第四章色谱分析法.doc

第四章 色谱分离法第四章 色谱分离法4-1 色谱分离法分类及其一般原理“色谱法”（chromatography）是上本世纪初由俄国化学家M.茨维特首先提出的，1903年他在一次讲演中介绍了在碳酸钙柱上用石油醚分离叶绿素的实验。“色谱”的意思是指在柱上可看见有颜色的区带。近一个多世纪来，各种类型的色谱法先后发展起来，在石油、化工、生物、医学、食品以及环境等各个领域成为一种重要的分离分析方法。色谱分离的理论也不断发展和完善起来，已发展成为一门独立的学科。一、色谱法的分类用色谱法分离各种混合物时要构成一个系统。色谱系统包括固定相和流动相。当流动相通过固定相时，由于各被分离物质在两相间分配的情形不同，逐渐被分开。色谱的分类主要有以下几种方法：（一）按固定相和流动相的物态分类气-固色谱、液-固色谱是以固体为固定相，气体或液体为流动相。气-液色谱、液-液色谱的固定相往往是附着于固体支持物上的液体。（二）按固定相所处的状态分类1柱色谱将固定相装填在金属或玻璃制成的管柱中，做成色谱柱以进行分离的，为柱色谱；把固定相附着在毛细管内壁，做成色谱柱的为毛细管色谱。2纸色谱利用滤纸作为固定相以进行分离的。3薄层色谱把吸附剂粉末铺成薄层作为固定相以色谱进行分离的。（三）按色谱分离的原理分类1吸附色谱固定相为吸附剂，利用它对被分离组分吸附能力强弱的差异来进行分离的，气-固色谱、液-固色谱属于这一类。2分配色谱是利用各个被分离组分在固定相和流动相间分配系数的不同来进行分离的，气-液色谱、液-液色谱属于这一类。3离子交换色谱以离子交换剂作固定相，利用各组分的离子交换亲和力的差异进行分离。4凝胶色谱又称排阻色谱，用多孔的凝胶作固定相，利用凝胶对分子大小不同的组分所产生阻滞作用的差异来进行分离。5其他色谱诸如离子排斥阻滞、亲合色谱、热色谱、反应色谱等等。（四）按操作方式分类1前沿色谱也称迎头色谱，把待分离的混合物溶液不断输入柱中，直至过程结束。若为三组分混合液，最先流出柱的是纯溶剂，其次是亲和力最小、保留最差的A，然后流出的是组分A和具有中等亲和力的组分B的混合液，亲和力最大的C最后流出，流出液的组成为A+B+C。前沿法不能达到组分分离。2排代色谱又称置换色谱，即一次加入一定量的混合液（如含A、B和C三种组分），然后加入对固定相有更大亲和力的D溶液（称为置换剂），它可以把所有以前保留下来的组分全部顶替出来，使他们沿色谱柱向前推进，各组分在沿柱前进过程中，依亲和力大小的不同，最先出现的是亲和力最小的A，然后是B、C，最后是置换剂D。排代法可以使各组分顺序排出，但不能达到完全分离。3淋洗色谱亦称洗脱色谱，先将少量混合物的溶液（如含A、B和C）加入到柱中，然后用与固定相亲和力比任何组分都小的溶剂E淋洗，由于反复平衡的结果，A、B、C沿柱下行，但他们的前进需要大量的溶剂E的推动，各组分的运动受溶剂-组分-固定相三方面作用力的制约，依亲和力大小而速度不同，在前进过程中各组分发生分离，各组分流出柱时以峰的形式出现，他们是纯的A、B、C，可见淋洗法能得到纯组分。（四）其他分类方法另外根据流动相的流动方式，可分为圆形色谱和径向色谱等；就规模大小可将色谱分为分析色谱、制备色谱、半工业规模色谱和工业规模色谱。本章将重点介绍薄层色谱和萃取色谱。对气相色谱、高效液相色谱、离子交换色谱、离子色谱、离子对色谱、凝胶色谱、吸附色谱、亲合色谱及超临界流体色谱的原理和应用加以简单介绍。二、色谱法的一般原理以液-固色谱为例，将一混合物加入色谱柱，在流动相的不断淋洗下，混合物内各组分便会得到分离而先后流出，若将此流出物进行检测和记录，即可得到呈正态函数分布的色谱流出曲线。