噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用.doc

噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面1。1988年2他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。1990年,他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列3。这样就建立了噬菌体表面展示的随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领域,并带来广泛而深远的影响。传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。根据所需要的药物特性,选用适当的方法构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步优化设计,最终确定候选的药物结构。近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法4,即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具有较高特异性和亲和力的理想目的肽。通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受体及其他化合物等新型药物或先导化合物。这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,将药物开发带入了一个崭新的时代。1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。在多数情况下,几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过局部残基肽段间的相互作用来实现的。1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与噬菌体和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。1985年,Smith描述了外源肽段在丝状噬菌体fd表面的展示结果。1988年,他们建立了新的表达载体可选择抗体的丝状噬菌体fd载体,能将外源短肽表达并伸展到噬菌体表面,用亲和筛选可选到表达特异肽的噬菌体,通过测定噬菌体序列,就可以知道所表达肽段的氨基酸序列。这为噬菌体展示肽库的建立提供了技术保障。2噬菌体展示系统的类别噬菌体展示系统因载体和宿主细胞不同分别有:丝状噬菌体展示系统(包括p 、p 和噬菌体粒展示系统)、噬菌体展示系统及T4噬菌体展示系统。2.1丝状噬菌体展示系统:丝状噬菌体展示系统是外源基因与g3p或g8p基因融合,并将它以外壳蛋白表面多肽的形式展示出来。它是最早被用来展示外源肽或蛋白质的系统,也是目前应用最广、发展最完善的噬菌体展示系统。丝状噬菌体是单链DNA病毒,其通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞,然后将病毒DNA注入细菌的胞质,利用细菌胞质内的酶转变成复制的双链DNA,并通过滚动复制产生子一代DNA分子。噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体DNA的结构和复制特点,把丝状噬菌体M13或fd作为良好的基因工程的载体。因它的DNA复制与装配不受DNA分子的限制,因此可以将外源DNA插入到其一些非必须区,仅导致噬菌体颗粒的加长,而不影响其感染宿主及装配,这样即可得到一些插入外源DNA的基因重组体。噬菌体还可把插入的DNA片段以融合蛋白的形式表达在衣壳蛋白上。2.2噬菌体展示系统:是将外源肽或蛋白质与噬菌体的主要尾部蛋白PV或噬菌体头部组装的必需蛋白D蛋白融合而被展示。2.3T4噬菌体展示系统:T4噬菌体展示系统是将外源肽和蛋白质与T4噬菌体的小衣壳蛋白SOC的C端融合而被展示,也有将外源蛋白与T4噬菌体的次要纤维蛋白(Fibritin)的C末端融合而被展示。由于T4噬菌体是在寄主细胞内组装而不必通过分泌途径,因此它可展示的肽/蛋白质范围较广,尤其适合于展示那些不能被E.coli分泌的复杂蛋白质6。