细胞生物学实验指导.doc

细胞生物学实验指导 （供本科教学）佳木斯大学基础医学院生物学教研室2008年9月实验室管理规则实验室是实验课教学的重要场所，为了使实验课能够在文明、安全、有序的条件下进行，必须遵守如下实验室规则，希望师生们共同遵守。1. 精心爱护实验室内一切公共财物，实验室内严禁吸烟，不准随地吐痰和乱抛杂物，不得大声喧哗，保持安静和整洁。2学生应提前5分钟进入实验室，准备好当日实验所需的物品和用具。如需使用显微镜，必须先登记；用后要把每个镜头擦拭干净，放入柜中。3实验中打碎玻片标本、损坏仪器或仪器出现故障时，要及时举手报告教师，以便处理。4实验中要注意安全，对强酸、强碱、有毒染料及加热火源要小心使用。千万不要将染料的滴管和滴瓶相互插错。注意节约用水、电、药品和器材。实验室内电线和插头较多，谨防触电。5当实验分组进行时，座位固定不变，以便于管理。若需调换座位，要报告教师。实验中各组使用自己的标本、药品和器材，避免各组间相互混用。6实验室内的一切用具和物品，不得擅自带出实验室。因课外科技活动等需要使用时，要向教师办理借用手续。7实验室内的精密仪器和贵重设备要妥为爱护，学生不得任意使用，防止使用不当，损坏仪器和设备。8做完实验后，各人先将自己使用的用具擦净，妥为保管，并将实验台擦净。实验所产生的废物、污水、动物尸体等严禁随地抛弃，严格按环保部门的规定，妥善处置。9每次实验结束时，由值日生负责打扫室内卫生，关灯、关水、关窗和锁门。一般情况下，教师或实验员最后离开实验室。 佳木斯大学基础医学院生物教研室2008年9月实验一 光学显微镜的使用与及动物细胞的形态观察【实验目的】1、熟悉光学显微镜各部的结构和用途，掌握显微镜维护的基本知识。2、初步掌握低倍镜、高倍镜的使用方法。3、了解动物细胞的形态和结构。4、了解临时标本的制作方法。【实验用品】显微镜、擦镜纸、载玻片、镊子、牙签、纱布、棉花、吸水纸、剪刀、玻璃缸、碘酒稀释液或伊红染液、吉姆萨（Giemsa）染液、甲醇、上皮细胞装片、成纤维细胞装片、兔神经节细胞装片。蟾蜍。【实验内容】显微镜是一种复杂的光学仪器，广泛地应用于医学的教学、科研及临床中，其作用是将细微结构放大，以便观察。一、 显微镜的构造和使用方法（一）显微镜的构造微镜的构造主要分为三部分：机械部分；光学部分；照明部分（图11）。1、机械部分 (1) 镜座：为显微镜的基座，呈马蹄形（双筒目镜为方形），支持整个镜体，起稳固作用。(2) 镜柱：为垂直于镜座上的短柱，用以支持镜臂。(3) 活动关节：为镜柱和镜臂间的活动连结部分，可使镜臂在90范围内任意倾斜，以利于观察。但倾斜度不宜过大，一般不超过30，以防翻倒。(4) 镜臂：连于柱上方呈弓形结构的部分，适用手握，各种机械装置，都直接或间接地附于其上。(5) 调节器：镜柱上方有两对齿轮，上方较大一对称粗调节器；下方较小一对称细调节器，轮动时能使镜筒上下移动来调节焦距。粗调节器可使镜筒升降较快（旋转一周可上、下移动1-2cm）一般使用低倍镜时多用它；细调节器可使镜筒缓慢升降（旋转一周可上、下移动0.01cm），多在高倍镜下使用，对焦距作精细调节，籍以对物体不同层次、深度的结构做细致观察。（双目镜的调节器，细调节器节器位于粗调节器外侧。在镜筒一侧的粗调节器内侧，有粗调节器限位环手柄，用来限定载物台可达到的最大高度；另一侧的粗调节器内侧有张紧螺旋，可调节粗调节器的松紧）。(6) 镜筒：位于镜的前方的圆筒，上端装置目镜；下端连接物镜转换器。镜筒借调节器上下移动。（双筒镜，在镜筒上方，两目镜间有一标尺，可调节目镜间距离）。(7) 物镜转换器：镜筒下方一个可旋转的凹形圆盘，一般装2-4个放大倍数不同的接物镜。旋转它时，可转换物镜。(8) 载物台：位于镜臂下方的平台，可以放置玻片标本。载物台中央有一圆形通光孔，光线可以通过它由下向上反射。(9) 标本推进器：位于镜台后方或侧面边缘，连一可动弧形弹簧荚，其上方一侧有两旋钮可调节推进器，使玻片标本向前后或左右移动（推进器旋钮也可垂直连在一起）。推进器上有纵横游标卡尺，用以测定标本的方位及大小，读法同游标卡尺。2、光学部分(1) 接目镜：装有镜筒上端，放大倍数为525倍数种，“5”即表示5倍。目镜内常装一指针，以指示观察标本。(2) 接物镜：嵌装在转换器上，一般分低倍镜（8、10）、高倍镜（40、45）、油镜（90、100）三种。镜头末端经常有不同颜色的一圈线表示不同倍数，有时油镜上标有oil等字样。有的物镜上刻有0.25、0.6、1.25等字样，表示镜口率（N.A），标有160/0.17，160表示目镜至转换器平面不能小于160mm，0.17表示盖玻片厚度不能超过0.17mm，若超过0.17mm，就会看不清标本。显微镜放大倍数=目镜放大率物镜放大率。