图4-1为一含两组分的混合物的色谱图，以下以此色谱图为例，说明有关术语和参数。表4-1色谱法的分类及其缩写按相分类按过程原理分类按方法分类色谱法缩写色谱法缩写色谱法缩写液相色谱法LC平板纸薄层高效薄层柱高效液相FBCPCTLCHPTLCLCCHPLC液-液色谱法LLC分配反相凝胶离子交换RPCGPCIEC液-固色谱法LSC吸附离子交换亲和力疏水性IEC气相色谱法GC柱程序升温程序升压GCCPTGCPPGC气-液色谱法GLC分配气-固色谱法GSC吸附图4-1组分色谱图1基线色谱柱中仅有流动相通过时，检测器响应信号的记录值，即图4-1中的O-t线。稳定的基线应该是一条水平直线。2峰高（h1、h2）色谱峰顶点与基线之间的垂直距离h1、h2，即为峰高。峰高常被用作色谱定量的依据。3峰宽（W1、W2）色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距。如图4-1中的CD和GH的距离。半峰宽（W1/2）：峰高一半处所对应的峰宽，如图4-1中的W1/2（1）和W1/2（2）。实际工作中使用W1/2常常更为方便。4死时间（t0）不被固定相保留的组分从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，如图4-1中的OO。因为该组分不被固定相保留，所以可以认为t0也就是流动相流过色谱柱所需的时间，则流动相的平均线速度可以有柱长L与t0的比值计算：（4-1）5保留时间（tR）组分从进样到出现峰最大值所需的时间，如图4-1中的tR1和tR2。6调整保留时间（tR）组分的保留时间（tR）减去死时间后的部分，如图4-1中的tR1和tR2。7死体积（V0）不被固定相保留的组分从进样到出现峰极大值所需的流动相体积：（4-2）式中FV为流动相体积流速。8保留体积（VR）组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积：（4-3）9调整保留体积（VR）组分的保留体积（VR）减去死体积后的部分。在色谱条件一定时，保留时间和保留体积等保留值为各组分的特征常数。因此，保留值是色谱定性的依据。10分配系数（K）在平衡状态时，组分在固定相与流动相中浓度之比：（4-4）11容量因子（K）在平衡状态时，组分在固定相与流动相中质量之比：（4-5）容量因子是衡量色谱柱对分离组分保留能力的参数。12相对保留值（）在相同的操作条件下，组分与参比组分调整保留值之比：（4-6）相对保留值用来衡量两种组分被分离的能力，是色谱体系选择性的量度。13分离度（R）两相邻峰保留值之差与其平衡峰宽之比：（4-7）分离度表示色谱过程中，相邻两组分分离的尺度。14柱效能色谱柱的效能通常用以下三个参数表示：（1）理论塔板数（N）（4-8）（2）理论板高（H） 为单位理论塔板长度：（4-9）（3）有效塔板数（Ne） 由调整保留时间算得的塔板数称之为有效塔板数：（4-10）三、色谱法的基本理论用来解释和处理色谱过程的理论很多，但较通用和公认的主要的还是塔板理论和速率理论。1塔板理论色谱的塔板理论是1941年有Martin和Synge提出的。他们把色谱柱比作蒸馏塔，借助处理蒸馏过程的理论和方法来处理色谱过程而得出的半经验理论。该理论最初应用于气相色谱，后来又推广应用于液相色谱，塔板理论假设：（1）将色谱柱分为若干小段，组分可在各小段的固定相和流动相之间瞬间即建立平衡。每个小段假定为一块塔板，每个小段的柱长称为理论塔板高度。（2）在每个塔板内，一部分空间为涂在支持体上的液相占据，另一部分空间充满着载气（气相色谱），载气占据的空间称为板体积。