针刺对2型糖尿病大鼠肝组织IRS-2mRNA的影响.pdf

1 1 针刺对针刺对 2 型糖尿病大鼠肝组织型糖尿病大鼠肝组织 IRS 2mRNA 的影响的影响1 袁爱红 刘志诚 龚美蓉 谢莉 南京中医药大学第二临床医学院 南京 210029 Email yuanah2004 摘摘 要 要 目的 探讨大鼠肝组织胰岛素受体底物 2 IRS 2 基因表达在 2 型糖尿病 T2DM 发病机制中的作用及针刺对 T2DM 大鼠肝组织 IRS 2 基因表达的影响 方法 SD 雄性大鼠 100 只 经高脂饲料喂养成肥胖大鼠 50 只 腹腔注射小剂量链脲佐菌素 Streptozotocin STZ 25mg kg 造模成 T2DM 大鼠 18 只 随机分为针刺组 药物组 优降糖 和模 型组 处理 4 周后 用快速血糖仪检测空腹血糖 FBS 用放免法检测空腹胰岛素 FINS 用实时定量荧光 PCR real time RT PCR 法检测肝组织 IRS 2 的基因表达 并与正常组大 鼠进行对照 结果 针刺组和药物组 FBS 水平比模型组显著降低 P0 05 针刺组 FINS 明显低于模型组 P0 05 药物 组 FINS 水平亦低于模型组 但无显著差异 P 0 05 模型组 IRS 2mRNA 相对含量为正 常组的 2 19 倍 针刺组 IRS 2mRNA 相对含量为正常组的 4 84 是模型组的 2 21 药物 组 IRS 2mRNA 相对含量为正常组的 4 59 倍 是模型组的 2 10 倍 结论 肝组织 IRS 2mRNA 表达异常可能是 T2DM 的发病机制之一 针刺具有显著抑制 T2DM 大鼠肝组织 IRS 2mRNA 表达的作用 关键词 关键词 2 型糖尿病 IRS 2mRNA real time RT PCR 法 针刺 1 引言引言 糖尿病是当今世界各国的常见病和多发病 其中 2 型糖尿病 T2DM 占发病人数的 90 以上 目前研究认为胰岛素受体底物 insulin receptor substrate IRS 家族与其发病相关 IRS 1 基因剔除大鼠表现为胰岛素抵抗 1 2 IRS 2 基因剔除大鼠表现为严重的糖尿病症状 3 也有文献报道 IRS 2 基因与 T2DM 无相关性 4 为了探讨 IRS 2 基因在 T2DM 发病中的作用 及针刺治疗 T2DM 取得疗效的同时对肝组织 IRS 2mRNA 表达的影响 我们采用实时荧光定 量 PCR real time RT PCR 法对实验性 T2DM 大鼠肝组织 IRS 2mRNA 的表达进行观察 2 材料和方法材料和方法 实验动物为刚断乳的 SD 雄性大鼠 平均体重 50g 左右 共 100 只 由上海实验动物中 心提供 2 1 2 型糖尿病大鼠模型研制型糖尿病大鼠模型研制 将刚断乳的 SD 雄性大鼠随机分为两组 一组用普通饲料喂养 16 周 为普通饲料组 20 只 另一组用自配高脂饲料喂养 16 周 为高脂饲料组 80 只 饲料配方见表 1 造模 方法 所有大鼠在造模期间自由摄食 饮水 饲料和水每日更换 1 次 观察方法 定时观察 大鼠的体重 W 体长 H LEE 氏指数 3体重 g 体长 cm 103 喂养 16 周以后 高脂饲料组中 体重高于普通饲料组平均体重 20 的 为单纯性肥胖大鼠 60 只 给肥胖大鼠腹腔注射小剂量链脲佐菌素 Streptozotocin STZ 25mg kg 高脂 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金 20040315008 的资助 2 2 饲料继续喂养一周后 禁食过夜 用罗氏活力型血糖仪测空腹血糖 空腹血糖高于 7mmol L 的即为 T2DM 大鼠 表 1 实验动物高脂饲料成分 g 100g 饲料成分 普通饲料 高脂饲料 标准粉 5 0 23 0 麸皮 14 0 9 0 大豆粉 20 0 13 0 玉米粉 24 0 16 0 鱼粉 5 0 3 0 猪油 12 0 蔗糖 5 0 鸡蛋 10 0 麻油 1 0 花生 5 0 食盐 1 0 2 0 酵母粉 1 0 0 5 2 2 针刺治疗针刺治疗 实验分组 普通饲料喂养的大鼠为正常对照组 简称正常组 6 只 将造模成功的 T2DM 大鼠随机分为模型对照组 6 只 针刺治疗组 6 只 药物治疗组 6 只 模型 对照组不作任何治疗 简称模型组 针刺治疗组给与针刺治疗 简称针刺组 药物治疗组给 与药物灌胃 简称药物组 治疗方法 针刺组 将大鼠放入自制大鼠固定器中 用 75 酒精消毒后三里 相当于 足三里 内庭和胰俞 用 36 号美容针分别刺入上穴 后三里和胰俞用平补平泻的捻转手 法运针 1 分钟 内庭穴用捻转泻法运针 0 5 分钟 然后将 G6805 型电针仪分别连接于后三里 和内庭穴 采用频率 10Hz 强度为 1V 的连续波 每次选择一侧肢体的穴位 治疗时间 15 分钟 每日 1 次 两侧肢体交替选择 连续治疗 4 周 药物组 采用优降糖片 格列本脲片 天津太平洋制药有限公司 2 5mg 100 按 1 6mg kg 日给药 稀释至 2ml 以灌胃方式给药 连续给药 4 周 治疗期间除针刺组外 