3噬菌体展示肽库的筛选方法3.1生物淘金法:是目前常用的、最早由Smith等设计的一种筛选方法。将靶分子包被在固相介质上,加入噬菌体肽库与之吸附,洗去非亲和性或低亲和性的噬菌体,回收等亲和性的噬菌体,经过几轮“淘选”,可富集到特异性的噬菌体多肽。用于噬菌体肽库筛选的目标蛋白可以直接吸附于酶标板,也可固定在生物小磁珠上,或者把经生物素化靶分子固定在包被链霉亲和素的ELISA小孔或生物磁珠上(利用链霉亲和素与生物素的高亲和力)。而对于无法提纯或靶分子(如抗原)性质不确定的情况,如癌细胞的表面受体,需建立相应的筛选系统如双层膜筛选系统:第一种膜为亲水性膜,第二种膜为疏水性膜,膜表面包被目标蛋白,细胞先在第一种膜上培养,然后移至第二层膜,分泌的可溶性蛋白可透过第一层膜,与第二层膜上的目标蛋白结合,再用已知配体筛选。3.2选择感染性噬菌体(SIP):用特定的多肽或蛋白替代P 蛋白使噬菌体丧失感染能力,再通过这些多肽或蛋白与其配基的结合恢复感染能力。此方法将蛋白质配基间的相互作用与噬菌体的感染扩增直接联系6,能使特异性筛选和噬菌体扩增同时进行。筛选蛋白或配基无需表达和纯化,只需DNA存在,少量的功能产物表达即可筛选,但缺点是筛选效率受到SIP文库的有效库容的限制。3.3延迟感染性筛选:由Benhar于2000年建立7。利用细菌表面展示系统中细菌外膜蛋白A(Lpp-Ompa)的多用性特点,将目标蛋白的编码序列融合到杂交的外膜蛋白A来展示8。当噬菌体被捕获或淘洗后,细菌被转入37培养,噬菌体因F纤毛得到表达而重新具有感染能力,成为被选克隆。此法筛选的进程与常规先选择再感染的过程相反,即被选择的细菌才可被捕获的噬菌体感染,所以又称“反向筛选”。其优点是:筛选所需目标蛋白的浓度很低,比常规方法低103,适合于大文库中有效筛选稀有克隆。4噬菌体肽库的构建和多肽的进化由于电转化效率的限制,在随机氨基酸数目大于7时,构建的文库很难容纳所有可能的多肽。因此,从噬菌体展示文库中筛选到的随机多肽还需要进一步的改造,以提高其结合力或专一性。这一步可以通过以下方法实现:(1)定点突变:Sharon等采用体外定点突变的方法对低亲和力抗体Vh中的一些氨基酸逐个突变,发现三个不同位置的三种氨基酸具有较高亲和力,将这三种氨基酸组合在一起,结果使抗体亲和力提高了200倍。(2)在致突变株进行体内突变:大肠杆菌MutD5株DNA聚合酶全酶中亚基基因MutD一旦发生突变,就丧失了校正功能,在复制时体内基因突变率明显增加。该菌株的Lac 基因易发生单个突变,其自然突变率比野生型株高100倍。该株的高突变率可用于抗体V区的基因突变,以改善噬菌体的亲和力。Low等采用此方法进行噬菌体抗体的亲和力成熟9。(3)错误倾向的PCR:Winter等利用错倾PCR方法引入突变使亲和力提高。在抗体库中还可以采用以下方法:(1)CDR的突变(walkingmutagenesis):随机合成的CDR区作为引物,通过PCR,特定位点上可发生变化,从而可建立次级突变库。(2)链更替(chainshuffling):将得到的低亲和力噬菌体肽或抗体的一条链(如轻链)与另一条链(如重链)的全部组合得到次级库,选择亲和力改善的克隆,再次重链固定,与轻链全部组合建库,筛选高亲和力的克隆。目前可供筛选的噬菌体肽库以线性肽库为主,构象具可变性,在一定程度上,虽可以增加筛选到与特定靶分子特异性结合的配体的可能性,但同时也因结合时的损失较大,难以筛选到高亲和力的结合配体。针对这一现象,目前采取的策略有:(1)通过对展示肽库的限制来获得高亲和力的克隆,如:将线性肽两端引入半胱氨酸形成环肽,将肽链折叠时取向固定。(2)预先设计分子构架,构建构象性肽库。这是一种基于骨架蛋白基础上的噬菌体肽库技术。以结构稳定的小分子-螺旋和-片层构成的分子支架为基础,改造分子表面连接-螺旋和-片层的转角、环形区或一些无规则的肽段。改造的方法可以是其中某些肽段随机化,也可以将其它蛋白和多肽中的活性有关序列插入其间10。目前最常见的是以天然抗体为结构骨架建立的噬菌体抗体库,主要是-片层结构。抗体分子经长期进化所产生的基因结构重排,可使抗体库获得的多样性达107以上,也可以通过人工设计改造建立人工抗体库。5噬菌体展示技术的应用噬菌体展示肽库技术作为研究生物分子间相互作用快捷而有效的工具,广泛适用于抗原抗体系统、细胞因子与受体的作用及酶学等领域,筛选的靶物质包括抗体、酶、受体及其他功能蛋白,或者细胞、血清乃至整个动物。