浅谈HPLC法检测咸鸭蛋中非法添加苏丹红染料.doc

浅谈HPLC法检测咸鸭蛋中非法添加苏丹红染料杨沫银内蒙古食品药品检验所（010020）摘要：目的：完善检测方法，更好的监控非法添加物。方法：采用高效液相色谱法，改变提取溶剂。结果：苏丹红、分别在0g/ml2.56g/ml范围呈良好线性关系，回收率在66%80%之间，方法最低检出限在3.3g/Kg7.5g/Kg（按蛋总重计算）之间。结论：方法简便，结果准确。关键词：咸鸭蛋 高效液相色谱法 苏丹红Abstract Objective: To perfect the method of measure method, Better monitoring of illegal additives. Method: Adopt HPLC to change the solvent extraction. Results: the calibration curve showed a good linearity with the range of 0g/ml -2.56g/ml for sudan , the range of recovery was 66%-80%, the limit of detection was 3.3g/kg-7.5g/kg (According to calculation of the total egg). Conclusion: the methed is simple and the result is accurate.苏丹红属于化工染料，有、号四种。据文献报道1，该物质具有偶氮结构，对人体的肝、肾器官有明显的毒副作用。经毒理学研究表明，苏丹红具有致突变性和致癌性，国家明令禁止添加于食品中。本方法参照相关文献2，将其提取方法进行了修订，改进后的方法具有分离效果好、灵敏、准确等优点。1.样品来源：市售。2.仪器与试药：2.1 仪器 美国安捷仑-1100高效液相色谱仪，紫外-可见检测器，离心机，旋转蒸发仪等。2.2 试剂 乙睛、丙酮、甲酸、为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。2.3 对照品 苏丹红由D-86199 Augsburg,Gemany提供 苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红纯度85%。2.4 层析用氧化铝（中性 100目200目）：105干燥2h，于干燥器中冷却至室温，每100g中加入2ml水降活，混匀密封，放置12h后使用。2.5 氧化铝层析柱：在层析柱管（1cm5cm的注射器管）底部塞入一薄层脱脂棉，干法装入处理过的氧化铝至3cm高，轻敲实后加一薄层脱脂棉，用10ml正己烷预淋洗，洗净柱中杂质后，备用。3.色谱条件：3.1 色谱柱：Agilent ZORBAX SB- C18 3.5m 4.6mm150mm3.2 流动相： A：0.1%甲酸的水溶液乙睛 （8515） B：0.1%甲酸的乙睛溶液丙酮（ 8020）流速：1ml/min；柱温：30；检测波长478nm；进样量：10l。梯度条件见表1表1 梯度条件时间（min）流动相A%B%0257510.0257525.0010032.0010035.0257540.025754.方法学考察4.1 溶液制备4.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红各10.0mg（按实际含量折算），置250ml量瓶中，加乙醚溶适量使溶解，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为标准储备液。精密吸取标准储备液0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ml，置25ml量瓶中，加丙酮稀释至刻度，即得。此标准系列浓度为0、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56g/ml。4.1.2 供试品溶液的制备 称取粉碎样品2g4g（准确至0.01g），置50ml离心管中，加入水3m，l匀浆1min将其分散成糊状，加入正己烷丙酮（31）6ml，充分匀浆5min，3000rpm离心10min，吸出正己烷液，于下层再加入次正己烷（4ml、4ml），匀浆，离心，合并3次正己烷液，加入无水硫酸钠1g脱水，滤过，滤液置旋转蒸发仪蒸干并保持5分钟，用正己烷溶解并缓缓转移至已处理氧化铝层析柱上，用正己烷少量多次冲洗浓缩瓶，一并注入层析柱，用40ml正己烷洗脱至流出液无色，蒸干，残渣用丙酮适量使溶解并定容至2ml，过微孔滤膜（0.45m），即得。4.2 含量计算 按公式（1）计算苏丹红含量 CVR = （1）MR：样品中苏丹红含量，单位为mg/Kg；C：由标准曲线得出的样液中苏丹红的浓度，单位为g/ml；V：样液定容体积，单位为m l；M：样品质量，单位为g。4.3线性关系的考察分别精密称取苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红各10 mg（按实际含量折算），置250ml量瓶中，加乙醚适量使溶解，加正己烷稀释至刻度，摇匀。