例如：目镜是10，物镜是40，则放大率倍数为400倍。3、照明部分(1) 反光镜：位于镜柱前方的圆镜，分平面镜和凹面镜，光线暗时用凹面镜。(2) 聚光镜：由几组透镜组成，装于镜台下方，其作用是聚光，增强视野亮度，聚光器一侧有一螺旋，旋动它可升降聚光器，上升时可增强反射光，反之则减弱反射光。(3) 光圈：是聚光镜底部的一个圆形结构，为多片半圆形的金属片叠组成。在圆环外缘有一突起的小柄，拨动它能使金属片分开或拿拢，用以控制光线的强弱，使物像更清晰。（二）显微镜的使用方法用右手握住镜臂，左手托住镜座，从镜箱内取出显微镜，平端，将之放于身前稍左侧的实验台上，镜臂对着胸前，镜筒向前方。镜座与桌边距离2寸。1、低倍镜的使用(1) 先向上移动粗调节器，使镜筒上升，再转动旋转盘，使低倍镜对准能光孔，即能听到“卡扣”的固定声响，同时感到手有阻力，说明物镜与镜筒已成一直线。(2) 对光：打开光圈上升聚光器，使之和载物台平齐，左眼在目镜上观察（两眼齐睁，双筒镜用双目观察，以下同此处.），同时用反光镜凹面向光源聚光，使视野亮度适宜。(3) 放置玻片标本，将盖片一面朝上置于载物台上，玻片两端用弹簧夹夹住，然后移动玻片，使标本对准通光孔。(4) 调焦：从侧面观察低倍镜，转动调节器，使镜筒下降至低倍镜镜头距盖玻片0.5cm处，用左眼观察目镜，慢慢上移粗调节器，直至视野出现清晰物像为止。如果物像不在视野中央，可移动玻片位置，使之移至视野中央。2、高倍镜的使用：使用前须依上述步骤先在低倍镜下找到物镜后，再把放大物像移至视野中央，调节至最清晰，再进行下述操作。3、低倍镜和高倍镜的使用练习(1) 取一张干净的载玻片，用钢笔在正中写一个微小的“上”字，在低倍镜下观察，练习对光，调节光线，调焦等。将玻片前后、左右移动。注意物像怎样移动？(2) 观察蛙血涂片，先用低倍镜，再用高倍镜观察。显微镜使用完毕后，转动粗调节器，使镜筒徐徐上升，取下玻片，并转动转换器，使物镜离开聚光器，下降镜筒使物镜接近（但不靠近）载物台，将入箱中。(三) 使用显微镜的注意事项1、拿显微镜，应右手紧握镜臂，左手托住镜座，不能一手随便斜提，防止零件脱落。2、用完后必须将目镜、反光镜、物镜用洁布擦净，切勿口吹、手摸或用粗布及其它硬物揩拭，勿用乙醇等药物，以免侵蚀镜头及其它物件。3、使用时先用低倍镜调节光源，如标本颜色较浅，应适当调小光圈，使物像清晰。4、放置玻片标本时，应使盖玻片（有标本）一侧朝上，使观察处对准通光孔。5、观察时要双目齐睁，使用高倍镜时必须用细调节器调焦。调节器不能做单方向旋转，如一直上升会使镜筒脱落，反之会压碎标片。6、不要随意取出物镜，以防灰尘落入，禁止任意拆卸零件，以防意外损伤。7、用完后，复原装入箱内。二、动物细胞的形态和结构 (一) 人口腔粘膜上皮细胞的制作与观察。吸取一滴碘酒稀释液或伊红染液滴在一张洁净的载玻片中央，用一根牙签的钝端伸入自己的口腔内壁，轻轻刮取粘膜上皮细胞，将它涂在碘酒稀释液中，轻轻搅动，使细胞分布在玻片中，要分布均匀，待其染色。然后用镊子夹取盖玻片，让盖玻片一边先接触水滴，再慢慢放下，避免产生气泡，如果盖玻片周围有过多的水份，用吸水纸吸去。将自制的口腔粘膜上皮细胞标本置于低倍镜下观察，挑选完整、轮廓清晰的细胞，移至视野中央，换高倍镜观察，可见到口腔上皮细胞呈扁平形状，细胞膜薄，中央有一卵圆形的细胞核，细胞核与膜之间为细胞质。(二) 蛙血图片标本的制作与观察取活蛙一只，剪断后肢，滴一滴血于载玻片的右端（或心脏取血），另拿一张边缘光滑的载玻片，让其一边接触血液，血液沿边缘展开，使推血玻片与盛血玻片成45角，迅速向前推移，使血液成薄层均匀分布。推片时，玻片斜角越小，速度越快，则涂片愈薄，反之愈厚。推片时要动作协调，快慢一致，用力均匀，血片晾干后，放在盛甲醇的玻璃缸中，固定3分钟，将固定后的玻片放在盛有Giemsa染液的染色缸中，染色15分钟，用自来水冲洗，晾干后置显微镜下观察。在低倍镜下，选择分布均匀的血细胞，换高倍镜观察。蛙血红细胞呈椭圆形，中央有一椭圆形细胞核，核质不显著。除红细胞外，涂片中还可以见到各种不同的白细胞及血小板。其数量比红细胞少得多。【作 业】 绘制人口腔粘膜上皮细胞及蛙血红细胞图。实验二 细胞的显微测量【实验目的】 掌握细胞的显微测量方法。【实验用品】1.材料：蛙血涂片。2.器材：显微镜、目镜测微尺和镜台测微尺。【实验内容】细胞的大小，一般可用显微测微尺加以测量，显微测微尺由目镜测微尺和镜台测微尺组成。目镜测微尺是放入目镜内的标尺，是一块特制的小玻片，其上刻有50或100个等分的刻度，每一刻度（小格）的长度是随物镜放大倍数而改变。所以在使用前，应在所采用的放大倍数的物镜下，用镜台测微尺加以标定后，才能代表其实际长度。