在乙肝病毒感染的HepG2细胞中对亚病毒纤维体的形态发生.doc

原 文： Ultrastructural Analysis of Hepatitis B Virus in HepG2-TransfectedCells With Special Emphasis on Subviral Filament Morphogenesis作 者： PHILIPPE ROINGEARD AND CAMILLE SUREAU作者单位： Laboratoire de Biologie Cellulaire, EP CNRS 117, Faculte de Medecine de Tours, 2 bis Boulevard Tonnelle,F-37032 Tours Cedex France. 发表刊物： HEPATOLOGY Vol. 28, No. 4, 1998 以下为中文翻译稿 ： 在乙肝病毒感染的HepG2细胞中对亚病毒纤维体的形态发生进行的超微结构分析摘要：空乙肝病毒（HBV）的纤维状颗粒在细胞内的积累，会导致细胞的病变，即所谓的毛玻璃样肝细胞。这次研究的目的是，在细胞水平上阐明这种纤维体的形成。通过电子显微镜，我们再次研究了产生乙肝病毒的HepG2T-14细胞，此细胞可以产生大量的空的乙肝纤维体以及其它形成的乙肝病毒颗粒。通过观察HepG2T14细胞的超薄切片，表明了在相当大的细胞内囊泡周围，可能和前高尔基体有关，产生了乙肝病毒颗粒和纤维体。囊膜长的部分形成管状的出芽，产生非常长的纤维体。这种现象和在乙肝慢性携带者的肝细胞中观察到的相类似，在其中，感染的细胞不能通过细胞分泌途径来外运长的乙肝纤维体，这似乎直接缘于细胞的病变效应。前言：乙肝病毒（HBV）是有包膜的嗜肝DNA病毒，在世界范围内它感染众多的人群1。乙肝基因组包含在带有病毒编码的聚合酶的核衣壳之中，其外还带有来自于宿主的脂膜成分，脂膜中含有三种病毒表面蛋白2。大（L）蛋白，包含有preS1，preS2和S区域，它是从表面蛋白开放阅读框的第一个启起密码处翻译得来。中等（M）蛋白，包含有preS2和S区域，以及小的（S）蛋白，它们是从同框的较下游的启始密码处翻译得来，在合成过程中，所有三种蛋白共同翻译，作为跨膜蛋白（它们彼此之间可以形成二硫键），它们被插入到内质网中3。蛋白S跨内质网膜至少2次，形成了细胞质环以及腔内的部分4。蛋白M有着相似的拓扑结构，带有额外的N末端preS2结构域，定位于内质网腔中5。蛋白L能够形成两种不同的跨膜拓扑结构，允许N末端的preS结构域暴露于腔体内或内质网膜的细胞质一侧6。后者的形式对于乙肝的形态发生有着重要的作用，它建立起了细胞质核心颗粒，和蛋白L的特异的preS结构域上的序列的蛋白之间的相互作用7,8。和其它病毒相比较，乙肝形态发生上的一个特别之处在于，它的表面蛋白不仅包膜核衣壳而形成成熟的病毒粒子，而且在缺少核衣壳的条件下，它还会形成球状或纤维状的空的亚病毒颗粒2。尽管包膜化的所有乙肝病毒颗粒包含有蛋白M和S，但纤维体和病毒粒子包膜却富含蛋白L2。在形态发生过程中，在缺少其它任何别的病毒蛋白的情况下，蛋白M和S能够出芽进post-ER/pre-Golgi体中，形成20nm的球形颗粒，然后通过分泌途径被释放出去9。相比较，蛋白L不能够通过自身而分泌出去，只有当和其它表面蛋白共表达时才可能完成分泌。这种颗粒的形态和分泌的效率依靠相关的其它表面蛋白的数量。少量的蛋白L导致产生可分泌的球状的乙肝亚病毒颗粒，然而大量的蛋白L将产生不能有效分泌的纤维体10。尽管用突变的乙肝DNA转染HuH7和HepG2细胞的乙肝形态发生被广泛地研究，但在细胞水平的乙肝病毒颗粒的形态发生的超微结构研究还没有被充分阐明。特别的，长的L蛋白富集的纤维体颗粒的形态发生过程任是一个谜。在此次研究中，我们通过在多年前发展的HepG2-14细胞中的乙肝复制实验11,12，进行了超微结构的研究，特别关注了乙肝亚病毒包膜纤维体的形成。材料和方法：细胞，HepG2-T14细胞株如其它地方所描述的11,12。用克隆的乙肝DNA转染HepG2细胞，产生乙肝病毒颗粒11，此颗粒可以感染黑猩猩13，由此来筛选细胞株。通过电镜观察，乙肝病毒颗粒和亚病毒包膜化的纤维体可以在细胞内囊泡中发现12，相比较，用其它的感染产生乙肝病毒的细胞株，如HepG2-T2.2.15，则观察不到细胞内的这种颗粒14,15。