波谱分析手段在蛋白质研究中的应用.doc

波谱分析手段在蛋白质研究中的应用摘要：蛋白质是人体的基本构成物质，是生物体中一类重要的生物大分子，随着研究的不断深入，生物学与化学、近代波谱技术密切结合产生了NMR、X-Ray、SPR、荧光分析以及热力学分析等多种分析手段。本文综述了波谱分析手段在蛋白质结构与功能、蛋白质相互作用以及蛋白质与配体相互作用研究中的应用及进展。关键词：波谱分析，核磁共振，SPR，X射线，蛋白质研究引言：人类的遗传物质是DNA，但是最终要通过转录，翻译生成蛋白质才能体现出来，而每种蛋白质的结构不同，进而造成具体的生物体表现不同。蛋白质具有自身特有的活动规律, 随着生命活动的进程表现出极其动态的紧密协调的变化,蛋白质在合成之后具有相对独立的修饰、转运和相互间作用能力,同时外界环境对蛋白质的表达起到很大的影响。因此,开展对蛋白质的研究,如蛋白质结构与功能、蛋白质相互作用以及蛋白质与配体相互作用等，才能更加贴近对生命现象和本质的掌握,生命活动的本质和活动规律才能找到答案。正是因为这样,国际科学界预言,在21 世纪,生命科学的热点将从基因组学转向蛋白质组学,使后者成为新的前沿。目前，已经发展起来基于NMR、X-Ray、SPR、荧光分析以及热力学分析等多种分析手段，在蛋白质研究中发挥着巨大的作用。1 核磁共振法研究蛋白质和多肽的结构和功能核磁共振（Nuclear Magnetic Resanance, NMR）是一种多功能的物理测试技术。1945年哈佛大学的Purcell和斯坦福大学的Bloch分别用实验观察到NMR现象。因此他们于1953年荣获诺贝尔物理学奖,Varian公司也生产出了第一台NMR仪,并开始用这种仪器分析鉴定小分子化合物。随着超导磁体的开发,磁场强度不断提高,分辨率和灵敏度大为改善，以及计算机技术和谱仪的飞速发展,使得快速傅里叶变换(FT)和多维NMR法相继得以实现。这些为NMR在生物、化学和医学中的广泛应用提供了条件。Wagner 等认为,NMR法测定蛋白质结构的最早里程碑是美国斯坦福大学的Jardezky等的工作,他们用NMR法测定了几十种常见氨基酸的NMR图谱。他们还和他人协作,把人工智能引进NMR测定蛋白质结构的研究中。1985年瑞士的Wuthrich等第一次用NMR法测定了一个蛋白质的溶液结构和蛋白酶抑制剂A的结构。直到1994年,一年内测定的蛋白质的溶液结构总数已超过100个。 1.1 NMR的特点NMR法的特点是:(1)可测定溶液中接近于生理状态的蛋白质构象；(2)可测定小分子和蛋白质作用的动力学过程；(3)可测定蛋白质可变形的尾巴部分的构象,它往往和蛋白质的活性功能紧密相关；(4)NMR法是一种非损伤性测定法,对样品无破坏作用。1.2 NMR法测定蛋白质结构的实验步骤实验步骤包括:(1)样品制备：将蛋白质溶于D2O或H2O中,相对分子质量大于6000的需事先用15N或15N、13C加以标记。(2) 一维NMR实验：测定1H NMR谱图,用D2O交换以及作pH、温度的影响实验等,以获取化学位移、耦合常数及有关形成氢键等信息。(3) 二维NMR：测定1H - 1HCOSY,DQF(Double Quantum Filter) -COSY, Relay - COSY, TOCSY, NOESY等,以确定耦合体系,辨别氨基酸类型,进行序列识别,并根据NOE 信息确定各种二级结构单元等。(4)三维NMR实验：测定CBCA(CO)NH, CBCANH, HNCO, HNHA, HCCH - COSY, NOESYTOCSY等的三维图谱，进一步确认各自旋体系，测定各种3J，作更多的序列识别和二级结构单元确定。