微生物育种.doc

工业微生物育种第一章 绪论1.工业微生物菌种具备特征：1）菌种要纯 2）目的产物的产量较高且稳定 3）生长快，易繁殖 4）抗杂菌和噬菌体的能力强 5）微生物的发酵培养基来源广，价格低 6）生产目的产物的时间短 7）目的产物易分离纯化。2.工业微生物育种的基础及作用：遗传与变异 改良微生物并培育出各种有娘的工业微生物菌种。3.工业微生物育种在发酵工业中的作用：不仅可以为发酵工业提供合适的菌种，还可不断提高发酵产品的产量和质量，甚至可培育出全新的菌种以生产新的发酵产品。4.工业微生物育种的方法：1）自然选育（选择育种，通过改变群体的遗传结构，去掉不良细胞，使优良基因不断增加） 2）右边育种（通过人工诱变剂）3）代谢控制育种（先诱变破坏微生物正常代谢） 4）杂交育种（通过基因重组） 5）基因工程育种 第二章 微生物育种的遗传基础1.原核微生物产生变异的方式：转化，转导，结合，原生质体融合。2.真核微生物产生变异的方式：有性杂交，准性生殖，原生质体融合。3.核基因：细胞核内的DNA即染色体上的DNA，是微生物生长繁殖的必需基因，直接控制初级代谢产物的合成，间接控制次级代谢产物的合成。4.核外基因：是细胞质中的DNA，是微生物的非必需基因，与次级代谢产物的合成有关。5.表型延迟：有些基因发生突变后，要经两代以上的繁殖复制，表型才能相应的改变。6.基因突变的类型：1）碱基的变化（碱基置换，移码突变） 2）染色体畸变（缺失，重复，倒位，易位等结构变化） 3）染色体数目变异（包括染色体单条的变化和整倍的改变） 4）遗传信息的变化（同义突变，中性突变，错义突变，无义突变）7.基因突变的修复机制：光复活修复，切除修复，重组修复，SOS修复。8.基因突变与表型的关系：基因突变指生物体的遗传物质发生改变，从而引起表型的变异。同义突变与中性突变表型不变，错义突变与无义突变表型改变。9.原核生物基因重组的特点：通常只有部分遗传物质的转移和重组，形成部分二倍体再进行重组。10.真核微生物有性生殖和准性生殖的区别：有性生殖是性细胞的结合而准性生殖是体细胞的结合；有性生殖要经过减数分裂而准性生殖不经过减数分裂，而是进行有丝分裂单倍化。 第三章 工业微生物育种的分离筛选1工业微生物菌种来源：从自然界或发酵产品中分离筛选；向菌种保藏机构或生产单位购置。2.根据以下特点采集土壤中的微生物：土壤营养和通气状况；土壤酸碱度和植被情况；土壤地理条件；季节条件。3.富集培养：也称增值培养，是指目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣种变成人工环境中的优势种，以利于分离到所需的菌株。4.好氧微生物纯种分离的方法及特点：稀释涂布和倾注平板法：较易得到单菌落；划线分离法：简单快速；平板生化反应法：既可得到单菌落又可初步观察单个菌落的生产性能；单细胞或单孢子显微分离法：纯种分离的纯度高，能够得到单细胞或单孢子。5.菌落纯：同一种微生物，但不一定来自一个细胞。6.细胞纯：来自一个菌株或细胞。7.平皿生化反应法：1）透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小可以反映该菌株利用底物的能力。该法常用于水解酶产生菌，如脂肪酶，淀粉酶，核酸酶等。 2）显色圈法：又称变色圈法，主要是对一些不易产生透明圈的微生物，在底物平板中加入特定的指示剂或显色剂，使目的微生物被快速鉴别出来。 3）生长圈法：生长圈法通常用于分离筛选氨基酸，核酸和维生素的产生菌。生长圈法需要使用工程菌。工程菌是用来显示待检菌的菌株，是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工程菌并缺少所需营养物的平板上进行培养。若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落的周围便会形成一个混浊的生长圈。 