实验七 淀粉酶动力学分析.doc

实验七 淀粉酶动力学分析（）淀粉酶解米氏常数测定与阿卡波糖竞争性抑制动力学计算（4学时） 第四部分 -淀粉酶Km值的测定一、实验目的了解并掌握米氏常数的意义和测定方法。二、实验原理当底物浓度在较低浓度增加时，酶促反应速度随着底物浓度的增加而迅速增加。当底物增至一定浓度后，即使再增加其浓度，反应速度也不会增加很快。这是由于酶浓度限制了所形成的中间络合物浓度的缘故。Michaelis和Menten推导得出底物浓度和酶促反应速度的关系式为：此式称为米氏方程，式中：为反应速度，即每升反应体系中每分钟形成葡萄糖的摩尔数（mol/（Lmin）；为最大反应速度（mol/（Lmin）；为底物浓度，此实验以反应体中淀粉中葡萄糖残基的摩尔浓度表示（mol/L），注意！应以反应体系总体积计算底物浓度，如淀粉溶液浓度为1%，反应体系中有3 mL淀粉溶液和1 mL淀粉酶液，则淀粉底物浓度应为：0.0463 mol/L101%的淀粉溶液浓度为10 g/L180淀粉中的葡萄糖残基的分子量3反应体系中1%淀粉溶液的体积（mL）1反应体系中-淀粉酶的体积（mL）为米氏常数，单位与底物浓度相同（mol/L）。按此方程，可用作图法求出，常用的方法为双倒数作图法。取米氏方程的倒数，以对作图：得一直线，其斜率为，截距为，求出。三、实验器材与试剂实验器材1-16. 见实验七第一部分17. 化学试剂：见实验七第二部分实验试剂1. pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液2. 1%淀粉溶液：称取1 g可溶性淀粉的200 mL烧杯中，用5 mL pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液调成糊状。另取200 mL烧杯，盛入95 mL pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，于电炉上烧开，倒入60 mL于盛有淀粉糊的烧杯中，搅拌均匀，继续煮开并搅拌至透明状，冷却后移至100 mL容量瓶中，用剩余缓冲液荡洗烧杯，倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度（老师准备）。 3. -淀粉酶：将活性为2000 u/mL的中温淀粉酶原酶液，用pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释4000倍（老师准备，现用现配）。 4. DNS试剂：见实验七第一部分（老师准备)四、实验方法取13支干燥的18180 mm试管，按下表编号，实验组做两份平行实验，加入pH5.0的淀粉溶液和-淀粉酶溶液，50反应10分钟，稀释一定倍数（约5倍，取1 mL反应液，加4 mL蒸馏水，混匀），取1 mL稀释液加DNS试剂，于沸水浴中加热2 min进行显色，取出后在盛有冷水的500 mL烧杯中冷却（注意换冷水），各加入蒸馏水9.0 mL，摇匀，以空白管为调零点，在540 nm波长测定吸光度值，从标准曲线查出葡萄糖的含量，算出酶反应速度（mol/（Lmin）。C从葡萄糖标准曲线中读得的葡萄糖含量，mg/mL= g/LX1酶解液的稀释倍数180葡萄糖的分子量10反应时间为10分钟以为纵坐标，为横坐标，作图，并算出Km、Vmax。根据公式得一直线，其斜率为，截距为，求出。管号项目01234561%淀粉溶液（mL）0.50.511.522.53pH5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（mL） 2.52.521.510.50-淀粉酶溶液（mL）1（煮沸灭活）11111150反应10分钟，稀释一定倍数（约5倍），取1 mL用于DNS反应。DNS溶液（mL）2.02.02.02.02.02.02.0沸水浴2 min后冷却蒸馏水（mL）9999999OD值S（mol/L）0.0463（mol/（Lmin）第五部分 抑制剂对酶活性的影响一、实验目的了解酶抑制剂的作用原理与应用学习酶抑制动力学的测定方法。