载气进入色谱柱，不是连续的而是脉动式的，每次进气为一个板体积。（3）试样开始时都加在第0号塔板上，且试样沿色谱柱方向的扩散（纵向扩散）可忽略不计。（4）分配系数在各塔板上为常数。由上述假设导出的色谱流出曲线的连续函数形式为（4-11）由式（4-11）可知，色谱流出曲线为正态分布曲线，如图4-1所示。式中，cmax为柱后最大流出浓度：（4-12）（4-13）（4-14）式（4-12）、（4-14）中的、H、L、q、k、K分别表示进样量、理论塔板高度、柱长、柱横截面积、流动相在柱横截面所占分数和容量因子。由上述有关方程式还可以推导出理论塔板数和理论塔板高度的计算公式（见式4-8、4-9、4-10）。由此可见，塔板理论在描述色谱图形、计算柱效（理论板数）、分析各因素对色谱峰高（cmax）的影响、研究谱带变宽的原因等方面都是行之有效的，起着重要的指导作用。但是塔板理论也存在不足，有不少实验现象用它无法解释。2速率理论从塔板理论可以导出，随平衡次数的增加，由于组分被“稀释”，得到的色谱峰会有一定宽度，这个现象称为峰扩展。但实际过程中要复杂得多。影响峰扩展的因素不仅是理论平衡次数的多少。根据研究，影响峰扩展的因素主要是涡流扩散、分子扩散和传质。总的理论塔板高度是相应各因素之和：（4-15）式中是涡流项，代表装柱不均匀性，为固定相粒子直径；是分子扩散项，为填充柱上的扩散阻止参数，Df为溶质在流动相中的扩散系数，v为流动相流速； 和分别是固定相和流动相的传质项，q与固定相形状有关，称为“构成参数”，为柱参数，与装柱结构、柱径和形状有关，为溶质和流动相的相对移动速度，ds为固定相厚度，dp为柱子直径，Ds和Df分别为溶质在固定相和流动相中的扩散系数。荷兰学者范得姆特（Van Deemter）等考虑到组分在固定相和流动相之间的平衡不能瞬间完成的事实，提出了色谱过程的动力学理论，导出了塔板高度H与载气流速度v的关系式：（4-15）此式为范得姆特方程的简化式。式中A、B、C为常数，其中A称为涡流扩散项，B为分子扩散系数，C为传质阻力系数。由上式可知，在流速v一定时，只有减小A、B、C，塔板高度H才会减小，柱效才能提高，反之柱效降低，谱带变宽。因此，范得姆特方程能较好地解释有关因素对色谱柱效的影响。4-2 薄层色谱法薄层色谱法又称薄板色谱法，简写为TLC（thin layer chromatography），是把吸附剂或载体涂布在玻璃板或聚酯薄膜、铝箔等上面形成一薄层来进行色谱分离的。按其分离原理可以分为吸附、分配、离子交换和凝胶渗透四种，其中以吸附薄层色谱应用最广。在吸附薄层色谱中，吸附剂一般是极性的，当涂有极性吸附剂的薄层展开时，展开剂凭借毛细管效应开始上升，在理想状态下，展开剂前缘移动的距离（即展开剂液面到前缘的距离）L，与前移的时间t的平方根成正比，即或于是，展开剂前缘移动的速度为在实际中情况比较复杂，展开剂前沿移动的速度是不能控制的。由于试样中各组分性质各异，试样与极性吸附剂之间有不同的吸附力，在展开剂中各试样又有不同的溶解度。在展开过程中，由于毛细管的作用，展开剂流经各组分时，那些对吸附剂吸附力强的，在展开剂中溶解度小的组分，随展开剂移动得慢。相反，吸附力弱而在展开剂中溶解度大的组分则随展开剂移动得快，利用不同组分之间移动速度的差异，达到了分离的目的。如果试样是有色的，就可以看到各个有色斑，各个色斑在薄层中的位置，可以用比移值RF值来表示：（4-16）一、吸附剂及其选择在吸附薄层色谱中所用的吸附剂主要是硅胶和氧化铝，因为他们的吸附力强，可分离的化合物类型比较广泛。其次是聚酰胺、硅藻土等，他们的分子中都具有含未共用电子的氧原子或氮原子和能形成氢键的-OH或-NH2基。