甘草中甘草素的质量检测研究..doc

HPLC法测定不同产地甘草中甘草苷的含量方法一：建立甘草中甘草苷含量测定的HPLC法，测定不同产地甘草中甘草苷的含量，以控制其质量。方法HPLC色谱条件为分析柱为Kromasil C18柱(46 mm25 cm，5m);流动相为乙腈05%醋酸溶液(V/V，14);流速为10 ml/min;柱温为25;紫外检测波长为270 nm;采用外标法定量测定。结果甘草苷在0112g范围内呈良好的线形关系(r=0999 9)，其平均加样回收率和RSD值分别为9786%和204%(n=6)。结论该方法操作简单、准确、快速、重现性好，可作为甘草苷的定量分析方法。色谱条件的确定。HPLC色谱条件为:分析柱为Kro-masil C18柱(46 mm25 cm，5m);流动相为乙腈05%醋酸溶液(V/V，14);流速为10 ml/min;柱温为25;紫外检测波长为270 nm;采用外标法定量测定。122对照品溶液的制备。取适量甘草苷对照品，溶于甲醇制成015 mg/ml的对照品溶液。123供试品溶液的制备。取供试样品025 g，置于50 ml量瓶中，加40 ml 70%甲醇，超声处理45 min，放冷，滤过，加70%甲醇定容置刻度，摇匀，静置，即得。HPLC法测定甘草酸和甘草苷的含量*:方法二：建立以HPLC法同时测定甘草中甘草酸和甘草苷含量的方法。方法:采用C18柱（4.6mm15cm，5m）为分析柱；以乙腈1醋酸溶液为流动相；流速为0.6 mlmin-1；柱温25；采用外表法定量测定。结果表明甘草酸在4.16-28.0g/ml范围内，回归方程为Y=10562.8X+30963(r=0.9999)；甘草苷在13.0-23.4g/ml范围内，回归方程为Y=12857.4X+16437(r=0.9997)，平均加样回收率均大于96.08%，日内、日间的RSD值分别小于1.41%和1.85%。结论本方法操作简单、准确、快速、重现性好，其它组分干扰少，可用于甘草酸和甘草苷的含量测定。色谱条件色谱柱采用C18分析柱，（4.6mm15cm，5m）；柱温：25；流速：0.6ml/min；流动相A为乙腈，流动相B为1%醋酸溶液；进样量：10l。溶液的制备对照品储备液精密称取甘草酸单铵盐和甘草苷9.89mg，9.45mg，分别置于50ml量瓶中，分别用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度为41.6g/ml和26.0g/ml的贮备溶液。分别吸取1ml贮备溶液混合，用甲醇定容至10ml，即为混合标准液。供试品取甘草粉末0.5g，精密称定，加50ml甲醇，超声处理1h，放冷，滤过，置100 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。HPLC法同时测定甘草中甘草苷、甘草酸、甘草次酸含量方法三：:建立HPLC同时测定甘草中甘草苷、甘草酸、甘草次酸的质量控制方法。方法:色谱条件:KromasC18柱,流动相为乙腈-003 mol/L醋酸铵,梯度洗脱,检测波长250、276 nm,流速: 07 mL/min;柱温: 30。结果:色谱峰分离情况良好,甘草苷、甘草酸、甘草次酸在各自的浓度范围内均具有良好的线性相关性;加样回收率为981% 993%,其RSD为14% 25%。结论:所建方法准确、简便、重现性好,可用于甘草主成分的定量考察。色谱条件色谱柱:KromasilKR100-5 C18,流动相:A为003 mol/L醋酸铵溶液; B为乙腈,梯度洗脱: 020 min为20% B; 2040 min为25% B;4060 min为32% B; 6090 min为75% B。检测波长: 276 nm检测甘草苷, 250 nm检测甘草酸、甘草次酸。流速: 07 mL/min;柱温: 30,进样量: 20L。对照品溶液的制备精密称取甘草苷对照品5 mg、甘草酸对照品10 mg、甘草次酸对照品12mg,用甲醇溶解定容至5 mL,作为对照品贮备液。并将其稀释得到甘草苷浓度为00164 mg/mL、甘草酸浓度为00316 mg/mL、甘草次酸浓度为00037mg/mL的混合对照品溶液。