液相色谱分离蛋白基本原理.doc

HPLC分离模式正相液相色谱（Normal Phase Liquid Chromatography）：利用不同组分分子极性不同，与极性固定相作用的差异，达到分离鉴定的目的。反相液相色谱（Reverse Phase Liquid Chromatography ）：利用不同组分分子极性不同，与非极性固定相作用的差异，达到分离鉴定的目的。n 凝胶过滤色谱（Gel Filtration Chromatogrephy）：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。n 离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography）：利用不同组分对离子交换剂结合能力的不同，使之分离。n 亲和色谱（Affinity Chromatography )利用亲和配体与生物分子之间亲和力的大小，将生物分子进行分离。按色谱的使用目的分类n 分析色谱：目的是获得混合物中各组分的信息，要求色谱灵敏度高、分辨率高、快速、方便和灵活。n 制备色谱：主要是在单位时间内获得一定量的、符合纯度要求的物质，要求进样量大。可通过加样体积过量，而浓度不变或样品浓度过量，而体积不变两种方式来实现。各类色谱的基本原理（一）正相（Normal Phase）色谱n 正相色谱是指固定相为极性物质，流动相为非极性(或弱极性)物质的一种操作模式。 n 这是一种根据分子的极性大小将其分离开来的液相色谱技术，因其以吸附效应作为分离的基础，也有人称其为吸附色谱。 n 在正相HPLC中的洗脱顺序:在正相HPLC中，非极性分子先被洗脱，极性分子则后被洗脱（二）反相（Reverse Phase）色谱n 反相色谱是以非极性表面的载体为固定相，以比固定相极性更强的溶剂系统为流动相的一种液相色谱分离形式。n 反相色谱固定相也以硅胶为基质，但通常在其表面键合上疏水基团，样品中的不同组分和这类疏水基团之间有不同的疏水作用。n 极性较强或亲水的样品分子和反相柱中的载体的相互作用较弱，因此较快流出，反之，极其疏水的分子就会和基质有较强的相互作用，在柱内保留的时间较长。n 在反相柱上，混合物中的各个组分是根据其疏水性的差异得以分离。多肽混合物可行线性梯度洗脱而被分开（双泵系统）。n 反相HPLC也可以运行等度（isocratic）模式进行洗脱。此时，洗脱溶剂是始终不变的（单泵系统） 。在反相HPLC中的洗脱顺序:在反相HPLC中极性分子先被洗脱，而非极性分子后被洗脱（三）凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱，又称排阻色谱或分子筛色谱。当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，存在两种运动，即垂直向下的移动和无定向的扩散运动。比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。（四）离子交换色谱 是用离子交换剂作为固定相的色谱分离模式，是根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的 离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团. 含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出H+，本身带负电；含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出OH-，本身带正电。根据不同组分在给定的pH条件下，离子荷电情况（荷电性质及数量）的不同将其分离的一种色谱技术。若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。 当物质在树脂上结合的牢固程度即结合力大小有差异时，选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。（五）亲和色谱生物体中许多大分子化合物具有和与其结构相应的分子相结合的特性，这种结合称为亲和结合或称为亲和力。这种结合既是特异性的，又是可逆性的。 亲和层析就是利用生物大分子间这种既特异性的又可逆性的亲和吸附和解离特性而设计的纯化生物大分子的层析方法 常见的有专一亲和力的生物分子对有抗原和抗体；酶和底物或辅酶或抑制剂； 激素和受体；RNA和其互补的DNA等。亲和色谱的特点n 亲和色谱可在温和地条件下进行，过程简单，纯化的倍数可达几千倍级，活性物质的回收率非常高，对含量极少又不稳定的生物活性物质极为有效。n 亲和色谱必须要有特异的亲和配体，事实上，不是任何生物大分子间都具有特异的亲和力，有合适当亲和配体；而且，亲和层析针对某一被分离物就要制备一种专门的吸附剂和寻找一种层析条件。因此，其应用受到一定的限制。