因为镜台测微尺刻度的每格长度是已知的，其标定及测量方法如下：1、 将镜台测微尺置于镜台（即载物台）中央，先用低倍镜，找到镜台测微尺的刻度。每一大格为0.1mm，每一小格为0.01mm（即10m）。2、 目镜测微尺已事先装入目镜筒中，转动目镜筒或移动镜台测微尺，使两标尺平行。3、 转换高倍镜，在视野中使物镜测微尺任一刻度与目镜测微尺的任一刻度线重合为起点，沿两标尺平行方向，再找到另一重合刻度线为终点，记录下两重合线这一区段标尺各自的格数，即可算出目镜测微尺每小格的长度，如低倍镜下所标定的目镜测微尺的全长为50格，相当于镜台测微尺的68格，即可求出目镜测微尺的全长为50格，相当于镜台测微尺的68格，即可求出目镜测微尺每小格等于13.6m。 50：68=1：X X=1.36格36X10（m）=13.6（m）4、 取下镜台测微尺，换上需要测量的玻片标本，用目镜测微尺的刻度来测量细胞长度（格数），所得的细胞长度（格数）乘以每刻度的微米数（m），即为细胞的实际长度。5、 蛙红细胞的测量：在测量过程中，为了避免细胞之间误差，要求分别测量5个蛙的红细胞的长径和短径，列表记录并算出其平均值。如果选用不同倍数的物镜与目镜时，就必须重新计算，方法同前。【作 业】 1、 列表记录5个蛙红细胞的长径和短径，并算出其平均值记录蛙红细胞长、短径及平均值编号 1 2 3 4 5 长径（m） 短径（m）2、细胞测量时，在低倍镜下标定目镜测微尺的长度，转换高倍镜测量细胞长度。是否需要重新标定？为什么？28实验三 细胞组份的化学反应与细胞计数【实验目的】1、 掌握核酸、蛋白质在细胞内的存在部位。2、 学习核酸和蛋白质的细胞化学染色的原理和方法。3、 掌握细胞记数方法。【实验用品】1、 材料：蟾蜍、洋葱 鸡红细胞2、 器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、剪子、镊子、吸管、小烧杯、酒精灯、吸水纸、染色缸、水浴箱、解剖针、解剖盘、计数板。3、 试剂：甲基绿派洛宁染色液、丙酮、乙醚、正丁醇、5% 三氯醋酸、0.1%碱性固绿、0.1%酸性固绿、95%乙醇。【实验内容】一、实验原理1、 利用DNA分子和RNA分子的聚合程度的不同，对碱性染料有不同的亲和力而进行选择性染色。由于甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它对聚合程度高的DNA分子有强烈的亲和力，则DNA分子被染成蓝色或绿色；而派洛宁分子上只有一个相对的正电荷，它仅和聚合程度低的RNA分子想结合，使RNA分子染成红色。因此，可用Brachet反应对细胞中的DNA和RNA分子进行定位、定性和定量分析。由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同。2、 所以在不同的PH值溶液中，蛋白质所带的净电荷多少也不同，在正常生理条件下，如蛋白质所带的负电荷多，则为酸性蛋白质；所带的正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本用三氯醋酸处理抽取提出核酸后，用不同PH值的固绿染液分别染色，使细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白显示出来。二、实验步骤（一）细胞内DNA和RNA的显示（Brachet 反应）A、蟾蜍血涂片DNA和RNA的显示（1） 涂片：将蟾蜍用乙醚麻醉，打开胸腔，剪开心脏。取心脏血做血涂片，室温晾干。（2） 固定：将晾干的涂片浸入95%乙醇中固定510分钟，室温晾干。（3） 染色：在标本上滴数滴甲基绿派洛宁染液，染色510分钟，用蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去玻片上多余的水分（不要吸得过干）（4） 分化：然后迅速在丙酮溶液中沾一下（时间少于一秒钟，以免分化过度），马上用吸水纸快速吸去玻片上的丙酮溶液，然后在正丁醇溶液中沾一下，用吸水纸吸干溶液后镜检。B、洋葱表皮细胞DNA和RNA的显示（1） 取洋葱内表皮一小片，置于载玻片上；（2） 滴一滴甲基绿派洛宁染色液，染色3040分钟；（3） 用吸管吸一滴蒸馏水冲洗，立即用吸水纸吸干（哌咯宁易脱色）；（4） 盖上盖玻片，镜检。（二）细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示（1） 取材和涂片：以脊髓破坏法处死蟾蜍，将其腹面向上放入蜡盘中剪开胸腔，打开心包。将心脏剪一小口，取心脏血滴在干净的载玻片一端，45角推片、涂片，室温晾干。（2） 固定：将涂片放在95%乙醇中固定510分钟，室温晾干。