1.甘草素的研究现状及其应用.doc

甘草素的研究现状及其应用张生元（武汉中博水产生物技术有限公司，湖北，武汉，430070）摘 要 本文扼要综述了甘草素(Liquiritigenin)的提取工艺、检测方法、药理功能、病害防治以及前景展望，以期为养殖生产和科研实践提供基础资料和参考依据。关键词 甘草素；提取工艺；检测方法；药理功能；病害防治；前景展望甘草(Glycyrrhiza)为豆科植物甘草属甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)等的干燥根及根茎，是极为重要的一味中药材，其有效成分主要为三萜类化合物和黄酮化合物2大类，其中，甘草甜素是甘草酸及其甘草酸盐的通称，属五环三萜皂苷，含量为6 %-14 %1。甘草素和异甘草素(Isoliquiritigenin)为甘草中的两个重要黄酮类化合物，甘草黄酮类成分具有明显的抗氧化作用，可预防肿瘤发生，治疗胃溃疡、肝损害，在抗炎和抗变态反应等方面也有明显的药理作用2-4。甘草素具有天然、高效、毒副作用小、抗药性不显著、资源丰富以及性能多样化等优点5-7。本文就甘草素的提取、合成、检测及其应用作一综述。1 甘草素的提取分离与化学合成甘草素和异甘草素是甘草中两个重要的黄酮类化合物。甘草素有广泛的药理作用，具有抗炎、抗病毒、保肝解毒及增强免疫功能等作用，临床上被用于治疗各种慢性肝炎8-10，近年来，还被用于治疗肝纤维化等，研究甘草中甘草素的提取工艺具有重要的意义11。1.1 甘草素的提取分离甘草素在甘草中所占的质量分数不高，对原药材的处理有超声波、微波、酶法、半仿生法等多种辅助手段。常用的提取方法有溶剂提取法和超临界萃取等。1.1.1 液液相萃取法分离经粉碎的甘草10 kg，分批用95 %乙醇热萃取，萃取液合并浓缩得深棕色糊状物。将其转移在2000 mI烧杯中，用1000 ml蒸馏水热溶解，转移到3000 m1分液漏斗中，分别用石油醚、乙酸乙酯三次萃取。将乙酸乙酯萃取液合并浓缩至糊状后减压浓缩干，得黄棕色粉状物。在其加入硅胶，研细并为均一体，上硅胶H(300-400目)柱，用乙酸乙酯-石油醚(1: 7)洗脱。洗脱剂部分I、弃去，洗脱剂部分加入硅胶，研细并为均一体，再次上硅胶H柱，用氯仿-乙酸乙酯(5: 1)洗脱，洗脱部分I为甘草素，洗脱部分为异甘草素。1.1.2 超临界CO2萃取将抽提原料加入萃取器，CO2用加压泵从缓冲器中抽出，经加热器加热到所需温度后送入萃取器。控制萃取器中CO2物位使全部原料浸入其中。缓慢打开萃取器出口阀。萃取液经过滤器流入分离器。打开分离器CO2出口阀，使CO2缓慢气化。气化后的CO2再经冷却器回流入缓冲器。夹带剂经泵从夹带剂贮缸加入萃取器。萃取完成后，关闭缓冲器CO2出口阀，停泵，将萃取器中萃取液全部放入分离器。缓慢回收分离器中CO2。待CO2回收完成后，打开分离器底部放料阀，放出萃取液。图l 超临界CO2萃取甘草素简化流程图l - 冷却器 2 - 加热器 3 - 夹带剂贮罐 4 - 萃取器 5 - 缓冲器 6 - 增压泵 7 - 泵 8 - 过滤器 9 - 分离器在不同萃取体系下，甘草素的萃取率也不同。仅用CO2作溶剂，而不使用任何夹带剂时，甘草素不能萃取出来。用CO2作溶剂，用乙醇的水溶液作夹带剂时，则甘草素和异甘草素均可萃取出来，且随着乙醇浓度的增大甘草索的萃取率提高。进一步研究得出最佳萃取温度为40 ，压力为35 MPa，萃取体系CO2-H2O-C2H5OH与物料的重量比为4 - 5，萃取时间为5 h。