组织裂解液和细胞裂解液的配制.doc

组织裂解液和细胞裂解液如何配制?一、细胞裂解液配制方法一一、试剂准备1、新鲜配制冷的 RIPA 裂解缓冲液:150 mM NaCL1% NP-40 (去垢剂)0.1% SDS (去垢剂)2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂)1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。2、冷的PBS 中加入 1 mM PMSF1.5 mM EDTA1mM NaVanadate （钒酸钠）(任选)3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。二、实验步骤1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上， 用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的 PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。2、 向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液 (每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮 (由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。3、 吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中 （置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。5、 取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在 -70。4方法二NP-40 or Triton-100 1%TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/LNaCl 150mmol/LPMSF（苯甲基磺酰氟） 0.1mmol/L(100g/ml)Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 mol/L(0.7g/ml)Leupeptin（亮抑制肽） 0.5mg/mlAprotinin（抑蛋白酶肽） 0.3mol/L(1g/ml)（注：PMSF 贮存液：100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中；Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0);Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中；Pepstatin 贮存液 10mg/ml于甲醇液中.均于-20保存）裂解操作程序：* 离心收集1107 个细胞* 加入4预冷1%NP-40裂解液100l* 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织进行匀浆）* 4放置1530min* 4离心，15 000rpm,10min，取上清备用。方法三 细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性推荐RIPA buffer:. 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系 150 mM NaCl 等渗体系 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂 5 g/ml Aprotinin （抑肽酶）蛋白酶抑制剂 5 g/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂 1% Triton x-100 破坏细胞1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂 细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性推荐RIPA buffer:. 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系 150 mM NaCl 等渗体系 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂 5 g/ml Aprotinin 蛋白酶抑制剂 5 g/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂 1% Triton x-100 破坏细胞1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂0.1% SDS 强变性剂和蛋白溶解剂其中PMSF等蛋白酶抑制剂最好另外配制，20保存，用前混合。蛋白酶抑制剂较贵，如果你的经费有限，可以仅用PMSF试一试，能出结果就可以。 用于普通的 Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液(P0013)，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40 裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(强、中)或 SDS裂解液。RIPA裂解体系： 150 mmoL/L Nacl， 1.0% NP-40或Triton-x-100 ，0.5%脱氧胆酸钠， 0.1% SDS， 50 mmoL/L Tris ( ph8.0)。一、组织裂解液配制组织裂解液配方： 7M Urea(60. 06) 4.2042 g2M thiourea(76.12) 1.5224 g100mM DTT 0.1543 g4% CHAPS 0.4 g0.5mM EDTA 0.00146 g40Mm Tris 0.0485 g2%(v/v) NP-40 0.2 ml1%(v/v) Triton X-100 0.1 ml5mM PMSF用前加 0.00871 g2%pharmalyte 0.2ml共10ml分装成400l/每管（可应用于30-80毫克组织裂解）注：已配好分装成400l/每管可供应用不需另配！细胞裂解液配方：6M Urea(60. 06) 1.8018 g2M thiourea(76.12) 0. 7613 g65mM DTT 0.050 g4% CHAPS 0.2 g40Mm Trisbase 0.02425 g共5ml分装成200l/每管（可应用于50-100ml培养瓶内的细胞裂解）细胞裂解液： 组织裂解液配方：7 mol/L 尿素、 7M Urea(60. 06) 4.2042 g2 mol/L硫脲、 2M thiourea(76.12) 1.5224 g2% NP-40、 2%(v/v) NP-40 0.2 ml1% Triton X-100、 1%(v/v) Triton X-100 0.1 ml65 mmol/L DTT、 0.1003g 100mM DTT 0.1543 g5 mmol/L PMSF、 5mM PMSF用前加 0.00871 g4% CHAPS、 4% CHAPS 0.4 g40 mmol/L Tris、 40Mm Tris 0.0485 g2% pharmalyte（pH3-10）、2%pharmalyte 0.2ml 0.5mM EDTA 0.00146 g25 mg/L DNase I、7 mg/L RNase A、20 mg/L aprotinin、20 mg/L leupeptin、2 mmol/L Na3VO4、Phosphatase Inhibitor Cocktail 1Phosphatase Inhibitor Cocktail 21ml水化液配方：8M Urea(60.06) 0.48048 g2% CHAPS 0.02 g痕量溴酚兰 0.4 l1%的痕量溴酚兰（10mg+1000l双蒸水）450l水化液 加DTT 0.00135mgor 400l水化液 加DTT 0.00126mg 各种细胞裂解液的功用都分别是什么，SDS ，NP-40 ，TritonX-100有何作用SDS ，NP-40 ，TritonX-100这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。SDS属于离子型去垢剂，最厉害，基本可以把细胞完全破掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。NP-4