其它组分别置于大鼠固定器中固定相同时间 在此期 间所有大鼠均以普通饲料喂养 自由摄食 饮水 2 3 观察指标观察指标 2 3 1 治疗前后空腹血糖 FBS 用罗氏活力型血糖仪检测 2 3 2 治疗后各组空腹胰岛素 FINS 放免法检测 南京市第一人民医院检测中心 参照 李氏引进的方法 计算胰岛素敏感性指数 IAI 1 FINS FPG 5 胰岛素抵抗指数 Homa IR FINS FPG 22 5 6 2 3 3 real time RT PCR 法观察大鼠肝组织 IRS 2mRNA 的表达 取材 实验结束后 禁食过夜 次日晨 9 时球后静脉采血 2ml 静置分离血清 20 保存待测空腹胰岛素 从每组中随机各取 3 只断头处死 置冰碟上 快速剖腹取一叶肝 锡箔纸包裹 置液氮中保存待测 IRS 2mRNA 含量 实时定量荧光 PCR 技术 3 3 总 RNA 的提取 取每组大鼠肝脏约 100mg 快速放入液氮中磨碎 加 lml 裂解液 混匀 室温静置 5min 后 在 4 下 12000rpm 离心 10min 取上清 转入无 RNase 离心管 加 0 2m1 氯仿 剧烈 震荡 30s 在 4 下静置 5min 后 再在 4 下 12000rpm 离心 15min 将水相转移到新离心 管 缓慢加入等体积的异丙醇 混匀 室温静置 20min 在 4 下 12000rpm 离心 15min 弃 废液 用 1 ml 75 乙醇洗净 风干后 用去核酶水溶解 用蛋白核酸分析仪测定 260 280nm OD 值 进行 RNA 纯度和含量测定 以 260nm OD 值为依据 取 RNA 样本进行反转录 反转录反应 反转录 PCR 试剂盒 promegaM MLV 试剂盒 基因扩增仪为 BIO RAD 公司提供的 MJ mini 采用 25ul 反应体系 反应液组成 Buffer 5u1 dNTP Mixture 各 10mol 1 25u1 RNase Inhibitor 0 625u1 M MLV Reverse Transcriptase 1u1 p1 oligodT Primer 1u1 实验样品 RNA 2ug RNase Free dH20 2ugRNA 1ul 引物 去核酶水 15ul 70 5 分钟 冰浴 5 分钟 42 60 分钟 冰浴 5 分钟 real time RT PCR 法 根据 GeneBank 提供的序列设计引物 设计软件为 primer5 引物由上海生工公司合成 实时定量 PCR 仪为 Stratagene 公司提供的 Mx3000P 实时定量 PCR 反应试剂盒亦为 Stratagene 公司提供 引物序列 IRS 2 5 GCTCGCATTCCTCAAACCA 3 5 TGTGACGGAGCAGCAAGGT 3 内参 actin 5 CGTAAAGACCTCTATGCCAACAC 3 5 CGGACTCATCGTACTCCTGCT 3 采用 25u1 反应体系 反应液组成如下 mix 缓冲液 酶 DNTP 12 5ul p1 10p 0 5ul p2 10p 0 5ul cDNA 2ul H2O 9 5ul IRS 2 反应条件 M MLV 灭火 95 10min 变性 95 30s 退火 53 1min 延伸 72 30s 共 45 个循环 4 4 actin 反应条件 M MLV 灭火 95 10min 变性 95 30s 退火 52 1min 延伸 72 30s 共 45 个循环 观察 CT 值的变化 CT 值是指 PCR 扩增过程中 荧光信号开始由本底进入指数增长阶 段的拐点所对应的循环次数 基因表达相对含量的计算 CT 正常 目标基因 正常 内参基 因 正常 CT 对照 目标基因 对照 内参基因 对照 CT CT 对照 CT 正常 计算 表达比率 2 CT 2 4 统计学方法 统计学方法 同组治疗前后比较及组间两两比较用 t 检验 治疗后多组资料比较用单因素方差检验 统计 软件用 SPSS11 5 3 结果结果 结果见表 2 表 3 图 1 和 2 3 1 治疗前后各组空腹血糖治疗前后各组空腹血糖 表 2 治疗前后各组空腹血糖表 sx 组别 例数 n 治疗前 mmol L 治疗后 mmol L 正常组 6 4 13 0 26 5 16 0 37 模型组 6 14 64 4 72 15 79 5 29 针刺组 6 12 23 4 96 5 46 0 58 药物组 6 11 11 4 85 5 26 0 37 注 与正常组比较 P 0 05 与治疗前比较P7mmol L 三组 与正常组相比均具有显著差异 P0 05 说明三组来自同 一大样本 治疗后针刺组和药物组 FBS 平均值均 7mmol L 与模型组相比有显著差异 P0 05 模型 组与正常组相比仍具有显著差异 P 0 05 药物组治疗前后相比具有显著差异 P 0 05 说明优降糖对于降血糖效果显著 针刺组治疗前后相比有显著差异 P0 05 正常组大鼠在治疗前后 FBS 平均值有显著差异 P 0 05 这可能与大鼠固定器长期固定 致血糖长期处于应激状态而 升高 确切机制有待进一步探讨 3 2 治疗后各组空腹胰岛素 