以上是提取甘草素的两种常用方法，各有优点，用液液相萃取法分离甘草素和异甘草素，有纯度高，工艺简单，成本低廉等优点。利用超临界技术萃取甘草素，可以缩短萃取时间，有效避免热敏性物质和易氧化物质的破坏，节省能耗，节省有机溶剂的用量。超临界萃取提高了对目标物质萃取的选择性，产物的品质好，对产品的后处理有利。是适合规模化生产的提取工艺。实验室制取少量的甘草素等甘草黄酮类物质时，还可以采用高速逆流色谱快速分离，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1: 2: 1: 1)为溶剂系统，上相作为固定相，下相作为流动相，主机旋转方向为顺时针，转速850 rpm，流速4.0 ml/min，紫外检测器波长设置为254 nm。根据紫外吸收色谱图手动收集各馏分,所得甘草素纯度可达95 %以上。1.2 甘草素的合成甘草素的合成步骤为先合成异甘草素，再在一定条件下将异甘草素转变为甘草素，属于经典黄酮类化合物的合成。其合成路线如下：1.2.1 傅氏反应制异甘草素用乙氧羰基乙酰基保护 P-香豆酸上的羟基，制成酰氯，再与间苯二酚在三氯化铝催化下进行傅氏反应，制得异甘草素(IV)。P-香豆酸(I)以对羟基苯甲醛和乙酸酐为原料或以对羟基苯甲醛和丙二酸为原料合成，O-乙氧羰基香豆酸(II)P-香豆酸和乙酰氯为原料合成。异甘草素合成 O-乙氧羰基香豆酸0.3 g(1.5 mmo1)，加入SOCl2 2 ml加热，60 反应l h，液体由无色变为浅褐黄色，减压蒸去紊反应完的SOCl2。TLC检测石油醚-丙酮(2: 1)，有一极性小于原料的斑点生成，趁热加入硝基苯0.6 ml，放置待用。另取间苯二酚05 g(4.5 mmo1)和硝基苯2 ml，加热至50- 60 ，使之全溶。降温，加无水AlCl3 0.33 g，升温至70-75 。滴加上述酰氯液，滴完降温至35 ，搅拌45 min，缓慢升温至90-l00，保温3-4 h。冷却，水汽蒸馏除去硝基苯，瓶内产生红色沉淀，滤集，滤物溶于4 %NaOH液5 ml，过滤，滤液酸化，调至中性，抽滤，滤渣经硅胶柱层层析石油醚-乙酸乙酯(2: 1)洗脱，得异甘草素0.06 g，产率20 %。1.2.2 羟醛缩合法制异甘草素先以间苯二酚和醋酸为原料合成1，3-二羟基 苯乙酮(V)，再在酸催化下的羟醛羟醛缩合法分碱催化法、酸催化法两种。用碱催化法羟醛缩合法制异甘草素，羟基苯甲醛和羟基苯乙酮缩合反应时，由于酚羟基易被氧化，特别是在碱性条件下，酚羟基变为酚钠盐，更易于被氧化。而且，催化时间长，在底物活泼羟基不被保护的情况下产率为10%。酸催化法是以对羟基苯甲醛和1，3-二羟基苯乙酮（以间苯二酚和醋酸为原料合成）为起始原料，用弱酸硼酸作为催化剂，并用高沸点的甘油或乙二醇为溶剂，在 120反应6h，加水后，水浴加热产物，趁热滤出上层清液。滤渣经硅胶柱层析，得黄色针状晶体异甘草素，产率约30%。1.2.2 异甘草素转变为甘草素用乙醇-氢氧化钠条件下回流，再酸化得产物，按此法得到的产物是甘草素和异甘草素的混合物，而不是纯甘草素。异甘草素和甘草素是两个互变异构体，酸性条件下后者开环生成异甘草素。酸化时用稀 HCl或AcOH均得到同样结果。因此改用醋酸钠-乙醇较温和的碱性条件，加热回流，冷却，且使乙醇自然挥发便得到纯甘草素沉淀。此法优点在于使整个体系始终为碱性，避免了酸化开环。