5.1以单克隆抗体模拟抗原表位:以纯化的单抗为靶分子筛选抗原模拟表位是噬菌体展示技术应用最广泛的方面。目前,利用肽库已成功地筛选多种病毒的抗原表位,如HCV核心抗原表位11、HIVgp120蛋白的表位12。用抗单纯疱疹病毒 型(HSV-1)的mAb筛选12肽库,得到HSV-1糖蛋白gC的模拟肽13。王军俭14等以抗bFGF单克隆抗体CF22为目标蛋白,采用梯度洗脱,从七肽库中筛选到能特异性抑制bFGF结合到CF22的阳性克隆,经检测序列有高度保守性,且用此小肽免疫小鼠能诱导抗bFGF抗体的产生,其免疫反应阳性率与bFGF非常接近,在寻找抗bFGF肿瘤疫苗上有潜在价值。杨琨等15在确定能阻断PTA1-Fe融合蛋白与其天然配体结合mAb(LeoA1)的基础上筛选12肽库,得到多个能与LeoA1特异性结合的短肽,这些短肽有较保守而集中的模式序列WP/HXH/TH/C,有可能模拟PTA1分子的功能表位,成为其天然配体的拮抗剂,这为进一步揭开PTA1分子及配体在各种生理和病理状态中可能起的作用及寻找PTA1配体提供有价值的依据。5.2模拟细胞因子受体等其他分子的表位:采用其他纯化蛋白、细胞因子或膜蛋白等也能筛选到与之结合的噬菌体展示肽。如用可溶性TNF受体 蛋白(sTNFRI)可以筛选模拟TM-TNF-核心表位。叶飞16等用12肽库筛选到分别能模拟s-TNF-和TM-TNF-的噬菌体克隆,序列分析分别获得TM-TNF-和s-TNF-细胞毒效应的保守序列。这两种保守序列既有相关性,又有明显区别,提示两型TNF-与TNF受体结合位点可能不同,从而引发TNF受体下游的传导信号通路不同。而且这两个保守序列与TNF-cDNA序列无同源性,这种与模拟蛋白一级结构的不符表明噬菌体表面的实际序列为构象表位而不是线形表位。用TM-TNF-的保守序列合成多肽观察其生物学活性,实验表明该肽段不仅对HL-60细胞具有明显的细胞毒反应,呈剂量依赖性,且主要导致靶细胞凋亡。用激光共聚显微镜检测,合成肽段和TM-TNF-不能诱导NF-kB发生核转位,提示已成功获得TM-TNF-的模拟肽,从而为开发抗肿瘤制剂奠定了基础。以蛋白为靶分子,还可以筛选到一些非肽类模拟表位,如糖或生物素。糖是一类复杂的大分子物质,参与体内多种生理功能,如介导细胞粘附、迁移,识别病原微生物,诱导细胞分化等。可由于糖类纯化与合成困难,作为疫苗难以在实践中广泛采用。用多肽可从结构和免疫原性上模拟糖类,那就可以利用多肽免疫原性强的特点制备模拟肿瘤细胞表面特异性糖链的多肽疫苗。Kieber-Emmons等发现MCP的构象与乳腺癌相关的糖链亚单位的构象相似,于是合成了含YYPY和YYRYD结构模体的多肽。他们将合成肽与蛋白体形成复合物免疫小鼠,得到的抗血清可以与乳腺癌特异的糖链反应。FACS分析表明,该血清可以与表达高水平乳糖系列结构的人乳腺细胞系SKBR3细胞特异结合,而与正常细胞结合力很低,且该血清可以介导对SKBR3补体依赖的细胞毒作用。猪心移植到人是解决心脏移植中供体器官短缺的有效措施,但猪心血管内皮细胞表面抗原半乳糖-1,3-半乳糖(Gal-1,3-Gal)与人体内天然抗体结合所引起的超急性排斥是阻碍其付诸临床的首要障碍。Kooyman等17以能与猪心血管表面抗原表位半乳糖-1,3-半乳糖特异性结合的IB4为靶分子,从6肽库中筛选到能与之结合的小肽SSLRGF,这种结合能被半乳糖-1,3-半乳糖竞争性阻断,且此小肽加入含猪红细胞的人血清中,能抑制人类天然抗体介导的猪红细胞的凝集反应。5.3分析蛋白质-蛋白质相互作用的界面关键点图谱:噬菌体肽库在研究分析蛋白质与蛋白质相互作用的关键点的作用中有广泛应用。Deleo18等应用噬菌体随机肽库研究NADPH氧化酶的装配。NADPH氧化酶是一种多聚蛋白,由黄素细胞色素b形成,位于质膜上,由p47-phox和p22-phox两个亚单位组成,还有一个亚单位p47-phox正常情况下位于胞质溶胶,随细胞活化才运动到膜上。用p47-phox亚单位筛选噬菌体肽库,根据氨基酸序列筛选出肽可以分为四组,将这些肽的共同序列与gp-90-phox和p22-phox相比较,发现有同源区域,这样便可分析相互作用位点图谱。与同源区域一致的合成肽段,能够抑制NADPH氧化酶复合物的体外装配。李传昭19等以 型胶原酶为靶分子,采用亲合筛选,从构建的噬菌体随机九肽库中筛选出20个人 型胶原酶特异性结合肽,序列分析,这些小肽含有两个共有序列:WDXXD和WVGXXR,其中WDXXD的序列与 型胶原酶单链抗体可变区序列同源。