(5)四维NMR实验：测定13 C/15N 编辑的NOESY或13 C/13 C 编辑的NOESY谱，对重叠严重的一些谱峰的NOE相关性进行分析。1.3 NMR测定法的结构计算关于NMR测定法的结构计算可以概括为如下图所示的程序：输入NOE ,折叠,氢键和二面角等数据动力学模拟淬火分子动力学优化初始结构叠代计算能量最小化最佳构象组1.4 核磁共振技术应用进展近年来，核磁共振技术不论在谱仪性能还是在实验方法上都有了巨大的进步，一方面随着600兆周超高场核磁共振谱仪的应用，NMR技术的灵敏度和分辨力有了很大的提高，另一方面随着选择和多重选择的激励技术，接力和反向等见解检测技术和梯度场技术等的出现，采用多脉冲，进行多重磁化转移，检测多种量子相干的二维，三维乃至多维NMR实验方法如雨后春笋般地出现。特别是近年来随着生物工程技术的发展15N和13C同位素标记的蛋白质制备成为可能，利用15N和13C等核种的杂核三维和四维等新颖的NMR技术得以克服信号重迭，简并和运动相关时间长引起的信号变宽等障碍，把可归属的蛋白质分子量范围一举扩展到30KDa左右，这些技术与分子力学计算、分子力学模拟和三维图形显示技术相结合，为研究蛋白质溶液三维结构、动态特性和分子间相互作用创造了良好的前景。1.4.1 液晶与高分辨率溶液NMR结构欧佛豪斯效应( nuclear Overhauser enhancement, NOE)是核间距的定性指标, 从NOE得到的距离约束的定性本质限制了所得到的生物大分子时间平均构象的精度。原子核间的偶极偶合作用包含许多结构信息, 然而在各向同性的溶液中, 由于蛋白质分子在各个方向上的翻滚, 这种作用平均为零而无法观测。如果能够从偶极偶合作用中直接测定成键原子对相对于分子其他部分的取向, 就将极大地提高结构测定的精度。当射频脉冲作用于一个磁性核时, 附近另一个磁性核的存在将会由于偶极偶合作用而在两个共振频率之间产生裂分信号, 信号的强度对该化学键相对于外磁场的取向十分敏感。当蛋白质分子置于强磁场时会因非零的磁感应各向异性而产生微小角度的部分取向。这时可以观测相隔一个化学键的15 N21 H和13 C21 H 的偶极偶合。由于这些偶极偶合的核间距(即键长)是固定的, 因此这些数据就提供了相应的化学键相对于蛋白质磁感应张量的取向的直接信息。然而对于单个的蛋白质分子来说这种磁相互作用的能量非常微弱而难以准确测量。液晶可以使溶剂分子产生定向, 但是这种作用对蛋白质分子又太强, 所有的分子都被牢牢束缚并完全定向。这时偶极偶合作用就不仅仅出现在相邻原子间而是在整个分子内部, 所以将产生大量信号。由于二己酰卵磷脂(DHPC)和二豆蔻酰卵磷脂(DMPC) 混合物溶液中的微粒具有抗磁性, 它们沿磁场方向取向。它们之间的空间比通常的蛋白质分子的尺寸大得多, 所以蛋白质分子可以在溶液中自由地扩散, 只是偶尔与这些微粒碰撞。由于蛋白质分子通常呈椭球状, 这种持续的碰撞会使蛋白质分子在液晶排列的方向上发生部分的取向。蛋白质取向的程度与蛋白质分子的形状有关。通过改变液晶的浓度可以方便地调节蛋白质分子取向的程度, 这种作用比现在最强的磁场所产生的取向作用强两个数量级。液晶分子与蛋白质之间没有明显的相互作用,不需要重新再作谱峰的识别。测定这种偶极偶合作用所需的同位素标记的蛋白质样品比测定弱NOE 峰要少, 一般只需011015 mmolPL。选择适当的液晶浓度可以只使邻近的核给出可观测的偶极偶合作用。这时蛋白质分子所产生的取向程度已经足以精确地测定多种化学键( 13 C 13C , 13 C 1 H , 15N 1 H , 13 C 15N )连接的两个核之间的偶极相互作用, 同时又不会使谱图变得极为复杂, 这些准确的结构信息可以大大提高NMR 测定的蛋白质结构的质量。