加入异甘草素、醋酸钠、乙醇和水搅拌回流6h冷却,析出沉淀，滤集得浅黄色针状晶体即为甘草素，产率95%。所得甘草素的MS，IR及HNMR均与文献数据相符合。2 检测分析方法的研究2.1 高效液相色谱法高效液相色谱法具有准确，快速、简便等优点，是最可靠的方法。使用高效液相色谱法分析甘草素的研究比较完善，其主要分析条件见下表高效液相色谱法分析条件比较方法112213314色谱柱Cromasil C18柱250mm4.6mm 5m (i.d)ODS C18柱(100mm2.0mm，ID 5m )Liehrospher C18柱(250mm4.6mm，5m)流动相(A)甲醇- (B)5 冰醋酸(A)0.04 %甲酸溶液(pH 3)和(B)乙腈(A)为乙腈，(B)为0.1 %磷酸流速（ml/min）1.00.21.0检测波长（nm）276280230回收率（%）98 .01102.299.2相对标准偏差（%）0.681.48检测限（g/ml）50.0-125.015.8-252.8以上三种方法均采用梯度洗脱。方法1的洗脱程序为:甲醇从45 %到70 %，时间为0、15、20、25、30、40，A(%)为45、45、70、70、45、45，甘草素的保留时间为t =12.6。理论塔板数以甘草素计不低于3000，甘草素与相邻未知色谱峰的分离度不小于1.5。方法2洗脱程序为0-5min10 % B，45 min达到90 % B，甘草素的保留时间为23.1 min。方法3的洗脱程序为：流动相 A从14 %到60 %，时间为0、18、30、40、50、55、60、65 min，A(%)为14、20、28、35、40、60、14、14，甘草素的保留时间为34.728 min。2.2 高效毛细管电泳法高效毛细管电泳是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，根据样品各组分之间迁移率和分配行为的差异，而实现分离的一种新型电泳技术。关于高效毛细管电泳法作了内标法和外标法的研究。马宏伟等人研究了用内标法测定甘草素的方法。以葛根素为内标，甘草素在0.6125-0.9800 mg/L范围内有良好的线性关系回收率及重现性好。其方法概要：仪器Agilent毛细管电泳仪，二极管阵列检测器(DAD)，自动进样装置。HP Chemstation色谱工作站。毛细管电泳条件，毛细管：未涂层石英毛细管柱(75m50cm，有效长度42.5 cm)。运行电压：20 kV；毛细管温度25 ；测定波长s：320 nm，R = 380 nm,灵敏度0.020 AUFS；缓冲液40 mmol/L硼砂及10 %甲醇溶液为背景电解质，压力50 mbar进样，进样时间1.5 s。记录色谱图后计算。甘草素的迁移时间为14.987 min。 汪云等采用高效毛细管电泳分离并测定了甘草草药和复方甘草合剂中的甘草素和异甘草素的含量，实验条件：运行缓冲液为50 nunol/L的硼砂缓冲溶液(pH =9.0)，分离温度25 ，分离电压25 kV，检测波长212 nm，压力3000 Pa进样，进样时间1Os，甘草素和异甘草素在7 min内得到良好的分离：甘草素和异甘草素分别在1.010-4-5.010-7 g/mL、5.010-4-1.010-6g/mL范围内与电泳峰高呈良好的线性关系，检出限分别为5.010-8和2.010-7g/mL。3 甘草素的药理作用甘草素是甘草中重要的黄酮类物质之一，具有成分具有抑菌、抗真菌、抗肿瘤、抗诱变、抗病毒、抗氧化、保肝等广泛的药理作用。