SOD测试方法.doc

SOD体外活性测定方法：化学发光法化学发光免疫测定法紫外分光光度计电子自旋共振（ESR）光谱法脉冲辐解法电泳法化学发光法 （实验室法）原理：在有氧条件下，黄嘌呤氧化酶能催化黄嘌呤或次黄嘌呤生成尿酸和O2，O2可与化学发光剂鲁米诺或海莹莹光素诱导剂反应，使发光剂被激发到激发态，而它返回基态时便会向外发光即化学发光，SOD能抑制发光剂化学发光，根据其抑制程度可测得SOD活性。 测定方法：于25条件下，先向各管加入PH5.6的磷酸盐缓冲液0.6ml，1mmol/L的EDTA-Na2溶液0.1ml，1mmol/L黄嘌呤溶液0.1ml，5mol/L的CLA溶液0.1ml，测试管中再加入10l待测样本（对照管中以10L生理盐水替代），放入发光仪测试室，最后加入100l黄嘌呤氧化酶应用液以启动反应，立即开启脚踏开关或自体起始开关开始测定，仪器自动记录并打印样本，及时照管发光强度值。酶活性单位为特定试验条件下，抑制50%发光强度时的酶浓度。该法时间响应快、灵敏度高、专一性强、分析精确、样品用量少，但需要高灵敏度的精密发光测量仪器，因此在临床推广中受到限制。化学发光免疫测定法 （实验室法）原理：把发光剂如鲁米诺及其衍生物N-氨基丁基-N-乙基鲁米诺（ABEI）加入到一个免疫反应体系中，取代放射性同位素，最终以发光强度来计算表征待测物质的量。测定方法：测定管中含标记CuZn-SOD，1：4000稀释的免抗CuZn-SOD的抗血清和样品或标准品各100L，特异性结合管中含标记CuZn-SOD，稀释的免抗CuZn-SOD的抗血清和稀释液各100L，非特异结合管中则只含100L标记CuZn-SOD，再稀释至300L，然后各管均加入500L分离剂，充分混合，4放置过夜，2000xg离心20min，弃去上清夜，用2mol/L NaOH 200L溶解沉淀，在50保温3h，取出置室温平衡后，加氧化血红素液800L，充分混匀，用原位加样器加入H2O2 200L，起动反应，进行发光测试，根据发光峰与标准曲线比较，即可计算出SOD含量。用发光剂取代放射性同位素的优点是避免了入射性污染，标记物可长期保存，而在灵敏度和特异性上均可与放射性免疫测定相媲美。另外，Hyland K I等建立了碱性二甲基亚砜法；Richard E R以及龚国清等建立了碱性二甲基亚砜发光法；翁元凯基于碱性水溶液中电对SO3（2-）/S2O4（2-）和O2/O2标准电极电势的不同，以鲁米诺为发光剂，建立了产生O2的氧饱和碱性连二亚硫酸钠法，通过检测SOD抑制化学发光的程度计算SOD活性。紫外分光光度计（企业仪器）原理：物质的吸收光谱本质上就是物质中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波长的光能量，相应地发生了分子振动能级跃迁和电子能级跃迁的结果。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同。因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量，这就是分光光度定性和定量分析的基础。分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段。又因为许多物质在紫外-可见光区有特征吸收峰，所以可用紫外分光光度法对这些物质分别进行测定（定量分析和定性分析）。紫外分光光度法使用基于朗伯-比耳定律。朗伯-比耳定律(LambertBeer)是光吸收的基本定律，俗称光吸收定律，是分光光度法定量分析的依据和基础。当入射光波长一定时，溶液的吸光度A是吸光物质的浓度C及吸收介质厚度l(吸收光程)的函数。方法：首先确定实验条件，并在此条件下测得标准物质的吸收峰以及其对应波长值（同时可获得该物质的最大吸收波长）；再在选定的波长范围内（或最大波长值处），分别以（不同浓度）标准溶液的吸光度和溶液浓度为横、纵坐标绘出化合物溶液的标准曲线得到其所对应的数学方程；接着在相同实验条件下配制待测溶液，测得待测溶液的吸光度，最后用已获得的标准曲线方程求出待测溶液中所需测定的化合物的含量。电子自旋共振（ESR）光谱法（实验室仪器） 方法：在室温下，溶液中O2-的ESR信号不能直接被检测出，但能够通过自旋捕捉法间接获得。最常见的诱捕剂是5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide(DMPO)。由于O2- 诱捕DMPO会产生一个特殊的光谱图，因此ESR法是O2-检测的方法中特异性最好的一种。然而，DMPO与O2-间的二阶速度常数比O2-自发反应常数相对要低，因此需要向溶液中加入大量的DMPO（如：终浓度为0.45M）。这样，每次试验所要用的DMPO将花去大笔的经费。脉冲辐解法基本原理：可以用附图所示最典型的一种脉冲辐解装置来说明，装置由脉冲辐射源（一般为电子加速器）、高纯石英玻璃制样品照射池、光学探测系统、信号记录系统、数据处理和控制系统和一个执行控制指令的触发器组成。辐射源给出一个高强度（单个脉冲的剂量约达110-2 戈瑞）、短脉宽（10-6 秒）的脉冲辐射，在受照样品中引起分子的激发和电离，并产生足够高浓度的各种短暂存在的化学产物（如激发态、离子、自由基），这些瞬态产物往往在某些特征的波段上对光强烈吸收；将分析光源（常用高压氙灯）发出的监测光通过受照样品，经光学系统聚光和单色仪分光后由光探测器接收，后者把透射光的强度转换为输出电流，脉冲辐照后电流随时间的变化反映了瞬态产物浓度的变化，从而给出样品中由辐射引起的瞬态产物衰变或积累的反应动力学信息。在不同的波长上观察脉冲辐照后样品透射率（或吸利用光吸收探测瞬态辐解产物的脉冲辐解装原理图收率）随时间的变化，能得出瞬态产物在不同时刻的吸收光谱。电泳法（实验室）