（3） 三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸入预热60的5%三氯醋酸中30分钟，后用蒸馏水反复冲洗，除去三氯醋酸残液（这是染色成功的关键），用吸水纸吸干玻片上的水分。（4） 染色：将涂片分别放入0.1%酸性固绿（PH2.02.5）中染色5分钟；在0.1%碱性固绿（PH8.08.5）中染1520分钟，清水冲洗、盖上盖片晾干、镜检。（三）人红细胞和蛙血细胞计数在细胞生物学的实验中，进行活细胞的鉴定和细胞的计数，调整细胞的密度，是细胞生物学实验必不可少的一种基本技能。实验步骤1、 取蛙心脏血0.5ml用0.85%生理盐水稀释1020倍，轻轻吹匀制成悬液，用95%酒精棉球将细胞计数板和一张盖片擦干净，然后把盖玻片覆盖在细胞计数板上使之微微移向一侧，露出计数板台面边缘，以便滴加细胞悬液2、 滴加少许悬液放有盖片的细胞计数板边缘斜面上，使液体自然滴入盖片下的空隙均匀地充满计数板小室即可，静止23分钟待细胞在计数板下沉淀后计数，（注意：向细胞计数板滴加细胞悬液时要干净利落勿使液面超过盖玻片。加量要适当，过多会使盖玻片飘移，过少会使计数板的小室内有气泡产生。不理想时要从新滴加否则会影响细胞计数的效果）。3、 在普通光学显微镜“10X”物镜下细胞计数。先调焦看清计数板上的格线然后将四角的大格逐个移入视野中心，逐一计数四个大格（每一个大格含16个小格）内的细胞数，对于细胞压线者数上不数下，或数左不数右，如有2个以上细胞组成的细胞团时，应按单个细胞来计数。如细胞团数占10%以上，说明消化不充分；或细胞数少于200个/平方毫米或多于500个/10mm2时均说明稀释不当，需重新制备细胞悬液，再重新进行细胞计数。 (三)结果 按下式进行细胞浓度的计数：图 细胞计数板顶面观和侧面观的图示 注 4大格中的每一大格体积为0.1mm3。1ml=l，0000大格，因此，1大格细胞数104=细胞数ml。 注 染色标本在15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。进行细胞计数时应力求准确，因此，在科学研究中，往往将计数板的两侧都滴加上细胞悬液，并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板几次)，最后取结果的平均值。三、实验结果与分析镜下可见细胞质被染成浅红色；细胞核被染成蓝绿色，表示含有DNA；核仁则被染成紫红色，表示含有RNA。镜下可见经酸性固绿的标本，因在胞质和核仁中有酸性蛋白被染成绿色，细胞核未染色。经碱性固绿染色标本，只有细胞核被染成绿色，这是碱性蛋白质（组蛋白）分布的部位。【作 业】 1、 绘制：在细胞中碱性蛋白和酸性蛋白，DNA和RNA的分布图。实验四 物质运输的实验观察【实验目的】1、 观察细胞膜的渗透性和细胞吞噬作用的过程，并理解其原理；2、 掌握本实验的基本操作技能，学会实验记录的方法。【实验用品】1、 材料：洋葱、小鼠 鸡红细胞。2、 药品与器材：氯化钠溶液（10%、0.85%、0.01%），1%鸡红细胞悬液、肝素抗凝剂（500u/ml）、6%淀粉肉汤（含胎盘蓝）；载玻片、盖玻片、尖镊子、小尖刀、玻璃刀、吸水纸、试管。【实验内容】（一）、细胞膜的渗透性（osmosis）1、实验原理：细胞通过细胞膜与周围环境进行有选择性的物质交换。这种物质交换有几种形式。水分子常以简单扩散的方式通过细胞膜。如果细胞内外存在着渗透压的差别时，水分子较多地由渗透压低（水分子的密度高）的一侧，向渗透压高的一侧扩散，水分子较少地象渗透压低的一侧扩散。因此，在高渗环境中，动物细胞失水而皱缩，而植物细胞由于有细胞壁的存在，细胞的细胞膜向细胞内皱缩产生质避分离。在低渗环境中，动物细胞能吸水膨胀直至破裂。 2、实验方法（1）小鼠红细胞的渗透性在编号1、2、3的三张载玻片中央，各滴小鼠血一小滴。然后在编号1的载玻片上加1号溶液一滴，在编号2的载玻片上滴2号溶液一滴，在编号3的载玻片上滴3号溶液一滴，各盖上盖玻片。5分钟后，在显微镜下观察，各载玻片上红细胞发生了什么变化？并将变化现象填入表1（实验结束后，公布1-3号氯化钠溶液的浓度）。（2）洋葱表皮细胞的渗透性（示植物细胞的质壁分离现象） 先用吸管滴一滴蒸馏水在干净的载玻片中央，然后用尖镊子在洋葱内用镊子展平表皮勿使其折叠和皱缩，再用尖镊子夹取一盖玻片，并使其与载玻片成45角徐徐放下，将此做好的洋葱表皮细胞临时制片置低倍镜下观察，可见到洋葱表皮是有许多长长方形的细胞组成，细胞内有圆形的细胞核。 换用高倍镜观察，每个细胞的外边均有一层厚厚的细胞壁，细胞壁内侧紧贴细胞膜（但不能分辨），在细胞膜与细胞核之间是细胞质。正常细胞的细胞质紧靠着细胞壁内侧的细胞膜，并无分离现象。