1吸附剂的选择和种类吸附剂的选择是吸附薄层色谱分离的关键问题，常从以下两方面考虑：被分离组分的性质（包括极性大小，水溶或油溶，物质酸碱性等）和吸附剂吸附性能的强弱。一般被分离组分的极性强，应该选择吸附能力弱的吸附剂；若被分离组分的极性弱，应该选择吸附能力较强的吸附剂。由于被分离组分种类之多，性质各异，因此很难选择一个通用的吸附剂。一般我们希望吸附剂的纯度高，粒度、结构均匀，有一定的比表面积，有适当的吸附能力，可逆性大，具有一定的机械强度和稳定性，在层展过程中，不与被分离组分和展开剂发生化学反应等等。有统计资料说明，50%以上的薄层分离采用硅胶G作为吸附剂，10%左右的分离是用不带粘合剂的硅胶来完成的，其次为用氧化铝、纤维素、聚酰胺、硅藻土以及浸渍硅胶或用两种或多种吸附剂的混合物，现主要介绍以下几种常用吸附剂。（1）硅胶硅胶是一种略带微酸性的无定形极性吸附剂，它适用于中性和酸性物质的分离，碱性物质易于与硅胶作用而造成斑点拖尾。其主要优点是具有惰性、吸附量大、在各种条件下容易制成各种不同孔径和表面积的硅胶，由于其表面含有硅醇基团，其-OH基与极性化合物或不饱和化合物能形成氢键，硅醇基团也能吸附水分而生成水合硅醇基，因此硅胶的活性与其含水量有关，含水量越多，吸附能力就越差。活性就越低。表4-2硅胶活度定级法偶氮染料活度级别偶氮苯对甲氧基偶氮苯苏丹黄苏丹红对氨基偶氮苯对羟基偶氮苯0.610.280.180.110.040.010.700.430.300.130.070.010.830.670.530.400.200.070.860.790.640.500.200.18注：表中所列数据为RF值硅胶活度的定级方法如下，取偶氮苯、对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、对氨基偶氮苯和对羟基偶氮苯六种染料。按极性大小分别依上面排序的次序编成到级。实验时将他们分别配成万分之四的干燥石油醚：苯溶液（4+1），然后把每种染料溶液（约含24g）点在薄板上，用四氯化碳展开约10cm。量出各种染料斑点中心移动的距离，按表4-2定出活度级数。常用的活度为到级。除了活度外，孔径的大小也是硅胶性质的一个重要参数。常用的孔径为6nm。常用于薄层色谱法硅胶的型号可见表4-3：表4-3薄层色谱法常用硅胶型号表示意义GGF254H或D0HF254+366D5D5FHRPF60，200等含13%石膏（G为Gypsum的缩写）含13%石膏，254表示含254nm紫外光照射下发荧光的物质无粘合剂无粘合剂，含254nm及366nm紫外光照射下发荧光的物质含5%石膏含5%石膏及荧光物质经特殊纯化处理制备色谱用硅胶表示孔径的大小（10-1nm）（2）氧化铝氧化铝的吸附量大，适合于分离空间排列或官能团形式不同而极性又不太大的物质，以及具有不同数量碳原子和不同空间性质的芳烃。当物质分子中有C=C键存在时，它在氧化铝上的吸附作用要比在硅胶上的吸附作用高得多。按照它制备方法的不同常可分成碱性氧化铝、酸性氧化铝和中性氧化铝三种。碱性氧化铝的pH值约为9，它是取化学纯的氧化铝过筛，取150200目筛分。由于它本身带有微碱性，可用于分离合成染料、生物碱等。酸性氧化铝5，它是取工业氧化铝，加入2molHCl，搅拌，过滤，水洗，蒸馏水洗到pH值约为5，干燥，180下活化，适用于酸性物质的分离。中性氧化铝的pH值约为77.5，可将商品层析用的碱性氧化铝加入5%10%盐酸，室温浸泡1小时，用水洗到无氯离子，干燥，过筛，在180下活化而成。适用于醛、酮以及对酸、碱不稳定的酯和内酯等化合物的分离。