3.1 抗肿瘤、抗氧化作用活性氧或氧自由基在肿瘤发生的某一阶段发挥重要作用，它主要损害细胞膜包括血管内皮细胞膜及亚微结构并引发一系列有害的生化反应，氧自由基引起DNA碱基的损伤，导致基因突变，进而造成细胞突变或癌变。因而应用抗氧化剂预防肿瘤的发生日益受到人们的重视。甘草素可通过抗氧化作用预防肿瘤发生，并有抗癌细胞增殖、诱导癌细胞凋亡、干预癌细胞信号传导和增强抑癌基因活性及抑制癌基因表达等功效。 于鹏飞采用Fenton反应测定甘草总黄酮清除羟自由基的能力，结果证明，清除自由基能力与甘草总黄酮含量在一定范围内呈量效关系12。日本学者T. Hatano等报道了甘草根中黄酮类成分的清除自由基作用。（其中甘草素10010-5mol/L）该作用与5脂质氧化酶抑制作用相同。邹坤等发现甘草素和光甘草酮有显著的清除O的活性，光甘草酮对H202诱导的溶血具有良好的抑制作用，而甘草素和光甘草酮对(HPD+hv)诱导的溶血的抑制作用比某些典型的抗氧化剂都好，这一作用可以起到对DNA起保护作用13。甘草素用作抗肿瘤药物，配方如下：10 mg甘草素与5 g葡萄糖混合后装入管形瓶内，在使用前将该制剂溶于乙醇中并与0.85 %的盐水100 ml混合。3.2 保肝作用 甘草素在保肝方面的研究主要是以甘草总黄酮为基础的。甘草黄酮可清除自由基或抗脂质过氧化作用，从而减少肝损伤，具有保肝作用。王根生等人预先给小鼠以甘草中黄酮灌喂200、400、600 mgkg-1d-1,2 d能显著降低四氯化碳所致的血清谷丙转氨酶和乳酸脱氢醇活性的升高，以及肝内丙二醛所致的肝脏坏死，但对血清内酶活性无抑制作用，也不会减少正常小鼠血清中酶的活性。还报道甘草类黄酮可明显抑制小鼠肝脏MDA增高和还原性谷胱甘肽的耗竭，其作用呈一定的量效关系，电镜检查表明可保护乙醇所致肝细胞超微结构的损伤；并且能抑制肝组织脂质过氧化、提高小鼠肝脏SOD活性，减少肝组织脂褐素形成。忻文娟等人研究认为，黄酮为抗氧化剂，对O2-和OH-有明显的清除作用，而O2-和OH-可引发生物膜之不饱和脂肪酸脂质过氧化反应，损伤膜结构和功能，是炎症和多种疾病的生化基础，认为黄酮对小鼠肝损伤的保护作用与抗氧化作用有关14。3.3 抗病毒现代药理研究证明，甘草素与异甘草素有很强的抑制HIV病毒的能力。奥田拓男等发现，甘草中含有3种黄酮类成分对HIV增殖的抑制作用是甘草甜素的25倍15。从甘草鞣质活性成分研究中所得到的酚性成分(包括黄酮类成分)加强了人体免疫缺陷病毒(HIV)对ATL-IK(来源于成人T细胞性白血病患者的细胞株)的拮抗作用，其中2种新甘草查尔酮低浓度时显示出HIV增殖的抑制作用。申请了关于甘草黄酮类化台物治疗艾滋病(AIDS)的专利，并已用于临床治疗艾滋病。另据报道，由乌拉尔甘草中提取的甘草素等黄酮化合物具有抑HIV-1逆转录酶的作用。3.4 免疫增强作用陈超然（2000）等发现在中华鳖稚鳖饲料中舔加35 mg/kg的甘草素，不仅具有提高供试中华鳖免疫应答水平，改善肝功能，增强抗嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染的能力，同时还具有明显促生长作用16。陈昌福等在翘嘴鳜细菌性败血症的2种疫苗，即福尔马林灭活嗜水气单胞菌和菌体脂多糖中添加甘草素，经添加的疫苗接种后，受免翘嘴鳜头肾中白细胞的吞噬活性和经活菌攻毒后的免疫保护率显著高于未添加的免疫组(t 测验，P0.05)，3.5 其它作用抗炎作用：甘草中的甘草素和异甘草素对透明质酸 酶的活性和由免疫刺激所诱导的肥大细胞的组胺释放都有抑制作用。