小麦胚芽蛋白生产抗氧化肽的单酶及复合酶酶解工艺研究.doc

论文题目：小麦胚芽蛋白生产抗氧化肽的单酶及复合酶酶解工艺研究2012 年 05 月 摘 要本文以新鲜小麦胚芽为原料，对酶解小麦胚芽蛋白制备小麦胚芽蛋白抗氧化肽的条件进行优化。研究结果如下：小麦胚芽抗氧化肽酶解条件优化，采用五种蛋白酶对小麦胚芽蛋白进行水解，确定中性蛋白酶为最佳单酶，中性蛋白酶和碱性蛋白酶为最佳双酶。通过比较两种水解方式，确定单酶水解效果较双酶分步水解效果好，水解条件为：底物浓度4%，中性蛋白酶添加量6000u/g，酶解温度50，酶解时保持溶液pH值7.5。在其最佳水解条件下水解270min时，水解度可达到36.70%，肽含量为15.14mg/ml，且酶解液抗氧化活性最大，其中DPPH清除率为55.13%，还原能力700nm处吸光度为0.615。关键词：小麦胚芽蛋白，酶水解，活性肽ABSTRACTThis article use defatted wheat germ as raw material to prepare antioxidative peptides. The conditions of hydrolytic pretreatm- ent of wheat germ protein were investigated. The results are as follows:The conditions of hydrolytic pretreatment of wheat germ protein. The experiment was conducted to study the process parameters on enzymatic hydrolysis and antioxidant activity of hydrolysates by five protease. The results showed that the neutral protease was the best single enzyme, the neutral protease and the alkaline protease were the best double-enzyme. In addition, single enzyme had a better enzyme hydrolysis result by comparison with the double-enzyme. The optimum hydrolytic conditions were: substrate concentration 4%, neutral protease dosage 6000u/g, temperature 50, and pH value 7.5. Under this conditions, the antioxidant activity of hydrolysates attained maximum when hydrolysis time 270 min, and the DH was 36.70%, the content of peptide was 15.14mg/mL, the scavenging activities on DPPH radical was 55.13%, the reducing power(700nm) is 0.615.Key Word: Wheat germ protein, Enzymolysis, peptides目 录第1章 绪论- 1 -1.2小麦胚芽蛋白- 2 -1.2.1小麦胚芽蛋白的类型和营养价值- 2 -1.3抗氧化肽的研究进展- 2 -1.3.1抗氧化肽概述- 2 -1.3.2小麦胚芽蛋白抗氧化肽- 3 -1.4 课题研究的目的和意义- 4 -1.5课题研究内容- 4 -第2章 小麦胚芽蛋白的单酶及复合酶酶解工艺- 5 -2.1实验材料与仪器设备- 5 -2.1.1实验材料- 5 -2.1.2主要仪器设备- 5 -2.2实验方法- 5 -2.2.1小麦胚芽蛋白常规成分测定- 5 -2.2.2小麦胚芽蛋白单酶酶解工艺流程- 6 -2.2.3小麦胚芽蛋白双酶分步水解工艺流程- 6 -2.2.4水解度的测定- 6 -2.2.5肽含量的测定- 6 -2.2.6 DPPH清除率的测定- 6 -2.2.7还原能力的测定- 6 -2.3结果与讨论- 7 -2.3.1小麦胚芽蛋白基本化学成分分析- 7 -2.3.2单酶筛选- 7 -2.3.3中性蛋白酶酶解条件的确定- 8 -2.3.4双酶分步水解- 12 -结论- 17 -致 谢- 18 -参考文献- 19 - 19 -第1章 绪论1.1 小麦及小麦胚芽的概况小麦是小麦属植物的统称，起源于中东地区，在世界各地都有广泛地种植，同时小麦也是总产量仅次于玉米的排名世界第二的粮食作物，稻谷则排名第三。小麦是我国主要粮食作物之一，拿湖北省为例，根据国家统计局资料，“十一五”期间湖北省小麦平均年收获面积97.70万hm2，年均总产320.08万t1。小麦籽粒可分为麦皮、胚乳、胚芽三个部分，各组成部分的相对含量见表1.1。其中营养价值最高的小麦胚芽是小麦生命的根源，也是小麦籽粒的精华，占约整个小麦重量的1.43.9%。小麦胚芽中含有麦粒中8%的蛋白质，20%的脂肪，64%的维生素B1，26%的维生素B2，21%的维生素B6，7%的泛酸和2%的烟酸3。小麦胚芽各部分组成如表1.2所示。此外，小麦胚芽中还蕴含多种生理活性物质，如谷胱甘肽、麦胚凝集素、黄酮类物质、二十八烷醇、甾醇脂多糠等等。表1.12 小麦中各组分含量表皮（%）胚 乳 胚 芽（%） （%）77.085.0 1.43.8果皮种皮糊粉层合计3.54.41.12.06.08.910.615.3表1.2 小麦胚芽中的化学成分（以干基计/%）4,5粗蛋白粗脂肪淀粉糖分戊聚糖纤维灰分麦胚37.6315.04025.129.742.466.32小麦胚芽因极高的营养特性被营养学家誉为“人类的天然营养宝库”6，对小麦胚芽的开发利用也得到越来越多的重视。目前，在许多欧美国家，将小麦胚芽作为原料开发的食品种类有很多，在东南亚小麦胚芽食品同样十分畅销，售价非常高，一般为次粉或麸皮的1215倍。小麦胚芽食品在市场中主要产品有：小麦胚芽油、小麦胚芽豆奶、小麦胚芽豆腐、小麦胚芽酱、小麦胚芽口服液、小麦胚芽饼干、小麦胚芽面包等营养食品。在国内，对小麦胚芽的开发利用水平相对较低，因此开发出的产品极少，利用率也很低。即使有些企业引进了面粉加工设备，也只是将提出的小麦胚芽又掺入麸皮然后低价出售，这样不但使优良的食品资源白白地流失，而且使面粉企业失去了一条增加经济效益的有效途径。因此，如何开发利用小麦胚芽已成了各面粉企业亟待解决的问题7。1.2小麦胚芽蛋白1.2.1小麦胚芽蛋白的类型和营养价值重量虽然只占小麦籽粒的1.43.9%，但小麦胚芽所含营养成分却很高。小麦胚芽中的蛋白质含量大约为30%，高于面粉和大米，也高于肉、蛋、奶，仅次于大豆。而且它还含有8种人体不能合成的必需氨基酸，含量比鸡蛋还高。其中，能促进幼儿发育的敕氨酸的含量尤多，约为鸡蛋的两倍8。小麦胚芽蛋白质中，清蛋白占30.2%，球蛋白占18.9%，麦醇溶蛋白占14.0%，麦谷蛋白占0.37%，水不溶性蛋白占30.2%9。小麦胚芽中以天冬酰胺，尿囊素、甜菜碱、胆碱、卵磷脂和谷胱甘肽等为主的非蛋白质态氮含量相对较高，达11.315.3；另外，多聚胺亚精胺、1，5-戊二胺和1，4-丁二胺也能检测的到10。小麦胚芽蛋白不仅含量丰富，而且质量优良，蛋白质中氨基酸比例也很合理，是一种完全蛋白质11。小麦胚芽蛋白中必须氨基酸的相互比值与FAO/WHO 颁布的氨基酸构成比例基本接近，且总量高于FAO/WHO模式，见表1.3。