胰岛素敏感指数和治疗后各组空腹胰岛素 胰岛素敏感指数和 Homa IR 5 5 表 3 治疗后各组空腹胰岛素水平与胰岛素敏感指数 sx 组别 例数 n FINS mIU L IAI Homa IR 正常组 6 23 74 4 78 1 52 0 19 5 42 1 20 模型组 6 35 50 12 07 0 68 0 44 27 57 10 38 针刺组 6 20 80 4 20 1 32 0 27 5 03 1 03 药物组 6 27 92 4 44 1 66 0 15 6 54 1 37 注 与模型组比较 P 0 05 从空腹胰岛素 FINS 水平来看 正常组 针刺组明显低于模型组 差异显著 P0 05 药物组胰岛素水平高于针刺组和正常组 但差异无特异性 P 0 05 说 明针刺与药物均能降低 T2DM 大鼠的 FINS 水平 针刺作用优于优降糖 从胰岛素敏感指数 IAI 和 Homa IR 来看 药物组 针刺组及正常组均与模型组有显著差异 P0 05 说明针刺和优降糖均可改善 T2DM 大鼠的胰岛素抵抗 3 3 治疗后各组治疗后各组 IRS 2 基因表达情况基因表达情况 图 1 治疗后各组 IRS 2mRNA 的 CT 值 按照基因表达相对含量的计算方法 我们计算出模型组 针刺组和药物组对正常组的 IRS 2mRNA 相对含量的倍数见图 2 图 2 治疗后各组 IRS 2mRNA 表达示意图 注 1 为正常组 2 为模型组 3 为针刺组 4 为药物组 1 2 19 4 84 4 59 0 1 2 3 4 5 1234 组别 倍数 6 6 4 讨论讨论 2 型糖尿病以胰岛素抵抗和胰岛素分泌的相对缺乏为特征 研究认为 受体和受体后水 平缺陷对胰岛素抵抗的发生具有重要意义 INS 与胰岛素受体的 亚基结合 使 亚基自身 磷酸化 激活 IRS 进而产生一系列的级链反应 IRS 是调节胰岛素信号通路的关健物质 目前发现的 IRS 蛋白家族有四个 IRS 1 IRS 2 IRS 3 和 IRS 4 IRS 1 与 IRS 2 是 调节胰岛素信号传导途径的重要接头 docking 蛋白 在机体各组织广泛表达 两者氨基 酸序列的排列相似 功能上相近 IRS 2 的作用不只局限于外周组织 Choudhury 等发现 IRS 2 在下丘脑胰岛素信号传导中也发挥着重要作用 7 IRS 2 与 T2DM 的关系报道各异 Friedman 等发现患妊娠糖尿病的肥胖者肌肉中 IRS 2 的蛋白表达较正常对照组高 1 5 至 2 倍 8 Catalano 等发现患妊娠糖尿病的肥胖妇女脂肪组 织中IRS 2的蛋白表达较正常对照组增高1 7倍 9 彭定琼等 10 发现OLETF大鼠肌肉中IRS 2 的蛋白表达较正常对照组增加 Kalidas 4 等研究认为 IRS 2 基因与 T 2DM 无相关性 本研 究发现模型组大鼠肝组织 IRS 2mRNA 表达是正常组的 2 19 倍 分析认为 IRS 2 基因表达异 常可能是 T2DM 发病的病理机制之一 有研究发现 IRS 1 和 IRS 2 的作用是互补的 正常情 况下 主要由 IRS 1 介导胰岛素的信号传导 当 IRS 1 表达显著减少时 机体就会代偿性的 增加 IRS 2 的表达 试图畅通胰岛素信号传导途径 而 IRS 2 想达到 IRS 1 介导的胰岛素信 号传导水平 必须要高水平的表达 本研究发现针刺和优降糖均可改善T2DM大鼠的FBS和FINS水平 增加胰岛素敏感性 改善胰岛素抵抗 但两者改善胰岛素抵抗的机制显然不同 针刺具有明显的抑制肝组织 IRS 2mRNA 表达的作用 而优降糖则明显增加了肝组织 IRS 2mRNA 的表达 很显然这肯 定与 IRS 1 和 IRS 2 在介导胰岛素信号传导中各自的作用相关 但目前对于 IRS 1 和 IRS 2 在胰岛素信号传导中的具体分工尚未明确 在本研究中发现针刺组大鼠肝组织 IRS 1mRNA 的表达显著高于正常组和模型组 11 IRS 2mRNA 的表达明显低于模型组和正常组 针刺在 此过程中发挥了重要的调节作用 笔者推测针刺可能通过上调 IRS 1mRNA 的表达 使 IRS 1 蛋白表达增多 竞争性地结合了胰岛素受体的 亚基 抑制了 亚基与 IRS 2 的结合 从而 抑制了 IRS 2mRNA 的表达 亦或针刺通过上调 IRS 1mRNA 的表达来抑制 IRS 2mRNA 的 表达 也可能针刺使IRS 2mRNA的稳定性降低 分解增加 至于针刺是如何平衡IRS 1mRNA 与 IRS 2mRNA 之间的表达 以及优降糖影响 T2DM 机体肝组织 IRS 表达的确切机制 有待 进一步研究 参考文献 1 Katsutaro Morino Kitt Falk Petersen Sylvie Dufour et al Reduced mitochondrial density and increased IRS 1 serine phosphorylation in muscle of insulin resistant offspring of type 2 diabetic parents J Clin