4）抑菌圈法：抑菌圈法常用于抗生素产生菌的分离筛选，多用于初筛过程，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，便会在该菌落的周围形成工具菌不能生长的抑制菌，很容易被鉴别出来。8.出发菌株：用于育种的原始菌株。9.出发菌株生产性能测定的三步：平板筛选：用平板活性圈初步测定生产性能，分离生产性能高的；摇瓶初筛（一株一瓶）：将平板筛选的菌株进行摇瓶发酵培养，再利用平板活性圈测定生产性能；摇瓶复筛（一株三到五瓶）：发酵培养后，先用平板活性圈测定生产性能，选出产量高的，再用分光光度计或氢氧化钠滴定，精确测定生产性能。10.平板初筛的法：根据菌体形态变异筛选，平皿生化反应法，浓度梯度法，染色技术快速筛选法，琼脂块大通量筛选法。 判断生产性能的方法：在固体平板培养基对菌株进行生产性能的测定，留下生产性能高的菌株，适合大量菌株的筛选。11.平板筛选与摇瓶筛选的比较：平板筛选：简单快速，筛选量大，准确性差；摇瓶筛选：培养条件更接近发酵罐培养，筛选准确复杂。12.野生菌株：从自然界分离得到的能在基本培养基上正常生长的微生物，是发生突变的原始菌株。 第四章 工业微生物诱变育种1.诱变育种的优点：1）提高基因的突变频率，加快育种速度 2）提高目的产物（菌种）的生产性能 3）提高产量和质量 4）简化发酵工艺，降低成本 5）有可能开发新产品 6）用于代谢控制育种和杂交育种。2.紫外线诱变育种的机制：使DNA形成嘧啶二聚体，引起碱基错配，从而产生基因突变。 优点：设备简单操作方便，诱变频率高，杀菌率高，诱变效果好。 有效光波：200300nm其中260nm效果最好，灯管功率15W 有利正突变的杀菌率：70%80%或更低。3.5-溴尿嘧啶（5-BU)：取代正常的碱基引起碱基错配，从而引起基因突变；甲级磺酸乙酯（乙基硫酸甲烷，EMS）：改变碱基结构，引起碱基错配，从而引起突变；亚硝酸：使碱基氧化脱氨基，引起碱基错配；吖啶黄：插入碱基之间引起碱基增加或减少，引起移码突变。4.增变菌株：对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高，具有极高的自发突变率的一类菌株。5.产孢子霉菌用孢子做诱变材料，因为孢子为单核细胞，容易获得遗传一致的突变株，不发生分离；不产孢子的霉菌用菌丝尖端（或原生质体）做诱变材料，因为菌丝尖端分裂生长快，细胞核较少，大多为单核细胞，诱变效果好不易发生分离。6.低产菌株适用较强诱变剂和较高的剂量处理，因为低产菌株遗传性状较稳定，正突变空间大，用较强诱变剂和较高的计量处理，基因重排后易产生较大的突变，出现具有新特性或产量有突破性提高的变异菌株；高产菌株适用温和的诱变剂和低剂量处理，因为高产菌株遗传性状不稳定，正突变空间小，不易产生较大幅度的突变，用温和的诱变剂和低剂量处理，有利于产生正突变。7.MM:基本培养基，适合野生型原养型菌株生长，杂交育种常用的培养基。 CM：完全培养基，适合各种营养缺陷型菌株生长。 SM：补充培养基，筛选异养性和营养缺陷型。 LM：有限培养基，适合异核体菌株。 FM：发酵培养基，用于测定杂交菌株发酵产物的产量。8.（1）营养缺陷型：野生菌株经过人工诱变或自然突变，缺乏合成某种营养物质如氨基酸，维生素，核酸等的能力，必须在基本培养基中补充所缺乏的营养成分才能正常生长，称为营养缺陷型菌株。 （2）筛选分4步，分别为诱发营养缺陷型菌株，淘汰野生型菌株，检出缺陷型，鉴别缺陷型种类。 诱发营养缺陷型的目的：使野生型菌株诱发成营养缺陷型菌株。 淘汰野生型菌株的目的：尽量淘汰野生型细胞，以达到浓缩型菌株的目的。9.温变突变株（TS)：在许可温度下，生长正常与野生型的表型一样，在非许可温度下，生长减弱或生长停止或死亡。10.