别并结合在5端型帽状结构上， 同时是有限制性内切酶的活性，参与宿主mRNA 帽状结构的切割；PA 由片段3 编码。其他蛋白（HE、M3、NB）由基因片段7编码，确切的功能还不清楚3。2 AIV变异的研究进展AIV在长期进化过程中获得了能很快适应环境的各种变异，主要包括抗原性变异、毒力变异、耐药性变异、形状变异及对理化因素抵抗力的变异等，其中抗原性变异机制有4种，即抗原漂移、抗原转变、缺损颗粒干扰和RNA重组4,5。2.1 抗原性变异AIV的抗原性变异主要是指病毒表面HA和NA的抗原性变异，尤其是HA变异，故而HA抗原特性及结构的改变与AIV抗原性变异密切相关，其机理涉及分子水平的抗原漂移和抗原转变、缺损颗粒干扰和RNA重组。2.1.1 抗原漂移 抗原漂移(Antigen drift)是基因组自发点突变引起的小幅度变异，导致氨基酸改变积累到一定程度或突变氨基酸上正好使抗原决定簇改变，从而引起抗原性变异。由于RNA依赖的RNA聚合酶缺乏矫正功能，出错率较高，因此RNA病毒的突变率比DNA病毒高。在A型流感病毒中，抗原漂移是由血凝素和(或)神经氨酸酶基因发生点突变引起的，其中血凝素基因的变异率最高，每个核苷酸在每个复制周期中的变异率可高达210-3。影响抗原漂移的内因还有核苷酸序列丢失或插入造成的点突变，病毒含有的8个不同节段可能会因细胞酶促活性造成核苷酸断裂，然后在连接酶作用下重新连接，从而引起变异。引起抗原性变异的外因主要是免疫压力和气候异常。王泽霖等6对1998-2002年间5株河南地方分离株(H9N2)进行了抗原漂变的研究，发现与早期抗原相比，所有的变化都发生在HA蛋白的抗原表位的氨基酸，表现出了抗原漂移。2.1.2 抗原转变抗原转变(Antigen shift)是突变幅度较大导致产生的新亚型。造成抗原转变的原因主要有：不同亚型病毒同时感染同一宿主细胞时，病毒基因组可发生节段变换。AIV在不同个体、不同品种之间可相互传播，且同一群禽类中，往往同时存在两种以上的亚型感染，即双重感染或多重感染。在重组病毒中含有的基因可以决定人的感染性的禽流感病毒HA糖蛋白，后者对大多数人群无免疫力7。通过中间宿主产生来自不同宿主的流感病毒，在同一宿主体内产生新亚型，如猪被认为是禽流感病毒和其他不同流感病毒的混合器，因为猪细胞同时具有禽流感病毒受体和人流感病毒受体，是禽流感病毒基因重新分配的活载体。Castmcci认为欧洲禽H1N1和人H3N2在猪群中并存是始于1979年，最终在猪体内发生重组，感染荷兰一名儿童，从而证实了发生在猪体内的禽流感病毒和人流感病毒的基因重组8,9。其他因素Webster等学者认为中国华南地区特有的生态环境和生活方式决定了该地区不仅是中国禽流感病毒的发源地，同时也是世界流感的发源地10。2.1.3 缺损颗粒干扰缺损颗粒干扰，也称“不完全”病毒，它能干扰正常病毒的复制，导致病毒出现不同程度的抗原性变异，这种现象也称为Von Magnus氏现象。2.1.4 RNA重组RNA重组是病毒负链RNA分子内的重组，在感染细胞内细胞mRNA插入替代部分血凝素片段而导致子代病毒获得致病力，这种方式比较罕见，但却提供了病毒快速进化的一种模式。2.2 AIV毒力变异机制禽流感病毒毒力变异大，不同亚型，毒力不同，同一亚型内的不同毒株及同一毒株感染不同宿主，其毒力也不尽相同。1978年Bean和Webster认为HA基因、NA基因、聚合酶PB1和NP的基因共同参与决定AIV毒力；Rott和Scholtisse也认为毒力变异是多基因作用的结果。1981年。Ogawa和 Ueda分析禽流感强毒株和弱毒株时，发现HA基因起决定性作用，Lazarowitz和Klenk进一步研究发现HA裂解活性与裂解位点上游的氨基酸的组成和裂解位点附近的糖链的存在有关。2.2.1 血凝素基因与毒力变异编码血凝素的片段4是基因组中变异率最大的一个片段，禽流感病毒的毒力强弱主要体现在血凝素基因的变异，高致病力毒株通常由非致病力毒株的血凝素变异而来，血凝素能否被裂解为HA1和HA2是决定病毒致病力的主要原因。血凝素裂解位点插入的碱性氨基酸数量及裂解位点附近糖基化改变均可影响病毒的致病性，同时血凝素的稳定性直接决定着禽流感病毒的稳定性及能否获得气溶胶呼吸道传播的特性。2.2.2 神经氨酸酶序列与毒力变异神经氨酸酶是禽流感病毒的另一个主要表面抗原，在病毒感染宿主细胞时，主要起着识别细胞表面流感病毒受体及促进病毒进人靶细胞内的作用。Matrosovich等研究发现，禽流感病毒为适应新宿主而改变血凝素受体结合活性的同时会伴随着神经氨酸酶序列的改变，说明血凝素和神经氨酸酶在功能方面的旺配对病毒感染至关莺要，如N1亚型禽流感病毒常通过神经氨酸酶颈部氨基酸的缺失来调节神经氨酸酶活性，神经氨酸酶领部氨基酸缺失后其酶活性也相应降低。