对慢性糖尿病并发症的作用：Aida K等报道，甘草素和异甘草素等黄酮类化合物具有抑制醛糖还原酶的作用，可降低红细胞、晶体及外周神经中山梨醇的含量。这些成分有希望用来治疗慢性糖尿病并发症，如改善神经传导功能，延迟自内障形成及蛋白尿出现等。抗溃疡：甘草素已作为消化性溃疡药收入日本医药品集中，对多种溃疡模型引起的药物性溃疡均有明显抑制作用，从甘草的水萃取液中离析出含甘草素、异甘草素、甘草甙、异甘草甙四种化合物的淡棕色物质，实验证明，鼠口服300 mg/kg时可完全抑制其溃疡发作，甘草素和异甘草素能抑制单胺氧化酶(MAO)，可用来治疗忧郁症。4 甘草素的水产养殖病害防治 现已证明甘草素在水产养殖临床上具有强肝，解毒，抑制溃疡发生和预防动脉硬化等多种药理学功能。在水产养殖病害防治中，最近的研究结果还证明甘草素具有抗病毒的辅助功能，增强五条鰤(Seriola quinqueradiata)抗链球菌(Streptococus sp.)感染的功能，将其与鱼用疫苗一起使用时，还能显示出较强的佐剂性（Adjuvant）。大量的生产实践和科学研究已经证明并将继续证明甘草素在水产养殖上具有广阔的应用空间，其在水产病害防治上将会扮演着越来越重要的角色。5 甘草素研究前景展望目前，甘草素是从甘草中提取的，杨立等人研究了甘草素和异甘草素的合成，但合成的总体收率很低，还不宜工业化生产。解决这一难题将为甘草素的广泛应用提供物质基础。其次，化学合成产物和天然产物往往存在如旋光异构的差异，直接影响其生物活性，目前还没有人开展化学合成甘草素与天然产物的差别，重要的是生物活性的测试工作。甘草在我国储备丰富，应用历史悠久，易被大众接受，甘草素可谓有着良好的“地利、人和”优势。然而，根据甘草素在养殖中的应用现状19-20，笔者认为，今后甘草素的发展趋势是实现其标准化生产，再加强对抽提物生物活性的检测、有效成分的确定、有效成分药理及药代动力学以及组伍配方的深入研究的基础上，建立抽提工艺、生产流程规范等标准和质量监测体系，才能生产出合格、高效的甘草素制剂。我们有理由深信，通过我国现代中医理论与世界先进技术的高度融合，甘草素制剂的研发必将再上一个新台阶，带来更大的经济效益和社会效益。参考文献1 张庆英，王学英，营海平，等飞廉化学成分研究中国中药杂志， 2001, 26(12): 837-8402 刘玉红，崔红梅，陈燕，等正交试验法研究甘草的提取工艺.中成药,2004, 26(3): 239-2413 湖北省水生生物研究所鱼类研究室，1976, 长江鱼类，北京：科学出版社 4 候江宏.草鱼脂肝病的诊断及治疗.科学养鱼，2003, 9: 495 徐立红，张甬元，陈宜瑜.分子生态毒理学研究进展及其在水环境保护中的意义.水生生物学报，1995, 19(2): 171-1856 徐萍，刘华屏.常用的急性肝损伤动物模型.中国病理生理杂志，1995, 11(4): 447-4487 鲁双庆，刘少军，刘红玉，等.CU2+对黄鳝肝脏保护酶SOD、CAT、GSH-PX活性的影响.中国水产科学，2002, 9(2): 138-1418 Li W, Asda Y, Yoshikawas T. 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