爱滋检测方法和步骤.doc

辽宁省丹东市传染病医院检验科作业指导书第十七节 人类免疫缺陷病毒标准操作规程文件编号：SH-SOP-017版本：2006-07生效日期：2006-07-01 珠海丽珠试剂（双抗原夹心酶联免疫法）检测HIV抗体实验原理本品用钝化基因工程人类免疫缺陷病毒型和型抗原宝贝的微孔板和酶标记的HIV-1/HIV-2抗原及其它试剂组成，应用双抗原夹心法原理检测人血清或血浆中HIV-1/HIV-2抗体，适用于献血员筛查及临床HIV抗体检测。试剂组成1 HIV抗原包被板 12孔8/8孔122 HIV酶标记物 7ml1瓶3 HIV阴性对照 1ml1瓶4 HIV阳性对照 1ml1瓶5 20倍浓缩洗液 50ml1瓶6 底物缓冲液 7ml1瓶7 底物液 7ml1瓶8 终止液 7ml1瓶9 封口袋 1个 10 封板膜 3张10 使用说明书 1份操作步骤1. 加样：将所需数量的板条固定于板架，每次试验设空白对照1孔，阳性对照2孔，阴性对照3孔分别加入阳阴性对照各50ul，其余孔加入50ul待测样品。2. 温育：置37温育30分钟。3. 洗涤：弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30-60秒，弃去孔内洗液。重复洗6次后拍干。4. 加酶：空白对照孔不加酶标记物，其余孔加入酶标记物50ul。5. 温育：置37温育30分钟。6. 弃去孔内液体，将稀释后的洗液注满各孔，静置30-60秒，弃去孔内洗液。重复洗6次后拍干。7. 显色：每孔加入底物缓冲液50ul，再加入底物液50ul，震荡混匀，置37温育30分钟。8. 终止：每孔加入终止液50ul，轻拍混匀。9. 读值：用酶标仪读值，在单波长450nm或双波长450nm/630nm下读取各孔A值。 辽宁省丹东市传染病医院检验科作业指导书第十七节 人类免疫缺陷病毒标准操作规程文件编号：SH-SOP-062版本：2006-07生效日期：2006-07-01 判定结果：1 要求： 阳性对照A值应0.8 阴性对照A值应0.122. 临界值（C.O.）计算： 临界值（C.O.）=0.15+阴性对照平均A值 注：阴性对照平均A值小于0.08按0.08计算，大于0.08按实际值计算。3 结果判断：样品值临界值（C.O.）为抗体阳性样品值临界值（C.O.）为抗体阴性4. 初次试验阳性者应重新取样进行双孔复试，如果复试中任何一孔为阳性则样品视为HIV抗体阳性，对复试结果为阴性的标本请按全国艾滋病检测技术规范处理。注意事项：样品的收集及保存1 待测的血清或血浆样品不可用NaN3防腐。2 短期内进行检测的血清或血浆样品可存放于2-8，如需长期保存，应置于-20。避免反复冻融。试验准备1. 本试剂的使用单位必须是经各级卫生行政部门批准的HIV检测实验室。2. 整个HIV检测必须符合全国艾滋病检测技术规范，严格防止交叉感染。操作时必须戴手套，穿工作服，严格健全和执行消毒隔离制度。3. 从冷藏环境中取出的试剂盒应平衡至室温后方可打开使用。4. 未使用完的预包被板条应置于有干燥剂的封口袋中密封保存。5. 若20倍浓缩洗液出现结晶，请置于37至溶解后在使用。6. 不同批号的试剂组分不可混用。7. 本试剂盒及各种废弃物阴按传染性物品处理。实验操作1 试剂使用前应充分摇匀。2 洗涤时各孔均须加满洗液，以防止孔口有游离酶标记物未被洗净。3 结果判读请在反应终止后15分钟内完成。4 测定结果必须以酶标仪读数为准。编写： 审核： 批 准： 批准日期：2006年07月01日辽宁省丹东市传染病医院检验科作业指导书第十七节 人类免疫缺陷病毒标准操作规程文件编号：SH-SOP-062版本：2006-07生效日期：2006-07-01北京万泰生物试剂目的： 本试剂盒定性检测人血清和血浆中的HIV-1/HIV-2抗体，适用于献血员筛查，临床检测及血液制品检测。原理： 本试剂和应用双抗原夹心酶联免疫法原理（ELISA）检测血清或血浆样品中人类免疫缺陷病HIV(1+2型) 抗体。与包被高纯度基因重组HIV(1+2型) 抗原，可与样品中抗HIV抗体反应，加入HRP标记HIV(1+2型) 抗原，然后用TMB地物作显色。通过酶表仪检测吸光度，从而判定样品中HIV抗体的存在与否。试剂盒组成： 1 HIV酶标板 12孔8/8孔122 HIV酶标试剂 10ml1瓶3 HIV-1型抗体阳性对照 1ml1瓶4 HIV-2型抗体阳性对照 1ml1瓶5 HIV 抗体阴性对照 1ml1瓶6 浓缩洗液 50ml1瓶7 显色剂A液 6ml1瓶8 显色剂B液 6ml1瓶9 终止液 6ml1瓶10. 封口袋 1个 11. 封板膜 3张12. 使用说明书 1份使用仪器： 加样器 温箱 洗板机 含波长450nm的酶标仪实验方法：1. 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。 2. 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照孔，阳性对照型，型各孔，空白对照孔。3. 加样: 分别在相应孔中加入待测样品或阴, 阳性对照100vl。 4. 温育：用封板膜封板后置371温育302分钟。 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，用洗扳机洗涤遍，最后一次尽量扣干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂100vl。空白孔除外。 7. 温育：操作同步骤。