供试品溶液的制备精密称取甘草01 g,加流动相AB为11, 80超声30 min,定容至50mL,过滤,取续滤液作为供试品溶液HPLC分析甘草中甘草酸和甘草苷含量:研究不同产地、不同生长期的野生与栽培甘草中甘草酸、甘草苷含量的变化,确定其最佳采收期。为了更好地开发利用甘草资源提供理论依据,建立了分析方法,为甘草的现代质量评价体系提供参考数据,扩大甘草药源。采用高效液相色谱测定不同产地、不同生长期野生与栽培甘草中甘草酸、甘草苷的含量。甘草酸在0.46g范围内具有良好的线性关系, r=0.9999,平均回收率(n=3)为101.83%,RSD=0.74%;甘草苷在0.46g范围内具有良好的线性关系,r=0.9998,平均回收率(n=3)为100.50%,RSD=0.22%。该方法确立了甘草的最佳采收期为9月中旬,种植基地的甘草可代替野生甘草使用,为甘草的药用资源和深入开发利用提供了基础依据。该方法简便、精密度高,结果准确可靠。甘草苷的含量测定甘草苷的含量测定:色谱条件与系统适用性试验。以流动相为乙腈0.5%冰醋酸(14),检测波长为276nm,流速1.0ml/min,柱温室温25,进样体积20l。对照品溶液的制备。精密称取甘草苷对照品10mg,加甲醇制成含2g/ml的溶液。供试品溶液的制备。取本品粉末0.2g,加入70%乙醇溶液10ml,超声波处理(功率300W,频率25KHz)30min,滤过;精密量取续滤液5ml,置于10ml容量瓶中,用20%乙腈稀释至刻度。检测波长的选择。称取对照品储备液0.6ml,以流动相为参比溶液,甘草苷在276nm处有一最大吸收峰。线性关系考察。取上述对照品储备液0.2ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml在于容量瓶中,用20%乙腈稀释至刻度,按上述色谱条件分别进样20l测定其峰面积。高效液相色谱法同时测定甘草中甘草酸、甘草苷、异甘草素的含量建立同时测定甘草中甘草酸、甘草苷和异甘草素含量的方法。方法采用高效液相色谱法对甘草粉末的67%甲醇提取物进行分析。用C18反相色谱柱,1%磷酸水-乙腈梯度洗脱,对不同色谱峰分别采用248、276、360、370 nm紫外波长检测。结果甘草酸的回归方程为Y1106X16 220,r21；甘草苷的回归方程为Y2106X49 444,r20.999 5；异甘草素的回归方程为Y1107X4.466 7,r21。甘草酸、甘草苷和异甘草素的加样回收率分别为98.01%、102.63%、98.18%。结论本方法准确、稳定、可靠,可用于甘草中甘草酸、甘草苷和异甘草素3种成分的同时测定。色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax Extend分析柱(4.6 mm250 mm,5m)；柱温：25；进行梯度洗脱,流动相A为1%磷酸水溶液,流动相B为乙腈；进样量为10L2.3供试品溶液的制备精密称取甘草粉末(过60目筛,60干燥12 h)0.1 g,置25 mL容量瓶中,加入20 mL 67%甲醇冷浸24 h,超声30 min,放至室温,加67%甲醇至刻度,摇匀,以0.45m微孔滤膜滤过,取续滤液即得。工作曲线称取甘草苷对照品6.28 mg、甘草酸对照品5.99 mg,分别用甲醇定容于25 mL容量瓶中,作为甘草苷和甘草酸对照品储备液。另取异甘草素对照品4.35 mg,置25 mL容量瓶中,以甲醇溶解并稀释至刻度,再精密吸取0.4 mL置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得异甘草素储备液。分别精密吸取甘草苷储备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,甘草酸储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL,异甘草素储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL,置6个10 mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,作为系列混合标准溶液。分别进样20L,记录甘草苷、甘草酸和异甘草素的峰面积。以峰面积对进样量(g)进行回归,得回归方程。