用吸管滴一滴10%氯化钠溶液在盖玻片的一侧（不要直接滴在盖玻片上）随即用吸水纸在对侧的盖玻片边缘吸水，此时氯化钠溶液随之流入盖玻片下面，再用高倍镜观察洋葱表皮细胞，可以看到质壁分离现象。（二）、细胞的吞噬作用（phagocytosis）1、实验原理：中性粒细胞和巨噬细胞能伸出伪足，把周围的微生物和其他一些颗粒物质包围起来，在细胞内形成吞噬泡，然后加以消化。本实验以注射淀粉肉汤的方法诱发小鼠体内的巨噬细胞数量增多，然后再向小鼠腹腔内注射鸡红细胞，观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程。2、实验方法：在实验的前2天，每天给小鼠行腹腔注射6%淀粉肉汤1ml（含0.3%胎盘蓝，起标记作用）。实验时，每实验室取两只注射过淀粉肉汤的小鼠，每鼠腹腔各注射1%鸡红细胞悬液1ml，25分钟后再注射0.9%氯化钠溶液0.5ml。3分钟后，用颈椎脱臼法（一手用镊子夹住鼠颈，另一只手捏住鼠尾，向两端牵拉，直至颈椎脱臼而死）处死小鼠。剖开腹腔，用未装针头的注射器直接抽取腹腔液，制成临时标本，先用低倍镜找到标本后转高倍镜观察。在高倍镜下可看到许多圆形或形状不规则的巨噬细胞，因未染色故不易见到细胞核，其细胞质中含有数量不等的蓝色圆形颗粒，这是吞入含胎盘蓝的淀粉肉汤造成的。在细胞质中还可见到少量黄色椭圆形的有细胞核的鸡红细胞，慢慢移动玻片标本，仔细观察，可见到巨噬细胞吞噬鸡红细胞过程的不同阶段的情况：有的红细胞紧附在巨噬细胞表面；有的红细胞已部分被巨噬细胞吞入；有的巨噬细胞内已吞入了一个或多个红细胞形成吞噬泡。【作 业】 1、（1）下表记录小鼠血红细胞在三种不同氯化钠溶液中的形态变化并对结果进行分析。在三中不同浓度氯化钠溶液中小鼠血红细胞的形态变化氯化钠溶液 红细胞形态变化 原因分析 （2）绘小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的过程图（包括开始、进入和吞入细胞内三个阶段），并注明各部分名称。2、（1）在给人输液时，为什么要用等渗溶液（0.9%氯化钠溶液）（2）解释洋葱表皮细胞产生质壁分离的原因。实验五 人类外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备【实验目的】1、 掌握微量全血培养及正常细胞和肿瘤细胞常规核型的标本制备技术。2、 了解正常及肿瘤细胞核型的一般特性。【实验用品】1、材料和标本 健康人的外周血、培养的Hela细胞和HL60细胞。2、 器材和仪器 超净台、煤气灯、乳胶管、火柴、镊子、废液缸、离心机、水浴箱、定时钟、天平、离心管（10ml）、注射针头（7号）、刻度离心管（5ml、2ml、1ml）、吸管等。3、 试剂 1640培养液、500单位/ml的肝素溶液、10g/的ml秋水仙素溶液、0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA混合消化液、0.5mg/ml的PHA溶液、0.075mol/L的KCI溶液、甲醇、冰醋酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液（pH6.8）、生理盐水等。【实验内容】一、微量全血培养（一）、原理人体外周血中淋巴细胞是成熟的免疫细胞，正常情况下处于G。期不在增殖。PHA(phytohemagglutinin,植物血凝素)是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂刺激剂，它能使处于G。期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞。进入细胞周期开始旺盛的有丝分裂。人体微量全血培养是一种简单的淋巴细胞培养方法。此法采血量少、操作方便，在PHA作用下进行短期培养即可获得丰富的、有丝分裂活跃的淋巴母细胞，适于制备核型标本。各种因素的效应（如病毒、电辐射、化学药剂等）也可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而进行多种在体内无法进行的研究。因此它是细胞生物学及其他学科研究中的一种有效的方法。（二）、操作1、 打开超净紫外灯2030分钟。洗手、换洁净服后进入操作室。启动超净台，点燃煤气灯。用75%酒精棉球擦洗手、各种试剂瓶及操作台面，然后将培养液及肝素、秋水仙素、PHA等所需溶液移入超净台。2、 在超净台内将每个培养瓶装入5ml培养液及0.2mlPHA溶液，封好备用。3、 用5ml注射器、7号针头，先吸取少量肝素湿润针筒，然后从肘静脉抽血12ml。每个培养瓶接种全血0.2ml左右轻轻摇动使血和培养液混匀。4、 在培养瓶上标记好供血者姓名、性别、采血日期等，放入培养箱中37培养。