此外这种方法还有可能提高NMR 测定蛋白质结构的分子质量上限, 用高度氘代蛋白质在稀释的液晶溶液中可以快速直接地获得偶极偶合信息, 作为与长程NOE相互补充的结构参数, 从而使高分子质量蛋白质溶液结构达到较好的分辨率。虽然目前这种方法还没有用于测定完整的蛋白质结构, 但是在原理上已无太大的问题。一旦用这种方法测定的蛋白质NMR结构的精度能一般地达到高分辨率晶体结构的水平, NMR技术将进入一个新的阶段。1.4.2 反标记与蛋白质的溶液三维结构NMR进行结构测定主要依赖于建立起质子间的距离约束, 这些约束将空间上靠近(约0.15nm范围之内)却通常在一级序列上远离的质子联系起来。由于高度氘代使这些质子的数目大大减少, 从而使高分子质量的蛋白质的结构测定面临极大的困难。虽然位于可交换位置的质子(如主链和侧链的NH)能够在样品制备之后被重新引入, 在高度氘代样品中仍然可以建立起NHNH 间的距离约束,且仅仅依靠NHNH 间的距离约束也可以得到一定分辨率的蛋白质结构, 但是实验表明, 测定精确的蛋白质结构还需要额外的距离信息作为NHNH间距离约束的补充。为此目的, 许多研究小组致力于研究某些关键基团质子化而其他位置均高度氘代的15N , 13 C 标记的样品, 这种方法现在被称为“反标记(reverse labeling procedures)”。2 NMR法研究蛋白质与配体的相互作用蛋白质的功能是通过与一定的效应物作用实现的。用NMR法研究蛋白与配基，酶与底物，抗体和抗原，受体和配基以及蛋白质与蛋白质或多肽、核酸及生物膜的识别和作用。配基结合于蛋白质时，由于他们间的相互作用，使两者NMR参数（化学位移、谱线宽度、弛豫时间等）产生微扰。当核苷酸结合于叶绿体ATP合成酶时，酶蛋白的两个共振峰2.70ppm和2.29ppm的横向弛豫时间T2缩短，表明这两个质子的运动性减少。利用自旋回波差谱可推断出酶与核苷酸的结合位点，陪体结合于蛋白质，通常引起蛋白质微环境构像的变化，配体质子与蛋白质有NOE效应，可从ID NOE差谱或2D NOESY谱观察到。2 基于SRP技术的生物大分子互作研究2.1 SRP的原理表面等离子体子共振是一种物理光学现象。它利用光在玻璃与金属薄膜界面处发生全内反射时渗透到金属薄膜内的消失波,引发金属中的自由电子产生表面等离子体子,在入射角或波长为某一适当值的条件下,表面等离子体子与消失波的频率和波数相等,二者将发生共振,入射光被吸收,使反射光能量急剧下降,在反射光谱上出现反射强度最低值,此即为共振峰。紧靠在金属薄膜表面的介质折射率不同时共振峰位置(共振角或共振波长)将不同。据此,可对待测物进行测定。共振的产生与入射光的波长和入射角、金属薄膜的介电常数及介质的折射率有关。当介质不同时,共振角或共振波长将改变。因此, SPR谱的改变将反映与金属膜表面接触的体系(介质)的变化。2.2 SRP技术的应用表面等离子共振技术可以在天然状态下反映蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸、新药分子-疾病靶蛋白等生物分子互作, 如特异结合、解离、分子识别等动力学过程, 为实时、动态获取生物分子互作信息, 从而阐明生命现象的分子机理提供了有效的研究工具, 有助于更加全面和深刻地理解生物分子的结构和功能。生物分子互作技术(bimolecular interactionanalysis, BIA)则是基于SPR原理的新型生物传感分析技术, 它在不需使用荧光或同位素标记甚至无须纯化各种生物组分的天然条件下, 通过传感器芯片实时监测各类生物分子如多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖、类脂甚至全病毒、细胞之间相互作用的整个过程, 并通过分析软件获取生物分子结合/解离、亲和性/特异性、协同/拮抗、反应速率/浓度变化等互作动力学参数。