光甘草定与甘草酸的联合提取、分离纯化研究2.2.2光甘草定与甘草酸对照品溶液的配制精密称取光甘草定对照品2.0mg，置10mL容量瓶中，加乙睛溶解并稀释至刻度，得对照品贮备液I;另精密称取甘草酸对照品10.0mg，置5mL容量瓶中，加乙睛溶解并稀释至刻度，得对照品贮备液n。分别精密吸取一定量上述贮备液I、n，制得混合标准溶液系列，取10林L进样，测定。光甘草定与甘草酸样品含量测定方法光甘草定与甘草酸含量测定采用高效液相色谱法。色谱条件如下:色谱柱:DiamodsilTMels柱(5娜，4.6nunx25onun);流动相:A为乙睛，B为0.050，0三氟乙酸水溶液;柱温:30;流速:1.0mL/min;检测波长:230nm;进样量10林L;梯度洗脱:0.01一3min，A:B二46:54;20min，A:B=80:20;20.01min，A:B=85:15;24min，A:B=46:54;35min，stoP。2实验方法2.1 HPLC条件分析柱为SB C18色谱柱（5m，150mm4.6mm，安捷伦公司）。流动相：乙腈：水=3：7（v/v）；UV检测波长370nm；流速：1.0mL/min；柱温：室温20；进样量：20L。2.2异甘草素标准曲线的测定准确称取异甘草素对照品10.00mg，甲醇定容于10mL容量瓶中，作为储备液。分别吸取异甘草素储备液2、4、6、8、10、15和20L，在HPLC检测条件下进行分析。以异甘草素的峰面积（Y）对其浓度X（g/L）进行回归，得线性方程：Y=40.81X-0.30，相关系数R2=0.996。2.3原料的前处理准确称取甘草原料若干，加一定量的提取溶剂，在不同温度下提取一定的时间，即按L9（34）的正交设计表中条件对原料进行处理提取后倾出上层清液，残渣以同样条件再次提取1次，合并上层清液过滤，将滤液在真空60下蒸发浓缩至干。2.4制备单柱分离异甘草素将前处理得到的提取物配置成60mL进样体积、100g/L浓度的进样溶液，进入1号色谱柱中分离，采用等梯度洗脱，即分别用体积比为3：7、1：1、7：3的甲醇水溶液洗脱色谱柱，每种流动相冲洗至洗脱液检测无明显色谱响应时停止；最后用纯甲醇将制备柱洗脱干净。将含目标物的1：1甲醇水冲洗馏分段蒸发浓缩，重新配置进样溶液，进入2号色谱柱分离，流动相为体积比1：1的甲醇水溶液，每500mL接收馏分1次，将目标馏分浓缩并干燥。2.5产品的后处理经单柱分离后得到的产品在不同的温度下浓缩至干，用少量纯甲醇溶解，室温放置于通风橱中，第2天得到黄色固体粉末。【技术与方法】高效液相色谱法测定不同产地甘草中甘草苷的含量建立高效液相色谱法测定不同产地甘草中甘草苷的含量。方法色谱柱为Waters C18(46mm150 mm, 5m),流动相为甲醇水(3565);流速08 ml/min;柱温为室温,检测波长为270 nm,采用外标法定量测定。结果该方法测定甘草苷在048480g范围内有良好的线性关系,r=0999 5。121色谱分析条件色谱柱为WatersC18色谱柱(46 mm150 mm, 5m);流动相为甲醇水(3565);流速08 ml/min;检测波长270 nm;柱温为室温;进样体积10L122对照品溶液的制备取甘草苷对照品564mg,精密称定,置25 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得对照品溶液。123供试品溶液制备甘草药材研成粉末,称取05 g,放入圆底烧瓶中,加70%乙醇回流3次, 25ml/次,每次1 h,过滤,滤液至蒸发皿中,蒸干,取出加甲醇定容于25 ml容量瓶中,微孔滤膜过滤,即供试品溶液。石墨炉原子吸收光谱法测定甘草中铜应用石墨炉原子吸收光谱法(GFAAS)对甘草中微量元素铜的含量进行了测定，并对GFAAS若干条件进行了优化选择结果表明：该法铜的线性范围20100 ng/mL，平均回收率99%，相对标准偏差在1.66%以下，结果可靠，方法简便，可用于实际样品的测定。1.2样品处理将甘草用蒸馏水洗去表面泥沙，置通风阴凉处自然风干，置于120干燥箱中2 h，粉碎研细后过筛备用1.2.1直接消化法准确称取上述甘草粉末1 g，至于100 mL烧杯中，加入10 mL浓硝酸，盖上表面皿放置过夜次日小火加热分解样品，至蒸发近干后，加入浓硝酸20 mL、高氯酸5 mL，加热消解至溶液无色