表1.312 麦胚蛋白与其它食物蛋白必需氨基酸构成比例的比较氨基酸名称FAO/WHO麦胚大豆鸡蛋牛肉大米面粉赖氨酸5.55.65.85.77.23.52.4苏氨酸4.04.44.05.14.73.93.1色氨酸1.01.31.21.71.11.71.1蛋氨酸3.51.92.03.42.61.71.4胱氨酸-1.01.92.91.0-苯丙氨酸6.03.45.75.73.54.84.5酪氨酸2.94.1-3.6-亮氨酸7.06.76.69.37.38.47.1异亮氨酸4.03.54.75.03.93.53.6缬氨酸5.05.74.26.95.55.44.21.3抗氧化肽的研究进展1.3.1抗氧化肽概述抗氧化剂近年在国内外发展迅速，应用范围越来越广。人体内氧化产生的自由基与人的衰老甚至是疾病有关，因此人们将抗氧化剂的应用渐渐从仅用于含脂肪食品的抗氧化扩大至添加到保健食品及化妆品的开发，将其作为功能因子。尽管抗氧化剂的种类繁多，如常用在食品领域的BHA、BHT等，但人们对化学合成的抗氧化剂的安全性质疑越来越多，要求也越来越严格，纯天然安全无毒的天然抗氧化剂得到人们越来越多的重视。现已开发的天然抗氧化剂有来源茶叶的茶多酚15、来源大豆的大豆异黄酮16、来源骨骼肌的肌肽17、来源枸杞的枸杞多糖18、以及大豆肽19、慈菇20、扇贝21、六月霜22的提取物等等。 随着营养学和生物技术的发展，人们发现，肽类的抗氧化活性相比于蛋白质和氨基酸往往更为显著23。并且由于其独特的结构，肽类的食用安全性更高。目前制备抗氧化多肽的方法和途径有3条：一是内源性抗氧化多肽，代表有肌肽、谷胱甘肽等；二是通过酶解蛋白质制备抗氧化多肽；三是合成的方法，包括化学合成法、酶合成法和重组RNA技术合成法24。酶法水解蛋白质制备活性肽是目前生产活性肽的主要方法。1.3.2小麦胚芽蛋白抗氧化肽通过大量国内外研究人员对脱脂小麦胚芽蛋白酶解后的产物进行研究，对其生理活性进行测定，得到具有生物活性的肽，主要集中在降血压肽上14,25,26,27。近年来，对小麦胚芽蛋白的抗氧化肽的研究受到了越来越多的关注。朱科学13分析出小麦胚芽分离蛋白Alcalase酶解产物具有较强的抗氧化活性，且螯合Fe2+是其主要的抗氧化作用机理。超滤后，酶解产物中相对分子量小于1000Da的组分有最强的抗氧化活性。殷微微等28用Alcalase碱性蛋白酶酶解小麦胚芽蛋白，在最佳条件下小麦胚芽抗氧化肽对O2-.的清除率为72.87%；王丹丹等29采用中性蛋白酶和Flavourzyme分别水解脱脂小麦胚芽蛋白制取小麦胚芽蛋白肽，结果表明两种酶的水解产物均具有清除DPPH自由基能力和还原能力；刘振家30等用超声波辅助Alcalase2.4L酶解脱脂小麦胚芽，在最佳条件下酶解产物的DPPH自由基实际的清除率达到61.2%。程云辉31以小麦胚芽蛋白为原料，体外抗氧化活性为指标，确定酶解小麦胚芽蛋白的最合适蛋白酶和最佳水解工艺。经超滤和大孔吸附树脂脱盐，凝胶色谱、半制备RP-HPLC、RP-HPLC分离纯化，得到一个具有较强抗氧化活性的组分并分析鉴定其氨基酸序列为Arg-Glu-Trp。郭红英等32,33研究用碱性蛋白酶酶解小麦胚芽蛋白制备的麦胚多肽对小鼠肝脏自发诱导脂质过氧化的抑制作用，结果表明小麦胚芽多肽能显著降低肝脏自发性脂质过氧化模型鼠中脂质过氧化反应的终产物-丙二醛含量。1.4 课题研究的目的和意义研究表明，人类的衰老和很多疾病均与活性氧对机体大分子的氧化性损伤有关34。尽管药物具有抗氧化效果，但具有一定副作用，经常服用会增加肝脏的解毒负担。食物相对要安全得多，可有效预防和治疗心血管病、糖尿病、癌症和衰老等，可以长期食用。将食物中的抗氧化有效成分提取出来作为营养因子用于保健食品或食品添加剂中，可以方便人们的食用并维护人们的健康。因此，开发麦胚抗氧化肽具有非常重要的意义。我国小麦年产量为1亿吨，可开发利用的小麦胚芽蕴藏量高达200万吨。然而，尽管产量丰富，堪称优秀的人类营养素来源的小麦胚芽却常被当作副产品掺入麸皮中当饲料低价出售，造成食品资源的浪费。