SPR的实验方法一般为首先在传感片表面固定一层反应物,使其形成分子敏感膜,然后,使传感器与待测物的样品溶液接触,传感片上敏感膜与待测物分子间相互作用的情况就可由SPR 信号的改变反映出来,并通过计算机将整个反应过程显示和记录下来。用SPR技术可获得与金属薄膜表面紧靠着的介质层的光学常数,因为共振角或共振波长会随这一表面层折射率的变化而变化,这一变化又与金属表面所结合的生物分子的质量成正比。在BIA测定中,一般相互作用的一对分子中的一种被固定在传感片的表面,另一种分子则以溶液形式流过表面,如果二者有相互作用而结合,将导致传感片表面折射率的变化,从而引起共振角或波长的变化,故可通过检测这一变化监测分子间的相互作用。通过膜厚度和吸收系数计算待测物质的质量,进而求得相互作用的生物大分子之间的键合常数。一般而言,SPR 传感器主要用于测定物质的质量和动力学常数。基于SPR原理的实时BIA技术在抗体/抗原结合动力学及抗原表位/抗体对位的鉴定中有重要的应用, 在无需纯化和标记抗体2抗原的天然条件下, 能实时动态反映抗体2抗原互作时的结合/解离速率和亲和力常数。Karlsson等以SPR技术研究HIV 21核心蛋白P24与其单克隆抗体mAB的结合动力学: 从杂交瘤培养上清液中获得抗核心蛋白P24mAB, 偶联在芯片表面, 通过芯片表面直接监测抗体2抗原结合过程, 通过结合曲线能够快速半定量不同抗体的动力学参数, 得到P24抗体的亲和力常数范围为2.710-7 610-9mol/L。进一步的研究以30个抗重组HIV 21核心蛋白P24单抗鉴定P24的特异性抗原表位, 结果得到17个抗原表位, 应用匹配测试将30个单抗分成17个免疫反应模式。利用SPR技术测定生物分子间相互作用的优点包括:待测物无需标记甚至无需纯化;反应过程可以实时监控，多步反应的每一步都可以被分别记录下来,因此可以进行复杂物质的分析。蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,生物学中的许多现象如复制、转录、翻译、分泌、细胞周期调控和信号传导等均受蛋白质间相互作用的调控。在蛋白质的研究中,对于蛋白激酶C活性的研究是一项非常重要的工作,它直接关系到细胞的分泌、生长和分化过程。通过分析它和类脂化合物的相互作用,可以得到其活性的重要信息。Soulages等对此体系进行了详细的研究,通过分析大量的SPR光谱数据,得到类脂层和蛋白质通过两步键合,形成了类脂和蛋白质的大分子化合物的反应机理。3 X射线衍射技术研究蛋白质动态蛋白质是一个动态系统，配体诱导的蛋白质构象变化的研究就比较困难,分子动力学模拟技术只能研究在10-15s发生的反应, 而配体诱导的蛋白质构象变化在10-6100s内发生, 况且, 这些构象变化的幅度如此之大, 已跨越了相对比较大的能量壁垒。用波谱方法不能对这些变化作比较细致的研究, 所得信息微乎其微。X射线衍射结晶学被认为是研究这些构象变化的最理想的选择, 因为X射线衍射法能达到的分辨率可达单个原子的水平,另外,它可以很清楚地描述配体存在与否对蛋白质的影响。事实上, 对于一些特定的蛋白质, 如变构蛋白酶, X射线衍射法被认为是非常有效的方法。射线衍射是确定所有分子的三维空间结构的最可靠的方法，但是只有当得到合适的晶体时才可以用这样的方法。4 波谱分析应用展望波谱分析手段应用于生物学，特别是蛋白质的研究极大