精密吸取0ml、0.1ml、0.2 ml、0.4 ml、0.8 ml、1.6ml，置25ml量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10l进样，按上述色谱条件测定。以峰面积对进样量进行回归分析，绘制标准曲线。结果见表2表2 标准曲线测定结果序 号123456苏丹红浓度（g/ml）00.16080.32160.64331.28672.5735峰面积积分值平均值07.0048514.2162828.2511554.9508110.3807回归方程（苏丹红）y=42.78x+0.2488r=0.9999苏丹红浓度（g/ml）00.16710.33420.66841.33682.6736峰面积积分值平均值07.093414.1028429.9773558.42848117.8936回归方程（苏丹红）y=44.132x-0.1852r=0.9999苏丹红浓度（g/ml）00.15990.31980.63961.27922.5585峰面积积分值平均值06.78368513.0338727.8521754.41752110.2893回归方程（苏丹红）y=43.122x-0.2311r=0.9999苏丹红浓度（g/ml）00.16090.32180.64361.28722.5745峰面积积分值平均值05.94661511.7610424.911348.4411799.15771回归方程（苏丹红）y=38.504x-0.3077r=0.99994.4 回收率试验取已知不含添加剂的空白样品2份，分别精密加入苏丹红对照品适量，按拟订的含量测定方法制备供试品溶液，测定每份样品中苏丹红的含量，计算回收率。结果见表3表3 回收率试验结果编号取样量（g）对照品加入量（g）样品含量（g）回收率（%）1苏丹红2.3111.28670.917371.28苏丹红1.33680.989073.98苏丹红1.27920.853666.72苏丹红1.28721.032680.212苏丹红2.8811.28670.998277.57苏丹红1.33680.968872.47苏丹红1.27920.888169.42苏丹红1.28721.005778.134.5方法最低检出限试验取已知不含添加剂的空白样品，分别精密加入苏丹红对照品适量，按拟订的含量测定方法制备供试品溶液，测定每份样品中苏丹红的含量，计算最低检出限。结果见表4表4 最低检出限测定结果苏丹红苏丹红苏丹红苏丹红按总蛋重计算（g/Kg）3.37.17.17.5按蛋黄重计算（g/Kg）9.420.420.421.55.实验结果在选定的条件下，苏丹红（、）与样品中其他组分色谱峰可基线分离，分离度均大于1.5，且苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红色谱峰之间基线分离，分离度均大于1.5；按苏丹红（、）峰计算，理论板数（N）均在10000以上。对照品、供试品、加样回收试验、最低检出限试验的HPLC图谱见图14。6.讨论6.1 层析用氧化铝活化程度的考察 不同厂家和不同批号氧化铝的活度有差异，须根据具体购置的氧化铝产品略作调整，活度的调整采用标准溶液过柱，将1g/ml的苏丹红的混合标准溶液1ml加到柱中，用5%丙酮正己烷溶液60ml完全洗脱，4种苏丹红在层析柱上的流出顺序为苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红，可根据每种苏丹红的回收率作出判断。苏丹红、苏丹红的回收率较低表明氧化铝活性偏低，苏丹红的回收率偏低时表明活性偏高。为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，控制氧化铝表层吸附的色素带宽宜小于0.5cm。6.2溶解对照品溶剂的考察：文献2中，对照品用乙醚溶解后，用正己烷定容，其中苏丹红、苏丹红、苏丹红色谱峰峰形较好，但苏丹红色谱峰峰形较差，改用丙酮定容后，苏丹红、苏丹红、苏丹红、苏丹红色谱峰峰形均较好，理论板数均达到10000以上，故确定对照品定容溶剂为丙酮。6.3提取方法的考察：采用欧洲标准3方法，加样回收试验中，杂质峰较多，对照品色谱峰与样品中其他组分色谱峰不能基线分离，故未采用其方法；文献2中，在洗脱样品时采用10ml30ml正己烷淋洗氧化铝层析柱，直至流出液无色。弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60ml洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5ml，经0.45m有机滤膜过滤后待测。但实际加样回收试验中发现正己烷淋洗液中含有绝大部分对照品，而含5%丙酮的正己烷洗脱液中几乎无对照品，故将方法改为：在洗脱样品时用约40ml正己烷洗脱氧化铝层析柱，直至流出液无色，收集、蒸干后，用丙酮转移并定容至2ml，经0.45m有机滤膜过滤后待测，加样回收试验结果为回收率在66%80%之间，结果较好，采用改