另一方面，小麦胚芽若混入面粉，会对面粉品质产生不良影响。为解决以上问题，必须找出一条合理开发利用小麦胚芽的有效途径，不仅为人类提供了优质的营养素，而且提升小麦胚芽的经济价值，还可以创造巨大的社会效益和经济效益。小麦胚芽是具有生命活力的植物胚胎，小麦胚芽蛋白中蕴涵着许多具有生物活性的氨基酸序列，选择适当的蛋白酶水解麦胚蛋白，就有可能释放出有活性的肽段。近几年来，人们开始研究小麦胚芽蛋白活性肽，已从小麦胚芽蛋白分离出降压肽，但对小麦胚芽蛋白抗氧化肽的研究方面比较薄弱。从小麦胚芽中开发抗氧化肽，不仅原料来源容易，成本低，消费者容易接受，而且对于心血管病、糖尿病、癌症和衰老等慢性病等有预防和治疗的功效，可以为人们提供一种价廉物美，安全可靠的保健食品。本研究以小麦胚芽中的蛋白为研究对象，选取适当的酶水解，以水解度和抗氧化活性作为检测指标，研究酶水解过程对抗氧化活性的影响，找出影响抗氧化活性的主要原因，精制小麦胚芽蛋白酶解产物，测定精制后的小麦胚芽蛋白多肽的抗氧化活性，从而为小麦胚芽抗氧化肽的工业化生产提供理论依据和工艺参数。小麦胚芽抗氧化产品的研究提高了麦胚的附加值，为小麦胚芽的综合利用开辟了新途径，实现了小麦资源的再利用，提高小麦的使用价值及经济价值。1.5课题研究内容本文以小麦胚芽为原料，小麦胚芽蛋白的水解进行研究，主要研究小麦胚芽蛋白水解的最佳水解用酶。本研究以水解度和酶解产物还原能力和清除DPPH能力为指标，选取5种食品工业常用蛋白酶对小麦胚芽蛋白进行酶解，筛选酶种，并确定单酶水解最佳工艺和双酶分步水解最佳工艺。将两种水解方法效果进行比较，确定小麦胚芽蛋白最佳水解用酶和水解工艺。第2章 小麦胚芽蛋白的单酶及复合酶酶解工艺2.1实验材料与仪器设备2.1.1实验材料小麦胚芽蛋白：实验室自制蛋白酶：均来自广西南宁庞博生物工程有限公司，作用条件如下表2.1主要试剂：氢氧化钠，盐酸，甲醇，氯化钠，乙醇，磷酸缓冲液，三氯乙酸，三氯化铁，铁氰化钾等，均为分析纯试剂。DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）：sigma公司表2.1 几种蛋白酶的活力和水解条件蛋白酶酶活力作用条件碱性蛋白酶200000u/g50、pH8.0中性蛋白酶200000u/g50、pH 7.0胰酶4000u/g50、pH7.5木瓜蛋白酶1000000u/g50-55、pH6.5风味蛋白酶500000u/g50、pH7.52.1.2主要仪器设备7200型分光光度计：龙尼柯（上海）仪器有限公司；Free Zone 2.5 冷冻干燥机：美国LABCONCO公司；KQ-100DV超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SYC智能超级恒温水槽：巩义市英山峪华仪器厂；AR2140电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司；LXJ-离心沉淀机：上海医用分析仪器厂；TGL-16C台式离心机：上海安亭科学仪器厂制造；DELTA320pH计：梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；2.2实验方法2.2.1小麦胚芽蛋白常规成分测定蛋白质含量：微量凯氏定氮法（GB 5009.5-2010）脂肪含量：索氏抽提法（GB/T 5009.6-2003）水分含量：直接干燥法（GB/T 5009.3-2003）灰分含量：550 灼烧法（GB/T 5009.4-2003）2.2.2小麦胚芽蛋白单酶酶解工艺流程取一定量脱脂小麦胚芽蛋白配制成一定浓度的蛋白悬浮液，调节恒温水浴锅为各酶最适温度，并用磁力搅拌器混匀，按相同加酶量在各酶最适pH值下水解，酶解过程中用1mol/L NaOH溶液保持pH值不变。