每天轻轻震荡培养瓶二、三次，防止血球沉淀并保证血细胞与培养液充分接触，促使细胞生长繁殖。二、人淋巴细胞染色体标本制备（一） 原理在淋巴母细胞分裂高峰时加入秋水仙素，破坏细胞纺锤体的形成，使细胞停止在分裂中期。然后收集细胞，低渗处理，使细胞膨胀，染色体伸展。接着进行固定并除去中期分裂相中残存的蛋白质，使染色体清晰且分散良好。再结合离心技术去掉红细胞碎片，然后采用空气干燥法制片获得中期染色体标本。（二） 操作1、微量全血细胞培养至68小时左右，用1ml注射器7号针头向每个5ml培养瓶内加2滴秋水仙素溶液，摇匀后继续培养3小时，此项操作不需要严格无菌。2、按时终止培养，用吸管温和吹打成细胞悬液后，移至10ml离心管中，用天平平衡后以1000rpm离心8分钟，弃大部上清，剩0.5ml。再吹打成细胞悬液，加入预热37的0.075mol/L的KCL溶液9ml，置37水浴中低渗处理30分钟（这期间配制3：1甲醇冰醋酸固定液）。1、 向离心管中加入1ml固定液预固定。平衡后以1000rpm离心8分钟，同样剩0.5ml上清。2、 轻轻将细胞吹成悬液，加56ml固定液，室温下固定30分钟。然后离心，弃上清，重复固定一次。再离心，留0.10.2ml上清，吹打成细胞悬液。3、 吸取12滴悬液，在距载片约15cm高度滴于预冷的干净载玻片上，迅速对准细胞吹气促进染色体分散。斜放载玻片，在空气中晾干（此期间配制Giemsa染液Giemsa原液和磷酸缓冲液1：10）4、 将标本面朝下放在染色槽中，加入染液染10分钟，自来水冲洗，晾干后观察。（三） 结果 低倍镜下，制片质量较好的标本上可看到有较多的分裂相，染色体之间分散良好，互不重叠。油镜下观察可见每一条染色体都 含有两条染色单体，两条单体由着丝粒相结。分区记数染色体数目并判定性别，或拍照后进行核型分析。一、 核型分析 （一）人体染色体的观察取制备较好的染色体玻片标本，先在低倍镜下观察。在标本中选择一个染色体之间分散较好，互不重叠的中期分裂相，置于视野中央，然后换油镜仔细观察。每个染色体都含有两条染色单体，两单体连接处为着丝粒。计数时要把分散的染色体划分为几个区域以免计数重复或遗漏，然后计数并判定性别。（二）核型分析的方法人体染色体常规核型的分析，在今天的染色体研究水平上作为如同结构异常的疾病诊断已经失去意义，但对染色体数目异常仍具有诊断上的价值，尤其是起着分析其它几种显带核型的桥梁作用。通过常规核型的分析必须掌握三点：（一）会分组、（二）了解各组染色体的基本形态特征、（三）学会计数数目和鉴定性别。人体染色体的常规核型即按照Denver会议（1960年）提出的染色体命名和分类标准，将人类体细胞的46条染色体按大小、着丝点的位置分成七组（A、B、C、D、E、F、G）23对的排列。七组染色体的基本形态特征及分析顺序是；A组是七组染色体中最大的一组，首先找出它。A组包括三对，即13号6条染色体，第1号最大、是中央着丝点，长臂近侧有次溢痕；第2号第二大、着丝点略偏离中央；第3号为第三大，是中央着丝点。接着确定B组：B组二对即第45号4条染色体，较大，均为亚中央着丝点，两者不易区分开。第三确定D组和G组：D组三对即第1315号6条染色体，中等大小均为近端着丝点，短臂末端有随体。G组二对即第2122号4条染色体，是最小的一组，均为近端着丝点，短臂末端有随体，长臂常呈分叉状，21号稍小于22号。Y染色体被隶属于该组，短臂无随体，一般较21、22号大点。第四组确定F组：F组二对即第1920号4条染色体，染色体比G组稍大、均为中央着丝点。染色体分组形态特征表分组 染色体号 形态大小 着丝点位置 随体A 13 最大 1、3中着丝点，2近中着丝点 无B 44 次大 亚中着丝点 无C 612+X 中等 亚中着丝点 无D 1315 中等 近端着丝点 有E 1618 较小 16中着丝点、17、18亚中着丝点 无F 1920 次小 中着丝点 无G 1222+Y 最小（Y有变异） 近端着丝点 有（Y无）第五确定E组：E组三对即第1618号6条染色体，较小，第16号是中央着丝点，17、18号是亚中着丝点。余者为C组：C组七对即第612号14条染色体，按大小顺序依次排列，均是亚中着丝点；X染色体被隶属于该组，大小居67号之间，是亚中着丝点。上述人的常规核型中，122号为常染色体，男女共有，另一对为性染色体，决定性别，男性为XY女性为XX，人的正常核型写法：男46，XY 女46XX。图1 各组染色体基本形态特征的模式图图2 G显带染色体核型【作 业】 完成染色体核型分析报告。实验六 细胞有丝分裂和减数分裂形态观察【实验目的】1、 掌握细胞有丝分裂和减数分裂的过程及各时期形态特征。2、 进一步熟练掌握显微镜的使用及绘图方法。