Invest 2005 115 3587 3593 2 A Danielsson A Ost E Lystedt et al Insulin resistance in human adipocytes occurs downstream of IRS1 after surgical cell isolation but at the level of phosphorylation of IRS1 in type 2 diabetes FEBS J 2005 272 1 141 151 3 Domimic JW Julio SG Heather T et al Disruption of IRS 2 cause type 2 diabetes in mice Nature 1998 391 900 904 4 Kalidas K Wasson J Glaser B et al Mapping of the human insulin receptor substrate 2 gene identification of a linked polymorphic marker and linkage analysis on families with type diabetes no evidence for a major susceptibility role J diabetologia 1998 41 1390 1391 5 李光伟 潘孝仁 Stephen Lillioja 等 检测人群胰岛素敏感性的一项新指标 J 中华内科学杂志 1993 32 10 656 60 7 7 6 Haffner SM Miettinen H Stern MP The homeostasis model in the San Antonio Heart study J Diabetes Care 1977 20 7 1087 92 7 Agharul I Choudhury Helen Heffron Mark A Smith et al The role of insulin receptor substrate 2 in hypothalamic and cell function J Clin Invest Apr 2005 115 940 950 8 JE Friedman T Ishizuka J Shao et al Impaired glucose transport and insulin receptor tyrosine phosphorylation in skeletal muscle from obese women with gestational diabetes Diabetes Sep 1999 48 1807 9 Patrick M Catalano Steven E Nizielski Jianhua Shao et al Downregulated IRS 1 and PPAR in obese women with gestational diabetes relationship to FFA during pregnancy Am J Physiol Endocrinol Metab Mar 2002 282 E522 E533 10 彭定琼 郭晓蕙 陈宇 等 胰岛素受体底物 2 在 2 型糖尿病大鼠肌肉 脂肪 肝脏中的蛋白表达及其意 义 中国预防医学杂志 2006 7 5 405 407 11 刘志诚 袁爱红 龚美蓉 等 针刺对 2 型糖尿病大鼠肝组织 IRS 1mRNA 的影响 中国科技论文在线 200711 322 Effects of Acupuncture on Hepatic IRS 2mRNA Expression in Type 2 Diabetes Mellitus Model Rats Yuan Aihong Liu Zhicheng Gong Meirong Xie Li Second Clinical Medical College of Nanjing TCM Abstract Objective To research the effect of rat s hepatic IRS 2mRNA on pathologic mechanism of type 2 diabetes mellitus and the effect of acupuncture on the expression of hepatic IRS 2mRNA in T2DM model rats Method 50 of 100 SD male rats fed with high fat feedstuff became fat rats which were injected in abdomen with Streptozotocin 25mg kg to make T2DM rat models Then T2DM rats 18 were Stochastically devided into Glyburide group 6 acupunctu