反应结束后，90灭酶10min，10000r/min离心5min后取上清液调pH至中性备用分析。2.2.3小麦胚芽蛋白双酶分步水解工艺流程在2.2.2实验中可选出两种水解效果较好的蛋白酶。确定水解效果最好的蛋白酶为第一种添加酶，先按第一种蛋白酶的最适条件水解，水解到达终点后加热（90，10min）灭酶，将温度和pH值调至第二种蛋白酶的最适条件，酶解一定时间，灭酶（90，10min），10000r/min离心5min后取上清液调pH至中性备用分析。2.2.4水解度的测定采用pH-stat法352.2.5肽含量的测定采用酸溶性肽含量测定法322.2.6 DPPH清除率的测定参照Shimada36的方法并略作改进。配制浓度为6.510-4mol/L的DPPH甲醇溶液作为母液，并置于4冰箱避光保存。临用前用50%甲醇稀释10倍，然后将稀释后的DPPH溶液、50%甲醇及测试样品按表2.2进行反应，并于DPPH溶液的最大吸收波长517nm测样品的吸光度值。每个试样做三个平行，取其平均值。表2.2 DPPH试样加样表ADPPH溶液50%甲醇测试样Ao4mL0.8mL-Ai4mL-0.8mLAj-4mL0.8mL样品对DPPH清除率可表示为：SA(%)=1-(Ai-Aj)/A0100%2.2.7还原能力的测定按照Oyaizu37的方法测定还原能力。将小麦胚芽蛋白水解物溶解在0.2mol/L，pH6.6的磷酸缓冲液中，取样品液2.5 mL加入试管，加入2.5 mL1(w/v)铁氰化钾溶液，混合物于50水浴保温20min后，快速冷却，再加入2.5mL的10三氯乙酸溶液，混匀，以3000r/min离心10 min，移取上清液2.5 mL于试管中依次加入2.5mL蒸馏水、0.5 mL的0.1FeCl3溶液，充分混匀，室温静置10min后，测定 700nm处吸光度。吸光度越大表示还原能力越强。2.3结果与讨论2.3.1小麦胚芽蛋白基本化学成分分析小麦胚芽蛋白的基本化学成分见表3.3表3.3 小麦胚芽蛋白基本化学成分（g/100g，wb）水分灰分脂肪蛋白质碳水化合物小麦胚芽蛋白2.270.0622.370.031.090.0486.531.017.74注：碳水化合物含量为差量法所得2.3.2单酶筛选2.3.2.1不同蛋白酶对小麦胚芽蛋白水解度的影响根据pH-stat法的原理，当pH6.0时，水解过程中加入的碱量与断裂的肽链的数量有定量关系。水解断裂的肽键占蛋白质分子中总肽链的比例即水解度，可通过加碱量算出水解度（DH）13。在相同的底物浓度S为4%，相同的酶添加量E/S为4000u/g，分别在5种蛋白酶的最适温度、最适pH值条件下水解240min，小麦胚芽蛋白水解进程如图2-1所示。图2.1 不同蛋白酶对小麦胚芽蛋白水解度的影响从图2.1看出，5种酶的DH-时间曲线符合典型的酶反应过程曲线，但又有各自的特性。碱性蛋白酶的水解度最高可达到28.36%，其次是中性蛋白酶，为26.91%。这两种酶在时间为40min和25min时，水解度可达到最大值的一半。而风味蛋白酶的水解度最低，只有2.38%。这说明了蛋白酶来源不同、酶学性质不同，对小麦胚芽蛋白的水解作用不同。中性蛋白酶和碱性蛋白酶水解效果较好，可能是因为这两种酶都属于微生物蛋白酶，溶解性较好、活力较高32。2.3.2.2不同蛋白酶水解产物的抗氧化活性 分别测定5中蛋白酶水解终点的酶解液DPPH清除率和还原能力，结果如表2.4所示。表3.4 5种小麦胚芽蛋白酶水解产物的抗氧化活性组别 DPPH清除率% 还原能力（A）碱性蛋白酶43.140.32a0.4400.005a中性蛋白酶52.68+3.33b0.3820.003b风味蛋白酶24.592.90c0.2650.007c木瓜蛋白酶42.993.85a0.1450.005d胰酶35.960.78d0.1950.005e注：（1）样品浓度为10mg/ml；（2）字母不同表示差异显著，P0.05。