8. 洗涤：操作同步骤5。辽宁省丹东市传染病医院检验科作业指导书第十七节 人类免疫缺陷病毒标准操作规程文件编号：SH-SOP-062版本：2006-07生效日期：2006-07-01 9. 显色：每孔加入显色剂A B液各50vl，轻轻震荡混匀。371避光显色151分钟。 10. 测定：每孔加终止液50vl，轻轻震荡混匀。设定酶标仪波长于450nm处。测定各孔A值。结果判定：1. 阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔A值0.10。 2. 阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔A值0.80。 3. 临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照孔A均值+0.12 4. 阴性判定：样品A值临界值者为HIV抗体阳性（注意：初试阳性应重新取样双孔复试。复试阳性者应按全国艾滋病检测技术规范送HIV确证实验室进行确证试验。）注意事项：1. 本试剂的使用单位必须是经当地卫生行政部门批准的HIV处筛实验室。 2. 检测必须符合HIV实验室管理规范和生物安全守则的规定，严格防止交叉污染。操作时必须戴手套，穿工作服，严格健全和执行消毒隔离制度。所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。 3. 试剂盒从冷藏环境中取出是应置室温平衡15-30分钟后方可使用，未用完的微孔条用自封袋密封2-8保存。 4. 加样时必须用加样器加，并经常校对加样器的准确性。 5. 洗涤时各空均需加满洗液，防止空口内有游离酶不能洗净。使用洗扳机洗涤应设定30-60秒浸泡时间。 6. HIV抗体检测结果的判定必须以酶标仪读数为准。用双波长检测时，参考波长可用600-650nm。 7. 操作应严格按说明书进行。不同批次试剂不得混用。封板膜为一次性用品，不能重复使用。辽宁省丹东市传染病医院检验科作业指导书第十七节 人类免疫缺陷病毒标准操作规程文件编号：SH-SOP-062版本：2006-07生效日期：2006-07-01英科新创 检测原理： 本试剂盒采用双抗原夹心两步法检测人血清或血浆样本中的（HIV1/2）型抗体。采用多种HIV-1 和HIV-2的特异性抗原制作预包被板及酶结合物。当待检样本中存在HIV抗体时，在反应过程中形成“固相HIV抗原-HIV抗体-酶标记HIV抗原”的免疫复合物，加入底物后形成显色反应。 试剂组成： 微孔板 1包 8* 12T 酶标抗原 1瓶 14ml 阳性对照 1瓶 1 ml 阴性对照 1瓶 1 ml 洗涤液 2瓶 25 ml 显色剂A 1瓶 7 ml 显色剂B 1瓶 7 ml 终止液 1瓶 7 ml 说明书 1份 自封袋 1个 封板膜 3张样品的采集和保存：1 采集静脉的血清 血浆样本应在无菌条件下保存，并避免样品溶血及反复冻溶。2 血清和血浆样品收集后如果无法在当天检测，样品须在（2-8）保存；如果大于7天则需冷冻保存。操作步骤：1 平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温（18-25），微孔板开封后按需要取用，余者及时以自封袋封存。2 配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀，浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1: 19稀释后使用。3 编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。4 加样：按顺序分别在相应空加入50ul待测样品及阴阳性对照血清。辽宁省丹东市传染病医院检验科作业指导书第十七节 人类免疫缺陷病毒标准操作规程文件编号：SH-SOP-062版本：2006-07生效日期：2006-07-015 温育：覆上封板膜，置37温育30分钟6 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后拍干（每次应保持30-60秒浸泡时间）。7 加酶：分别在每孔中加入酶标抗原100ul。8 温育：覆上封板膜，置37温育30分钟9 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后拍干（每次应保持30-60秒浸泡时间）。10 显色：每孔加底物A B 各50ul，轻拍混匀，覆上封板膜，37暗置20分钟。11 终止：每孔加入终止液50ul，混匀。12 测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时，需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果。结果判定：1 阳性对照均值应大于阴性对照均值0.60以上且阴性对照均值小于0.10方可认为本次试验有效。2 临界值计算：cutoff value=0.10+阴性对照均值（若阴性对照均值小于0.05，以0.05计）3 样品OD值大于或等于临界值为初筛阳性，小于临界值为阴性。初筛阳性者重新取样双孔复试，复试阳性者应按照“全国HIV监测管理规范”送HIV确认实验室进行确认试验。注意事项：1 本检测试剂仅用于体外诊断试验。仅用于人血清或血浆样本，其他体液和样本可能得不到准确的结果。2 本试剂的使用单位必须是经当地卫生行政部门批准的HIV处筛实验