这是由于在HepG2-14细胞中可以高水平表达蛋白L的结果，如可以通过强的免疫细胞化学方法对这些细胞中的preS1抗原进行检测12。HepG2-T14细胞株和HepG2亲本细胞株一样，在37的CO2条件下，RPMI1640培养基中培养，并加入浓度为20%的灭活胎牛血清（Gibico），100U/mL的亲霉素和100mg/mL的链霉素。上清液的电镜观察收集细胞于细胞收集器中，5000转4下离心1小时。澄清后的培养基加入到20%的蔗糖溶液中，其中含有150mmol/L的NaCl和20mmol/L的Tris盐酸，PH值为7.4（TNE），用SW27转头（Beckman, Somerset, NJ），25000转4下离心16小时。沉淀重悬于TNE中，进行梯度氯化铯离心，TNE中的wt/vol为20%到50%，用SW41转头（Beckman），35000转，4下离心16小时。从管子的底部收集离心样品，并测定其密度。密度在1.20和1.24g/cm3的部分被收集并进行透析。此处理后的样品加于镀碳的铜网上放置1分钟。铜网用2%的醋酸铀进行负染1分钟，完全干燥后，铜网在Jeol 1010XC电镜下观察（Tokyo, Japan）。细胞水平的电镜观察，HepG2-T14细胞直截用HepG2细胞作为对照进行超微结构分析。细胞用胰酶消化，收集，用标准的磷酸缓冲液冲洗，在含有4%的多聚甲醛，1%的戊二醛的0.1mol/L的磷酸缓冲液（PH值7.2）中进行固定，放置48小时。之后，细胞用磷酸缓冲液冲洗，收集，用1%的四氧化锇固定1小时。进行梯度丙酮脱水后，细胞被包埋于环氧树脂中，在60下聚合反应24小时。用Reichert 超薄切片机（Heidelberg, Germang）制做超薄切片，收集切片于铜网上，用1%的醋酸铀和1%的柠檬酸铅进行染色。一百个HepG2-T14细胞样品和二十五个HepG2细胞样品（每个样品包含大约100到200个细胞部分）用Jeol 1010XC电镜进行观察。结果：通过负染对HepG2-T14细胞的上清进行分析，发现其中含有三种类型的乙肝病毒颗粒，包括完整的病毒粒子，球状的亚病毒包膜颗粒和纤维状颗粒（图1）。然而，更广泛和精确的研究表明了一种乙肝病毒颗粒不同寻常的现象，即在一个包膜中有多于一个的核衣壳（图1A，E和F）。图1，HepG2-T14细胞培养基中的乙肝病毒粒子和亚病毒颗粒的负染观察。标尺F=100nm，如其它地方。A、E和F中的表示在同一包膜中包装进多个核衣壳。HepG2-T14细胞的超薄切片观察发现，有大概和post-ER/pre-Golgi体相关的相当膨胀的囊泡出现，因为其总表现为光滑的小泡体。这种大的囊泡，直径可以达到5m以上，这种现象在HepG2亲本细胞系中从未观察到。这些大的、膨胀的囊泡包含有乙肝病毒粒子和亚病毒包膜纤维体，和用负染在培养基中观察到的颗粒形态类似（图1）12。然而，更广泛的，使用多于10,000个HepG2-T14细胞进行的观察发现了一些新的信息，这可以解释在这些囊泡周围这种亚病毒包膜纤维体是如何形成的。图2和图3显示了在2个不同的HepG2-T14细胞中的2个非常大的囊泡，在其中，长的亚病毒纤维和一些病毒粒子发现于这些囊泡的周围。这表明，核衣壳颗粒出芽进乙肝的包膜蛋白（包含有囊泡的膜），这个机制大概即完整的乙肝病毒颗粒的形态发生过程。更重要的是，这些观察表明，在这些膨胀的细胞内囊膜上进行的管状出芽，形成了这种长的亚病毒包膜纤维体。这个特征也在图4中观察到，其在四个不同的HepG2-T14细胞中存在有不同的囊泡，它们有着特别多的长的纤维体。图2，HepG2-T14细胞的超薄切片，在大的囊泡中存在乙肝病毒粒子和亚病毒包膜纤维体。A中的示尺为1m，B，C和D中的为100nm。A表示为低放大倍数下（大的白色箭头）直径大于5m的囊泡。B和D表示在高的放大倍数下对同一个囊泡的观察，囊泡膜上以管状出芽的方式形成亚病毒包膜纤维体。C表示在高的放大倍数下对囊泡腔体的观察，清楚地表明乙肝病毒粒子的核衣壳由一个包膜所包裹。A中的箭头表示在B、C和D中的放大部分。图3，HepG2-T14细胞囊泡中的乙肝病毒粒子和纤维体的形态发生。A中的标尺为1m，B和C的为100nm，在低的放大倍数下，A中的囊泡的箭头表示为在高的放大倍数下，B和C的部分。A中表现了通过管状出芽（在B中放大），亚病毒包膜纤维体出现在囊泡腔体中，以及病毒粒子在囊泡膜的出芽（在C中放大）。