从上表可看出，中性蛋白酶水解产物DPPH清除率最大，为52.68%，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解产物DPPH清除率略低，分别为43.14%和42.99%，风味蛋白酶水解产物DPPH清除率最低，只有24.59%。还原能力碱性蛋白酶较高，其次为中性蛋白酶。其他蛋白酶水解产物的还原能力都较低。可能是因为中性蛋白酶和碱性蛋白酶在弱碱性和碱性条件下，较易打开带有疏水性侧链的氨基酸的肽键，形成疏水性氨基酸末端的肽链15。在本实验中，中性蛋白酶的水解度和还原能力略低于碱性蛋白酶，但DPPH清除率较中性蛋白酶有较大优势。故选择中性蛋白酶较合适。2.3.3中性蛋白酶酶解条件的确定2.3.3.1底物浓度对中性蛋白酶水解小麦胚芽蛋白的影响不同浓度的小麦胚芽蛋白溶液，在加酶量为4000u/g，酶解温度为50，酶解pH值为7.0条件下，通过中性蛋白酶酶解300min，结果如图3.2所示。从图中可看出，底物浓度在3%7%范围内时，水解体系存在底物抑制现象，底物浓度从3%增加到4%，水解度是随着增大的，此时没有底物抑制现象。但当底物浓度继续增加时，底物抑制现象出现并随着底物浓度的增大而加大。故中性蛋白酶水解小麦胚芽蛋白的最佳底物浓度为4%图2.2 中性蛋白酶在不同底物浓度的水解进程2.3.3.2酶添加量对中性蛋白酶水解小麦胚芽蛋白的影响在底物浓度为4%，酶解温度为50酶解pH 为7.0的条件下，向小麦胚芽蛋白水溶液中添加不同量的中性蛋白酶，酶解300min，结果如图2.3所示。从图中可看出，随着酶添加量的增大，水解度也增大，但增大的幅度会有所减小。当E/S为6000u/g时，水解度为32.61%，而E/S为8000u/g时，水解度为33.85%，只增加1.24%。而E/S为2000u/g和4000u/g的水解度比E/S为6000u/g时低得多。从工业成本考虑，选择E/S为6000u/g较合适。图2.3 中性蛋白酶在不同酶添加量的水解进程2.3.3.3温度对中性蛋白酶水解小麦胚芽蛋白的影响在底物浓度为4%，酶添加量为6000u/g，酶解pH值为7.0条件下，改变酶解温度，酶解300min，结果如图2.4所示。由图中可看出，随着温度的上升，水解度逐渐增大，当温度在50时，水解度达到最大且相对稳定，继续升高温度，酶的活性受到了抑制，使水解度逐渐降低，故选择酶解温度温度50。图2.4 中性蛋白酶在不同温度下的水解进程2.3.3.4 pH值对中性蛋白酶水解小麦胚芽蛋白的影响在底物浓度为4%，酶添加量为6000u/g，酶解温度50条件下，改变酶解pH值，酶解300min，结果如图2.5所示。由图中可看出，随着pH的增大，水解度逐渐增大，当pH值增值7.5时，水解度达到最大且相对稳定，当pH继续增大，酶的活性受到了抑制，使水解度逐渐降低。故选择酶解pH值为7.5。图2.5 中性蛋白酶在不同pH值下的水解进程2.3.3.5中性蛋白酶水解小麦胚芽蛋白过程中抗氧化活性、肽含量的变化及水解时间的确定通过中性蛋白酶水解的单因素实验，确定水解条件为：底物浓度4%、加酶量6000u/g，酶解温度50、酶解pH值7.5。在此条件下对小麦胚芽蛋白进行水解。水解过程中每30min提取酶解液测定DPPH清除率、还原能力和肽含量，结果如下图所示。从图2.6可以看出，随着水解的进行，其DPPH清除率和还原能力都有所增加，水解到270min时，DPPH清除率和还原能力都达到最大，其中DPPH清除率为55.13%，还原能力700nm吸光度0.615。继续水解，DPPH清除率和还原能力呈下降趋势。原因可能是某些具有活性的肽段被继续水解而生成不具有或具有较低活性的肽段，从而使DPPH清除率和还原能力降低。图2.7所示为肽含量的变化。水解30min肽含量明显增大，随后增大趋势有所下降，水解150min后肽含量略微有波动，但整体趋于平稳，270min肽含量为15.14mg/ml。综合考虑，水解时间确定为270min。