二、实验原理酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。例如，氯化钠为唾液淀粉酶的激活剂，而阿卡波糖则是-淀粉酶的抑制剂，竞争性抑制小肠的-葡萄糖苷酶。很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性。酶的抑制剂可应用于酶学基础研究和药学等方面的应用研究。阿卡波糖由微生物发酵产生，是从放线菌Actinoplanes utahensis中分离得到的含有一个不饱和环多醇的四个单糖构成的寡糖，阿卡波糖于1990年由德国拜耳(Bayer)制药公司开发为降糖药上市。阿卡波糖为含有一个不饱和环多醇的四个单糖构成的寡糖，外观为白色或灰白色粉末，可溶于水，pKa值为5.1，分子式为C25H43NO18，分子量为645.6，化学结构如下：阿卡波糖是第3代口服降血糖药，具有降低餐后高血糖和血浆胰岛素浓度的作用，可用于胰岛素依赖型或非胰岛素依赖型糖尿病。阿卡波糖口服后能竞争性阻断小肠粘膜细胞刷状缘内的麦芽糖酶和蔗糖酶等双糖水解酶及胰腺-淀粉酶，结果使摄食的多糖、寡糖和双糖消化变成葡萄糖、果糖等单糖的吸收过程受到阻滞，避免了饭后的血糖急剧上升，所以能抑制餐后的高血糖，并抑制伴随的胰岛素分泌，改善过度的胰岛素反应，使血糖控制在良好状态。由于细菌-淀粉酶的作用底物与人体-糖苷酶底物同为淀粉，而阿卡波糖为淀粉的结构类似物，所以阿卡波糖对细菌-淀粉酶也有很强的竞争性抑制作用。通过在-淀粉酶酶解淀粉的反应体系中加入不同浓度的阿卡波糖抑制剂可以测定出阿卡波糖的竞争性抑制常数。三、实验器材与试剂实验器材1-16. 同实验七第一部分17. 化学试剂：阿卡波糖，其余见实验七第二部分实验试剂1. 1%淀粉溶液：见实验八第四部分（老师准备）2. 淀粉酶：见实验七第三部分（老师准备） 3. 阿卡波糖（分子量为645.6）溶液：配制为5 mg/ L溶液（老师准备）。4. DNS试剂：见实验七第一部分（老师准备） 四、实验方法取16支试管，按下表编号。0号管为调零对照；0a管为阿卡波糖对照；1-7号刻度管为加入不同浓度阿卡波糖抑制剂的反应，需设两组平行实验。按下表加入各种试剂后反应10分钟后取出，如颜色不深，直接取1 mL反应液加DNS试剂，稀释一定倍数（约5倍，取1 mL反应液，加4 mL蒸馏水，混匀），取1 mL稀释液加DNS试剂，于沸水浴中加热2 min进行显色，取出后在盛有冷水的500 mL烧杯中冷却（注意换冷水），各加入蒸馏水9.0 mL，摇匀，以空白管为调零点，在540 nm波长测定吸光度值，从标准曲线查出葡萄糖的含量，算出酶解反应速度。阿卡波糖浓度的计算：（mol/L）1反应体系中阿卡波糖的体积（mL）Ci加入反应体系中阿卡波糖的浓度（mg/L）1000由mg/L单位转为g/L单位时所乘的倍数645.6阿卡波糖的分子量。5反应体系中反应液的总体积（mL）淀粉底物浓度为：0.0370 （mol/L）3反应体系中1%淀粉溶液的体积（mL）3+1+1反应体系反应液的总体积（mL）（注：应根据0a号试管阿卡波糖对照中测定的还原糖含量计算1-7号试管的还原糖含量，如果对1-7号试管还原糖含量影响不大，阿卡波糖对还原糖含量影响可忽略不计）管号项目00a1234567蒸馏水（mL）1010.90.80.60.40.205 mg/L阿卡波糖溶液（mL）0100.10.20.40.60.81阿卡波糖浓度Ci（mg/L）100.10.20.40.60.811%淀粉溶液（mL）333333333-淀粉酶溶液（mL）1（煮沸灭活）1（煮沸灭活）111111150反应10分钟，稀释一定倍数（5倍），取1ml用于DNS反应DNS溶液（mL）2.02.02.02.02.02.02.02.02.0沸水浴2 min后冷却蒸馏水（mL）999999999OD值S（mol/L）0.037还原糖量（mg /mL）（mol/（Lmin）（mol/L）为五、实验报告1.内容与要求：按2009级生物化学实验课程内容及要求撰写实验报告，包括实验目的