图4，在四个不同的HepG2-T14细胞中，长的亚病毒包膜纤维体的形态发生和在囊泡中的积累。D中的标尺为100nm，如其它地方。讨论：乙肝病毒包膜蛋白L的表达，导致了亚病毒包膜纤维体的形成，并且它和乙肝包膜蛋白一起滞留在细胞内的空间中10。蛋白L的这种滞留的机制还没有完全被阐明。先前的研究建立在用突变的乙肝蛋白L的细胞转染的基础上，揭示了蛋白L由于和细胞质因子相互作用而作为一种跨膜蛋白停留在内质网中。最近的研究表明，单独的蛋白L可以在细胞内形成20nm的球形颗粒，这和蛋白S和M形成的颗粒类似，但是它通过钙联蛋白停留在细胞的内膜系统17。然而，所谓的慢性乙肝感染的毛玻璃样肝细胞的形成似乎是由在细胞内积累的大量蛋白L纤维体所引起的。这种细胞内积累已经在病人的慢性乙肝感染的晚期中被观察到，特别是在肝硬化期间，当在细胞内高水平表达乙肝的表面蛋白，与之相联系的是低水平的乙肝表面蛋白免疫血清18,19。转基因小鼠的肝细胞带有这种蛋白L的积累滞留，则会发展为细胞的损伤作用20，它会诱导肝的再生，在这个模型中最终导致肝癌21。电镜观察这种来自于小鼠的过量表达蛋白L的肝的切片，发现了大约直径为20nm的亚病毒包膜纤维体，并且甚至可以延伸至800nm，它们积累于内质网中20。蛋白L的滞留也被发现和一种独特的综合症，即纤维淤胆性肝炎（FCH），相联系，它的特征为肝细胞的气球运动和有着显著的胆汁阻塞，但是它一般只有很少的炎症发生，它发生于免疫抑制的乙肝携带者22,23。来自于发生了FCH的病人的肝脏样品，通过电镜观察发现在细胞内膜系统中有着同样的乙肝亚病毒包膜纤维体的积累24。尽管这些对过量表达蛋白L的转基因小鼠和FCH病人的肝细胞进行电镜观察，得到了很多关于乙肝纤维体的信息20,24，但一个近来的研究表明，在HuH7细胞中过量表达蛋白L能够产生细胞内球状的颗粒而非形成纤维体17。作者不排除以下猜测，即在HuH7细胞中缺少亚病毒纤维体形成所需的细胞因子。然而，他们指出这样一种纤维状颗粒大概在相同的位置上通过积累和融合进许多球状颗粒17，我们的观察却表明，这种长的亚病毒包膜纤维通过管状出芽于囊膜上而形成，此囊泡处乙肝包膜蛋白已经积累了。这种在两个观察上发生的不一致现象，可能是由于两个研究中使用了不同的细胞系统。Xu 17等人使用的是HuH7细胞，是通过瞬时转染，并且在转染一些天后进行颗粒形成的检测，然而，我们使用的是HepG2-T14细胞，它可以稳定产生乙肝病毒。因为这些细胞可以长期产生乙肝病毒，颗粒积累处的囊泡大小会随着时间而增加，这种现象对于亚病毒包膜纤维体的形成是至关重要的。这种增大的囊泡在HuH7细胞中没有观察到，但仅在转基因小鼠的肝细胞20或FCH病人的肝细胞24中表现出亚病毒包膜纤维体累的现象。对HepG2-T14细胞释放到培养基中的乙肝病毒颗粒的检测表明，存在一种包含有核衣壳的纤维体，它是由同一个包膜包裹进2个或3个核衣壳颗粒。这种产生畸变的颗粒的意义还不清楚，因为在自然的乙肝携带者中还未发现有如此的颗粒。然而，这种类型的颗粒大概在体内或体外都缺少稳定性。尽管我们不能排除它们通过和乙肝病毒粒子的融合，而形成于HepG2-T14细胞的膜腔中，我们指出，这种畸变的颗粒也通过管状出芽形成于囊泡膜外，此处存在核衣壳，并且附近有着大量的蛋白L。这也表明了包装进包膜蛋白的事实，核衣壳需要存在蛋白L并且通过蛋白L的preS区域发生特异性的蛋白与蛋白间的相互作用7,8。如同在转基因小鼠模型20中的一样，我们在HepG2-T14细胞培养基中发现了较那些存在于细胞内的纤维体要短的形式。这可能表明，长的纤维体不能有效地通过细胞分泌途径运输，导致了它们在细胞内囊泡中的积累。其它的这种滞留的机制是，存在于内质网的分子伴侣蛋白的活性，但纤维体的大小似乎是分泌的限制因素，而非细胞内滞留的结果。总之，我们的研究在细胞内水平对乙肝相关的包膜纤维体的形态发生有了新的发现。乙肝亚病毒颗粒的纤维状形态的发生似乎是来自于大的，膨胀的囊泡，此囊泡通过管状出芽来形成纤维体。相当长的纤维体将滞留在囊泡中。因为包膜纤维体在细胞内的积累直接和乙肝携带者的肝细胞的损伤有关，我们的研究也许对设计出此类抗病毒药物有借鉴借值，即特异性地阻止长的纤维体的形成。参考文献：1. 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