图 2.6 中性蛋白酶水解过程中抗氧化能力的变化图2.7 中性蛋白酶水解过程中肽含量的变化2.3.4双酶分步水解2.3.4.1双酶的筛选（1）不同组合双酶对小麦胚芽蛋白水解度的影响已确定中性蛋白酶为水解小麦胚芽蛋白的最佳单酶。将中性蛋白酶与其他蛋白酶分别组合进行双酶水解小麦胚芽蛋白。不同蛋白酶的专一性是不一样的，单酶由于酶切位点相对较少，蛋白酶酶解可能会受到抑制。而采用多酶协同水解，有可能增加蛋白酶的特异性催化位点，从而提高蛋白水解度，对水解产物的活性亦有一定影响。已确定中性蛋白酶为水解小麦胚芽蛋白的最佳单酶，并确定了水解的工艺条件。在此条件下，采用中性蛋白酶与其他几种蛋白酶配合使用来酶解小麦胚芽蛋白，以期获得较高的水解度和抗氧化活性较高的水解产物。前期实验确定的中性蛋白酶水解小麦胚芽蛋白最佳条件为：底物浓度4%、加酶量6000U/g、酶解温度50、酶解pH值7.5，水解时间270min。灭酶后，添加酶活比相同（3:1）的第二种蛋白酶水解。结果如图3.8所示。从图中可以看出，中性蛋白酶和碱性蛋白酶配合水解，水解度的增幅较为明显，而其他蛋白酶组合水解度增幅基本不变。这可能是因为其他蛋白酶对小麦胚芽蛋白的水解作用较弱，或者是其他蛋白酶使小麦胚芽肽水解成更多的游离氨基酸，从而掩盖了小麦胚芽肽增加的幅度。图2.8 不同组合双酶对小麦胚芽蛋白水解度的影响（2）不同组合蛋白酶水解产物抗氧化活性的比较在各双酶水解终点测定酶解液的DPPH清除率和还原能力，结果如表2.5所示。表2.5 小麦胚芽蛋白复合酶水解产物的抗氧化活性组别DPPH清除率%还原能力中+木44.972.61a0.3450.003a中+风35.772.16b0.3810.002b中+胰37.521.33b0.2720.003c中+碱47.440.35a0.4870.005d注：（1）中：中性蛋白酶；木：木瓜蛋白酶；风：风味蛋白酶；胰：胰酶；碱：碱性蛋白酶；（2）样品浓度为10mg/mL；（23）字母不同表示差异显著，P0.05。从表中可看出，中性蛋白酶和碱性蛋白酶复合水解的水解产物有较高的DPPH清除率和还原能力，其次为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶复合。显然，选用中性蛋白酶和碱性蛋白酶复合水解小麦胚芽蛋白较合适。2.3.4.2 中性蛋白酶与碱性蛋白酶复合酶解工艺的确定（1）中性蛋白酶与碱性蛋白酶酶活比的确定中性蛋白酶按2.3.3水解后，加入一定量的碱性蛋白酶进行水解，其水解的条件为温度50，pH值8.0，改变酶活比。结果如图2.9所示。从图中可以看出，270min以后，水解度随着酶活比的增大有所增加，酶活比3:1时水解度为45.61%，酶活比2:1时水解度为47.27%，酶活比1:1时水解度47.89%，故选择酶活比2:1时较合适。图2.9 酶活比对水解度的影响（2）碱性蛋白酶水解温度对水解度的影响中性蛋白酶按照2.3.3的条件进行，碱性蛋白酶酶解条件为酶活比2:1，pH值8.0，改变碱性蛋白酶酶解温度，结果如图2.10所示。从图中可看出，当温度从45升高至50，水解度增加，继续升高温度，酶的活性受到了抑制，使水解度逐渐相抵。故选择酶解温度温度50。图2.10 碱性蛋白酶水解温度对水解度的影响（3）碱性蛋白酶水解pH值对水解度的影响中性蛋白酶按照2.3.3的条件进行，碱性蛋白酶酶解条件为酶活比2:1，温度50，改变酶解pH值，水解450min，结果如图2.11所示。从图中可以看出，随着pH值的升高，水解度增加，当pH值为8.5时水解度最高且较稳定。当pH值继续升高，酶的活性受到了抑制，使水解度逐渐相抵。故选择酶解pH值为8.5。图2.11 碱性蛋白酶水解pH值对水解度的影响（4）中性蛋白酶与碱性蛋白酶复合水解小麦胚芽蛋白过程中抗氧化活性、肽含量的变化及水解时间的确定在双酶最佳水解工艺条件下对小麦胚芽蛋白进行分步水解，每隔30min提取酶解液测定DPPH清除率、还原能力和肽含量，结果如下图所示。