3、 熟悉小白鼠睾丸减数分裂染色体标本的制备过程。【实验用品】1、 材料：洋葱根尖切片、马蛔虫子宫切片、体重1820克的健康雄性小白鼠2、 试剂：1%柠檬酸钠、60%醋酸、100g秋水仙素、固定剂（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液、磷酸缓冲液（pH6.8）、醋酸洋红染液。3、 器材：解剖盘、解剖刀、剪刀、小镊子、小剪刀、解剖针、培养皿、刻度离心管、离心机、胶头滴管、载片、玻璃笔、镜油、擦镜纸等。【实验内容】二、 有丝分裂（一） 动植物细胞有丝分裂的特征1、 植物细胞（洋葱根尖）有丝分裂的特征；前期：核膨大，核内染色质螺旋形成丝状结构，进而缩短变粗，形成染色体；同时，核膜破裂，核仁逐渐消失。中期：染色体在纺锤体丝的作用下排列在赤道部位，形成迟到板，即位与纺锤体的中部。每条染色体已纵裂为二，但未分开，因而不易看清子染色体。后期：在纺锤体丝的作用下染色体纵裂为二，相互分离并向细胞的两极移动，全部染色体分成数目相等的两组，分别集中于细胞的两极。两组染色体之间还存在有纺锤丝。末期：两组染色体在两极紧密聚集，解螺旋而成两团浓密的染色质；核仁，核膜逐渐出现，形成两个细胞核。纺锤丝逐渐消失，在两个新核之间出现中板细胞板。最后形成两个新细胞。又进入间期状态。2、 马蛔虫受精卵细胞有丝分裂特点间期：细胞质内有两个细胞核，一为雌原核，一为雄原核。两个原核不易辨别，染色质分布均匀，有一个核仁，核膜完整。靠近细胞核中有中心体存在。前期：雌、雄原核互相靠近，核仁小时，核中染色质逐渐螺旋聚集，形成一定数目的染色体。前期末核仁膜逐渐消失，中心体的两个中心粒彼此繁荣那里，周围出现星射线并分别向两极移动。中期：染色体在纺锤体丝的作用下排列在细胞中央，形成赤道板。由于制作标本时细胞切面不同可出现两种情况：一种是极面观，可见6条染色体平排与赤道面上，此时染色体已纵裂为二，但未分离；一种是侧面观，染色体排成一线，两极各有一中心粒，星射线、纺锤体明显。后期：纵裂后形成的姐妹染色单体受纺锤丝牵引，分别向细胞两极移动，形成数目相等的两组。后期末，细胞膜中部表面在赤道板部位向内凹陷，出现横缢。末期：到达细胞两极的染色体逐渐解旋，恢复形成染色质。核仁、核膜逐渐出现，纺锤丝、星射线小时，细胞膜的横缢加深，最后形成两个子细胞。综上所述，两种细胞的分裂过程基本相同，但应注意以下区别：A：动物细胞有中心体，两中心粒分离时有纺锤体出现。B：在末期时动物细胞两个子核不出现细胞板，而是通过细胞中部的细胞膜内陷，以横缢的方式把细胞分裂为二。（二） 动植物细胞标本的观察1、 植物细胞洋葱根尖切片：首先在低倍镜下观察尖部的生长区，此区细胞个体比较小，排列紧密，近似正方形，具有分裂旺盛的特点。镜下可见不同时期的有丝分裂图像。换高倍镜观察各期特点。图92 洋葱根尖细胞有丝分裂2、 动物细胞马蛔虫子宫切片：低倍镜下，马蛔虫子宫切面上可见子宫内有许多近似圆形的受精卵细胞，大多处于不同的分裂时期。每个受精卵细胞外均围有一层厚的卵膜，卵壳与卵细胞之间的空隙为围卵腔。在有些受精卵细胞外表面或受精卵膜内面可见有级体附着，找到各期细胞，转换至高倍镜观察。 图 马蛔虫受精卵的有丝分裂三、 减数分裂（一） 减数分裂的特征减数分裂是生殖细胞在成熟期进行的一次复制，再次连续分裂，最终形成四个单倍体子细胞的过程。其主要特征如下：减数分裂的第一次分裂1、 前期1：这一时期特别长且复杂，又可分为以下五个时期；（1） 细线期：细胞核膨大，染色体呈细丝状，盘绕成团，其中可见核仁。（2） 偶线期：同源染色体开始配对（联会：同源染色体相互靠拢在一起的过程），联会的结果，每对染色体形成一个二价体，有n对染色体的细胞中将形成n个二价体，此期染色体很细，不易与细线期区分。（3） 粗线期：染色体变得短粗，呈粗线状。每个二价体都是由两条同源染色体组成。每一同源染色体都是由两条复制而来的姐妹染色单体构成。每个二价体由四条染色单体组成，又称四分体。（4） 双线期：同源染色体开始相互排斥分离，但不完全分开，形成交叉。（5） 终变期：染色体变得更短粗，交叉逐渐移至染色体的两端，核膜破裂、核仁消失。2、 中期1：在纺锤体丝的作用下，各二价体（四分体）排列在细胞中央形成赤道板。3、 后期1：在纺锤体丝的牵引作用下同源染色体（四分体）分离，形成两个二分体，分别向细胞的两极移动。4、 末期1：移动到细胞两极二分体不解螺旋，核膜形成，分别形成两个细胞核。细胞膜在赤道板处向内缢缩，使细胞质均匀地分开，形成两个子细胞，此时染色体的数目减半。上述过程完成后，经短暂间期（此期不进行DNA的复制）即进入减数分裂的第二次分裂。1、 前期11：核膜消失，每个细胞只有n个二分体。2、 中期11：在纺锤体丝的作用小秒 ，各二分体排列在细胞中央形成赤道板。