谷氨酸培养原理：（生物素突变型）NO2256-（诱发筛选）-TS88（细胞膜合成缺损的温敏突变株）-（30度，许可温度）-TS88大量繁殖达一定量-（37度，非许可温度）-TS88细胞膜透性增大（细胞膜结构缺损）-（解除反馈调节）-谷氨酸大量积累（含高浓度生物素的天然培养基中）11.TS88为细胞膜结构或功能缺损的温敏突变株，在许可温度30度下培养时，菌体大量繁殖，当达到一定菌体量时，升至非许可温度37度下培养，使菌体细胞膜合成，结构，功能发生障碍，细胞膜透性增大，使其能在含高浓度的生物素的培养基中分泌大量谷氨酸至胞外，解除反馈抑制，从而提高产量。12.1克土样含菌数的计算：1克土样含菌数=稀释倍数*平均每皿的菌落数/取样量13.烈性噬菌体和温和噬菌体的区别：在短时间内能连续完成生活史的五个阶段而实现其繁殖和裂解寄主的噬菌体，称为裂解噬菌体。繁殖方式为裂解。 如果侵入宿主后，噬菌体的DNA只整合在宿主的核染色体组上，并长期随宿主DNA的复制而复制，在一般情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解，则称之为温和噬菌体。繁殖方式为溶解和裂解。 第五章 代谢控制育种1.代谢控制育种：通过诱变降低或切断（消除）代谢途径中某些支路或目标产物以后的代谢产物，人工控制其代谢工程，以此解除微生物正常的代谢反馈机制，使人类需要的目标产物大量积累。2.常见的初级代谢产物：核苷酸，氨基酸，维生素，蛋白质，核酸，多糖等，是微生物生长和繁殖所必需的一类物质。3.常见的次级代谢产物：抗生素，毒素，激素，色素，生物碱等，不影响机体的生存，对微生物无明显功能，但对微生物的生长有利，有利于竞争。4.组成酶：酶的合成不需要底物的诱导，直接由基因控制合成，是细胞固有酶类。 诱导酶：只有底物或底物诱导类似物存在的时候才能合成的酶类。 诱导：凡能促进酶生物合成的调节称为诱导。 阻遏：凡能阻碍酶生物合成的调节称为阻碍。 葡萄糖效应：葡萄糖存在时，阻遏了分解乳糖酶系的合成的现象。 反馈抑制：某末端产物过量时，这个产物可反过来直接抑制该途径中关键酶的活性，促使整个反应减慢或停止，从而避免过多积累。 反馈阻遏：末端代谢产物过量时，该产物可反过来作用于代谢途径中的各种酶，阻碍这些酶的合成。5.乳糖酶的操纵子的诱导机制：不含乳糖时，阻遏蛋白与操纵基因结合，结构基因关闭，三种酶不能合成；只含乳糖时，阻遏蛋白与乳糖结合而失活，cAMP与CAP结合，形成cAMP-CAP复合物，使RNA聚合酶附着在启动基因上，使及结构基因转录翻译合成三种酶；葡萄糖与乳糖同时存在时，阻遏蛋白与乳糖结合而失活，cAMP含量很低，不能与CAP形成相应的复合物，RNA聚合酶不能附着在启动基因上，不能转录，三种酶不能合成。6.色氨酸操纵子的阻遏机制：色氨酸缺乏时，阻遏蛋白失活，RNA聚合酶与启动子结合，转录翻译合成合成色氨酸所需的5种酶；色氨酸过量时，阻遏蛋白与色氨酸结合形成有活性的聚合物，与操纵子基因结合，阻遏基因转录，从而5种酶不能合成。 7.反馈抑制类型：1）直线式代谢途径的反馈抑制 2）分支代谢途径的反馈抑制：顺序反馈抑制，同工酶反馈抑制，协同反馈抑制，合作反馈抑制，积累反馈抑制。8.碳源分解调节：快速利用的碳源如葡萄糖，有利于细菌的生长，不利于次级代谢产物如抗生素的合成，而难利用的碳源有利于次级代谢产物的合成。 磷酸盐分解调节：磷酸盐是细菌生长必需物质，高浓度的磷酸盐只促进菌体的生长，不利于抗生素的合成。 组成型突变株：不经底物诱导合成诱导酶或不受末端产物阻遏合成合成酶的酶合成机制失灵的代谢突变株。 抗分解调节突变株：指不受C.N.P的分解阻遏或抑制的突变株。 抗反馈调节突变株：解除了由末端产物过量引起的反馈调节，使发酵产物大量积累的突变株。 细胞膜透性突变株：细胞膜透性增大的突变株。9.改变细胞膜透性的突变株：营养缺陷型（生物素，油酸，甘油等），温敏突变型，溶菌敏感突变型。10.渗透缺陷：合成某种营养物质的能力没有完全丧失的特殊营养缺陷型，并能在基本培养基上缓慢生长的突变株。 