从图3.12看出，270min加入碱性蛋白酶以后，酶解液的DPPH清除率并没有增大，而是从270min的55.13%降低至300min的53.29%，并且随着水解的进行，继续降低。从图2.13看出，还原能力略有增加，但300min以后还原能力也呈下降趋势。从图2.14看出，肽含量随着碱性蛋白酶的加入呈上升趋势，在水解420min时达到16.33mg/mL，随后又有所下降，可能是继续水解过程中部分肽段被水解成了游离氨基酸所致。对比加入碱性蛋白酶前后的抗氧化活性与肽含量可知，即使中性蛋白酶和碱性蛋白酶复合水解使还原能力和肽含量有所提升，但与中性蛋白酶单独水解相比，并没有明显的优势，且较耗时。酶解液的DPPH清除率和还原能力降低的原因可能是：孙国威38等的研究表明疏水性对肽的抗氧化活性影响很大，肽的疏水性与抗氧化活性在一般情况下多呈正相关。在文中所使用的蛋白酶中，中性蛋白酶和碱性蛋白酶在弱碱性和碱性条件下，较易打开带有疏水性侧链的氨基酸的肽键，形成疏水性氨基酸末端的肽链13，中性蛋白酶对疏水性氨基酸残基的专一性要求更高，而碱性蛋白酶比中性蛋白酶的水解范围广。如Adamson39发现，碱性蛋白酶Alcalase FG 2.4L可以裂解酪蛋白中的Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和Gln的羧基肽键，中性蛋白酶Asl.398水解羧基端是Tyr、Phe、Trp等芳香族疏水性氨基酸的肽键。小麦胚芽蛋白经中性蛋白酶水解270min，带疏水性氨基酸末端的肽链大部分已形成，所以加入碱性蛋白酶后，即使会形成少量带不同疏水氨基酸末端的肽链，但对肽段抗氧化活性的作用不会太大，甚至随着水解的进一步进行，已经被中性蛋白酶水解成的抗氧化活性肽段又被碱性蛋白酶水解而生成活性较小或不具有活性的肽段。表2-5中中性蛋白酶和其它酶的组合水解使水解液的抗氧化活性降低可能也是由此原因造成，因为这些酶对疏水性氨基酸残基的水解作用较弱。这也间接说明肽的抗氧化活性与疏水性及肽链长短的关系。图2.12 双酶水解小麦胚芽蛋白酶解液DPPH清除率随时间的变化图2.13 双酶水解小麦胚芽蛋白酶解液还原能力的变化图2.14 水解过程中肽含量的变化结论（1）测定小麦胚芽蛋白的基本化学成分如下：水分2.27%，灰分2.37%，脂肪1.09%，蛋白质86.53%在，碳水化合物7.74%。（2）通过研究了5种蛋白酶水解小麦胚芽蛋白，确定中性蛋白酶为水解最适用酶。最佳水解条件为：底物浓度4%，酶添加量6000u/g，酶解温度50，pH值7.5，在其最佳水解条件下水解270min时，水解度可达到36.70%，肽含量为15.14mg/ml，且酶解液抗氧化活性最大，其中DPPH清除率为55.13%，700nm处吸光度为0.615（3）考察了中性蛋白酶与其他4种蛋白酶复合水解小麦胚芽蛋白的进程。及水解产物的体外抗氧化活性。实验结果表明，加入碱性蛋白酶后，虽然水解至300min和420min时酶解产物还原能力和肽含量有不同程度增加，但DPPH清除率始终是呈下降趋势。因此双酶水解比单酶水解小麦胚芽蛋白没有明显优势。从节省生产时间和用酶成本来看，选择用中性蛋白酶单独水解小麦胚芽蛋白制备小麦胚芽蛋白抗氧化肽较合适。（4）通过对小麦胚芽蛋白水解选择最佳单酶及双酶分步水解，间接说明肽的抗氧化活性与疏水性及肽链长短的关系。参考文献1 高春保，刘易科，佟汉文，等.湖北省“十一五”小麦生产概况分析及“十二五”发展思路J.湖北农业科学，2010，11（49）：27032705. 2 朱天钦制粉工艺与设备M成都：四川科学技术出版社，19883 李维平.优质小麦高效生产与利用M.北京：金盾出版社，2001. 4 Pomeranz Y. 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