3、 后期11：在纺锤体丝的牵引下，每个二分体的着丝粒分裂，姐妹染色单体分离，并分别移向细胞两极。4、 末期11：移到两极细胞的各姐妹染色单体，解螺旋，核膜形成，分别形成两个细胞核。细胞膜在赤道板处向内缢缩，使细胞质均匀分开，形成四个单倍体的子细胞，至此，减数分裂全部结束。（二）、小白鼠睾丸减数分裂标本的制备及观察减数分裂发生在性细胞形成过程中，哺乳动物在性成熟后睾丸内的生殖细胞总是分批分期不断成熟。因此，对哺乳动物睾丸进行特殊处理，随时可以获得减数分裂过程中各时期的染色体标本。1、 标本制备：1、 取体重1820克重健康雄鼠一只。处死前4个小时腹腔内注入秋水仙素（10g/1g体重）。2、 用断髓法杀死白鼠，破腹取出睾丸。将睾丸放入培养皿中，加入1%柠檬酸钠溶液，其用量以浸过睾丸为准。3、 用小剪刀和镊子剥离包在睾丸外面的白膜，尽量少伤及内部结构。4、 换一次柠檬酸钠液，在溶液中用镊子和解剖针将睾丸组织轻轻地撕开。尽量去掉解缔组织和未破碎的大块，使培养皿中只保留呈线状的细精小管。5、 用剪刀将细精小管煎碎，将其移入刻度离心管中，加入10ml柠檬酸钠溶液，用吸管吹打几次，静止10分钟，取上清液，移入另一离心管中，2000rpm离心3min。6、 去上清液，加37预温KCL溶液低渗15min7、 预固定：加少许固定液（甲醇：冰醋酸 3：1）混匀，2000rpm离心3min去上清液。8、 固定：加少许固定液，2000rpm离心3min，去上清。9、 滴片：加1ml固定液，打匀，滴片，干燥。10、染色：Giemsa染色8min，冲洗吹干镜检。 2、 观察：先用低倍镜检查玻片标本，调清焦距后找密度适宜的区域，转高倍镜观察，再转至油镜观察，油镜下可见多个处于分裂期的分裂相细胞，可见二倍体的精原细胞，粗线期和终变期的初级精母细胞及大量处于细线期的初级精母细胞。附图：小鼠睾丸组织减数分裂前期细胞形态 细线期 偶线期 粗线期 双线期 终变期【作 业】 5、 写出马蛔虫卵细胞或洋葱根尖细胞分裂的各个时期的特征。6、 绘制减数分裂前期1、中期1、后期1和末期1各时期的图像。实验七 细胞融合【实验目的】掌握细胞融合原理、应用PEG细胞融合的方法以及细胞融合率的计算。【实验用品】1、材料 鸡红细胞2、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片3、试剂：50%PEG（MW4，000）、Hanks液（PH7.4）【实验内容】 一、原理细胞融合（Cell fusion），即在自然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的）使两个或两个以上的细胞合并横一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。 细胞融合的诱导物种类也很多，常用的主要有灭活的仙台病毒（Sendai virus），聚乙二醇（Polyethyleneglycol,PEG）和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，以为它易得到、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。二、 方法（2） 取新鲜鸡血以0.85%生理盐水制成10%的悬液。（3） 称取0.5克PEG（MW=4.000）放入试管内，在酒精灯上融化，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50%的PEG溶液。放入37水浴中待用。（4） 取上述10%的鸡血红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5ml Hanks液混匀，然后以1.000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。（5） 取上述50%PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置1分钟左右。此全部过程都要求在37水浴内进行。（6） 缓慢滴加9ml Hanks液以终止PEG的作用，在37水浴内静置5分钟。（7） 离心弃上清后，取一滴融合的细胞悬液滴片，加盖玻片镜检。三、 结果观察在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡血红细胞膜融合在一起，形成一个异体核细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。四、 融合率的计算 在高倍镜下随机计数200个细胞（包