感染疟疾的红细胞膜表面剧烈变化造成其与未感染疟疾的红细胞膜明显不同,用感染疟疾的红细胞筛选噬菌体肽库,可以特异性认识感染疟疾的红细胞表面的改变。经过6轮筛选,18个被选小肽中有8个序列相同,均为LV-DAAAL(称为P1)。P1共轭化后能抑制细胞内疟原虫的生长,且这种抑制与P1的剂量成依赖性变化,而对照肽却没有影响,这一结论显示P1可望成为抗疟疾的药物20。5.4寻找大型功能蛋白的小分子模拟肽:Wrighton20等从噬菌体表位随机肽库中筛选出能模拟红细胞生成素(EPO)的活性环肽,展示了多肽库在这一领域的应用前景。他们先在p 展示的八肽库中筛选出可溶性重组红细胞生成素胞外区(EPOR-ECD)的结合肽。然而,自由可溶性的环肽对EPOR的亲和力很低。为了找到高亲和力的肽,他们设计了第二个库。在得到的库中引入突变,两边加3个随机残基以使表位延长至14个氨基酸,将该突变肽与p 蛋白融合,用EPOR-ECD继续筛选,结果筛出的肽对EPO的亲和力提高1050倍。而且体内外试验表明,此小肽能诱导受体二聚合,引导信号传导,促进生长与分化,刺激体内网织红细胞计数增多。这一工作为噬菌体展示肽库的应用开辟了新天地,确认噬菌体展示肽库不仅能筛选生物活性肽,而且还能设计大型蛋白质的小分子模拟物,这为寻找新药物开辟了道路。5.5筛选细胞和组织的特异性肽:利用完整细胞,也能从肽库中筛选到细胞表面受体的结合肽。Pasqualini和Ru-oslahti21首次将要筛选的随机肽库注射入小鼠静脉,筛选到特异性结合脑和肾的靶向肽,这为临床上进行组织或细胞特异性给药提供了极有价值的信息。Rasmussen等用噬菌体肽库筛选出人的直肠癌WiDr细胞系的特异性噬菌体肽,序列为HEWSYLAPYPWF,它与WiDr细胞的亲和力比与人的五种其他肿瘤细胞高1000倍,且不依赖噬菌体外壳蛋白。分离出的小肽可以生物标记直肠癌细胞,有利于设计基因载体用于癌症的早期诊断和治疗22。李赏23等通过肝癌细胞系SMMC77721免疫小鼠,构建了肝癌细胞系SMMC77721的单克隆抗体库,筛选到与另一肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体,此抗体对于肝癌的早期诊断和治疗具有重要意义。6结语噬菌体展示技术自产生以来,以其快速、简便、高效,且表型和基因型相一致等特点,越来越广泛地被分子生物学一般实验室采用,在蛋白质的相互作用、疫苗设计及新药的开发方面具有广泛的应用前景。相信随着噬菌体肽库展示技术的不断发展和完善,其将对生物学的理论研究及药物筛选、开发等实际应用领域带来更深远的影响。参考文献1SmithGP.Filamentousfusionphage:novelexpressionvectorsthatdisplayclonedartigensonthevirionsurface.Science,1985,228:13151317.2ParmleyJF,SmithGP.Antibody-selectablefilamentousfdphagevectors:affinityparificationoftargetgenes.Gene,1988,73:305318.3ScottJK,SmithGP.Seachingforpeptideligandswithanepitopelibrary.Science,1990,249:386390.4田波,李传昭,孙仑泉,等.分子进化过程.第1版.北京:科学出版社,1999.78.5许正平,李伯良.噬菌体展示系统的研究进展.生命的化学,1996,16(3):2934.6JungS,AmdtKM,MullerKM,etal.Selectivelyinfectivephage(SIP)technology:scopeandlimitations.ImmunolMethods,1999,231(12):93104.7BenharI,AzrielR,Nahary1,etal.HighlyefficientselectionofphageantibodiesmediatedbydisplayartigenexpressionasLPPOmpA 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