在发酵中的优越性：既可以抗反馈抑制，又不必像营养缺陷型那样添加缺陷的营养物质（能合成少量的）11.营养缺陷型：基因突变使得菌株失去了合成某一种或几种生长因子的能力，因而无法在基本培养基上正常生长和繁殖。 第六章1.杂交育种的意义：通过两个具有不同优良性状的亲本菌株杂交达到基因重组，使两个亲本的优良性状集中到一个重组菌株内；通过杂交育种得到的重组菌株可以克服长期诱变造成的生活力下降，代谢缓慢等优点，还可以提高菌株对诱变剂的敏感性；杂交育种有助于总结遗传物质的转移和传递规律，丰富和促进遗传学理论的发展.2.微生物杂交育种的一般程序：1）选择亲本菌株2）培养基的选择与制备3）亲本菌株杂交4）重组菌株的筛选5）重组菌株生产性能鉴定3.原养型：营养缺陷型经回复突变或杂交的重组体，其营养要求与野生型相同或可在基本培养基上生生长。4.异养型：营养缺陷型杂交产生的缺陷型重组体，研究基因的遗传规律。5.异核体：当两个基因型不同菌株的菌丝体在培养过程中紧密接触后，接触部分细胞壁溶解，联合，融合，细胞质交流，在共同的细胞质中存在两个细胞核，这种细胞称为异核体。6.杂合二倍体：是由两个不同遗传型的单倍细胞核融合产生的。7.做遗传标记的原因：为了在特殊培养基上进行筛选，做遗传标记方便筛选。8.常用的遗传标记有：营养突变型和抗性基因。其中抗性基因包括抗药性基因和抗噬菌体基因。9.原生质体的育种方法：原生质体再生育种、原生质体诱变育种、原生质体转化育种、原生质体融合育种。10.酶法制备原生质体的影响因素：培养基组成、菌体培养方式、菌体菌龄、稳定剂、酶解前的预处理、酶系和酶浓度、酶的作用温度和作用PH、酶解时间、菌体浓度、酶解方式。 第七章1.菌种退化：主要指生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌种，在生长繁殖中，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象，集中表现在菌种目的代谢产物合成能力降低，产量下降，有的是发酵力和糖化力降低。 2.菌种退化原因：基因变异、分离现象、不适宜的环境条件、传代次数的增加。3.防止菌种退化的措施：1）采用合理的育种方式，减少分离现象。 2）选择合适菌株生长的培养条件和外界环境。 3）采用有效的菌种保藏方法，控制传代次数。 4）防止病毒感染。 5）定期进行纯种分离。4.常见的菌种保藏方法：1）斜面低温保藏法 2）普通冷冻保藏法 3）超低温冷冻保藏法 4）液氮超低温保藏法 5）沙土管保藏法 6）冷冻真空干燥保藏法 7）液体石蜡保藏法。5.菌种保藏方法特点：斜面低温保藏法：简单，菌种存活率高，但菌种仍有一定强度的代谢活动，传代多则菌种易变异，故不宜长时间用来保藏菌种。 普通冷冻保藏法：可维持若干微生物的活力1年2年，但保藏菌种的效果较差。 超低温冷冻保藏法：保藏效果较好，细菌和真菌可以通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。 液氮超低温保藏法：此法较理想，但需使用专用器具，且液氮消耗较多，操作费用较高，一般仅适合一些专业保藏机构采用。 沙土管保藏法：制作简单，保藏时间可达数年至数十年，移接又方便，所以应用范围很广。 冷冻真空干燥保藏法：手段比较温和，细胞受损伤的程度先后对较小，存活率及保藏效果均不错，而且经抽真空封闭的菌种安瓿管的保藏、邮寄、使用均很方便。 液体石蜡保藏法：简单，不需特殊装置，但对很多厌氧细菌或能分解烃类的细菌保藏效果较差。 实训内容1.根据实训操作简述培养基灭菌的操作步骤和注意事项：配制培养基，用三角瓶封口、检查高压蒸汽灭菌锅锅底的水是否充足，若不足则需向锅底加水、将配制好的培养基放入灭菌锅的灭菌桶内、盖上锅盖，扭紧旋钮、插上电源打开开关、待温度上升至108度时，打开排气阀排气，当锅内气压将为