2.2.3 非结构蛋白基因组与毒力变异非结构蛋白由片段8编码，可编码2种蛋白质，即NS1和NS2。非结构蛋白在感染的细胞内具有固定功能，若改变非结构蛋白基因组结构可影响病毒逃逸宿主细胞干扰素作用的能力，这表明非结构蛋白基因可能是一个毒力因子。野外分离的禽流感病毒的某些毒株，其NSI的羧基端有氨基酸缺失现象。2.2.4 聚合酶与毒力变异聚合酶由PA、PB1和PB2构成，PB1-F2是存在于PB1上的潜在重叠基因，是2001年Chen等学者发现的第11种功能蛋白，试验结果表明它能诱导细胞凋亡，推测其能损害细胞内部的能量工厂线粒体，杀死单核细胞，从而使机体无法对抗禽流感病毒的攻击。也从另一面证明了新基因形成的进化规律。另外，Subbarao等在研究中推测病毒PB2的第627位氨基酸变化会对宿主特异性产生直接影响，禽流感病毒为谷氨酸，而人流感病毒为赖氨酸11,12。因此，PB2单个氨基酸的变化就能导致毒力发生很大变异。2.3 耐药性变异 生物遗传化规律研究进展基质蛋白包括基因组片段7编码的2种蛋白，即M1和M2。M1除了作为结构蛋白外，还参与调控病毒的转录和被感染细胞的胞核与胞浆间的物质转运。M2在内核体里的病毒子脱核衣壳时发挥离子通道作用，促使离子进入病毒子，解除蛋白质之间(主要是M1与核蛋白)的作用。Okada A等报道，M2的跨膜区内具有抗流感病毒药物金刚烷胺的作用位点，金刚烷胺是通过M2的跨膜区第3l位丙氨酸、第37位组氨酸、第41位色氨酸来阻断M2 H+通道作用的。此外，神经氨酸酶第274位氨基酸残基突变可形成对奥塞米韦的抗药性13。2.4 形状变异及对理化因素抵抗力的变异流感病毒多形性是一种遗传特征，可能与活力和传播途径有关。禽流感病毒呈球形，直径为80-100nm，起初分离为长丝状，直径20nm，长达300-3 000nm。研究发现，M1的氨基端和羧基端区域又决定长丝状病毒粒子的功能，并且M1与血凝素、神经氨酸酶相互作用共同维持病毒粒子的稳定性。3 小结综上，禽流感病毒变异是由多种因素引起的，抗原性变异、毒力变异、耐药性变异、形状变异及对理化因素抵抗力的变异等都可能单独或共同诱发病毒变异。如位于AIV HA头部末端的带状受体结合位点的变异既影响宿主的特异性又影响毒株的抗原性改变6。禽流感病毒有血清型众多、不同毒株间毒力差异大，低致病性毒株能突变为高致病性毒株等特点，并且在长期进化中禽流感病毒在不断进行能很快适应环境的各种变异5,6。分子生物学的发展为禽流感的诊断和病毒粒子的研究提供了多种先进技术手段，并加深了对禽流感病毒的分子水平的认识，但对病毒变异的分子机制仍有很多问题需要继续研究和探讨。参考文献：1 薛金艳, 王清路等. 禽流感病毒的分子生物学研究进展J. 现代农业科技. 2009(11): 216-217.2 张 平, 边旭等. 禽流感病毒的分子生物学研究进展J. 兽医研究. 2008(6): 32-34.3 沈克姑, 田淑琴. 禽流感病毒的分子生物学研究进展J. 四川畜牧兽医. 2007(10):29-30.4 李建丽, 马仲彬等. 禽流感病毒遗传变异及其分子机制J. 中国动植物检疫. 2004, 21(6):44-46.5 赵 国, 鹿欣伦等. 禽流感病毒生物遗传进化规律的研究进展J. 黑龙江畜牧兽医. 2010(2):32-33.6 王泽霖, 刘 岩等. H9N2亚型禽流感病毒抗原性变异的研究J. 中国兽医学报, 2007,27(3):351-354.7 孙丽娜, 梁米芳. 禽流感病毒跨种属感染及其分子机制研究进展J. 中华实验和临床病毒学杂志, 2008, 22(2): 146-148.8 Manuguerra IC, Hannoun C, Influenza: interspecies transmissions and viral: arrangement. Bull Acad Natl Med, 1997, 181: 421-430.9 Castrucci MR, Webster RG. Genetic reassortment between avian and human influenza A viruses in Italian pigs. Virology, 1993, 193: 503-506.10 Webster RG, Bean WJ, Gorman OT, ea al. Evolution and Ecology of influenza A VirusesJ. Microbiolo. Rev, 1992, 56(1): 152-179.11 Subbarao EK, London W, Murphy BR. A single am