氧化铝的定级定级方法如下，取0.02mL染料溶液（其中含30mg偶氮苯，对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、对氨基偶氮苯各20mg，溶于50mL四氯化碳中），点加在氧化铝薄层上，用四氯化碳作展开剂，比较其RF值，如表4-4所示定出氧化铝的活度级数。一般用的薄板活度为到级。表4-4氧化铝活度定级法偶氮染料按Brockmann和Schodder划分的活度级别偶氮苯对甲氧基偶氮苯苏丹黄苏丹红对氨基偶氮苯0.590.160.010.000.000.740.490.250.100.030.850.690.570.330.080.950.890.780.560.19注：表中所列数据为RF值（3）纤维素由于纤维素结构中有大量的亲水性基团如羧基等，故适用于亲水性物质的分离。纤维素的种类很多，除天然纤维素外，还有微晶纤维素，离子交换纤维素以及各种纤维素的衍生物如醋酸纤维素、羧甲基纤维素和二乙氨基乙基纤维素等。纤维素制板一般不需要粘合剂，只需取15%纤维素粉用电动搅拌器充分混匀后，脱泡，备用。2薄层板的制作目前已有不少商品预制板出售，除了载板为玻璃板外，还有用有机膜、铝箔、玻璃纤维纸的。为了使实验有良好的重复性，每批板的厚度最好能一致，铺成的薄层表面要光滑，无气泡。常用质量较好的窗玻璃板作为底板，其尺寸可视需要而定。在铺层之前先用洗液或洗涤剂浸泡，再用自来水、蒸馏水冲洗干净，必要时用乙醇擦净，以确保玻璃板表面没有油污。再用蒸馏水洗净后备用。常用薄层的厚度为0.15mm0.25mm。制备型色谱层厚常为2mm，厚度大的薄层，点加的样品量多，但其灵敏度较差，RF值的重现性也不好。把吸附剂涂铺在玻璃板（或其他材料）上形成厚度一致的薄层称为铺层，常用的方法有干法和湿法两种。（1）干法干法铺层比较简便，常用手工操作，随做随用。氧化铝、硅藻土都可用干法铺层。把吸附剂均匀地撒在玻璃板上，用两端有套圈的玻璃棒（要求表面光滑、粗细均匀）推移或滚动以使吸附剂均匀地平铺在玻璃板表面。铺层的厚度可用两端的套圈加以调节。干法铺层使两手的动作要协调，用力要均匀，移动或滚动的速度要一致，不能时快时慢，也不能中途停顿，见图4-2。图4-2手工铺层示意图1-玻璃棒两端套圈 2-光滑平直的玻璃棒 3-玻璃板 4-防止滑动的套圈 5-吸附剂用于干法铺层的吸附剂颗粒以150200目为好。由于干法铺层的吸附剂颗粒之间的空隙较大，因此展开速度较好，展开后斑点较易扩散。此外，喷显色剂时容易吹散，展开后不能保存。（2）湿法将吸附剂加入水或其他溶液（或溶剂）先调成糊状再行铺层。有些吸附剂中还要加入少量粘合剂，以增加薄层的牢固性。所以湿法铺层又可分为不含粘合剂和含粘合剂两种。该法制成的薄层比较牢固，易于保存，没有斑点扩散的缺点、分离效果一般优于干法铺层。铺层有手工及涂布器两种，前者简易可行，但要有一定的熟练技能，后者则根据不同厂商及型号，其方法也随之而异，它可以涂铺颗粒很细的吸附剂。手工铺层时，可取一定量的吸附剂，加入一定比例的水，在研钵中充分混匀，调成糊状，立刻倾倒在事先准备好的玻璃板上，进行铺层。加水量以调制成的糊状物的稠度适中为宜，太稠或太稀都不利铺层。薄层铺好后，水平放置，晾干，必要时在一定的温度下进行活化，然后储于干燥器中备用。从干燥器中取出后的薄板要立即点加样品进行分析。如暴露于空气中的时间较长，吸附水分后活度会降低。除某些吸附剂（如已含粘合剂的硅胶），在制作薄板时不需加入粘合剂外，纤维素中也不必加入粘合剂，就能制成较为牢固的薄层。硅藻土和氧化铝加或不加粘合剂都可铺层，但不加粘合剂的薄板在展开时应采取近水平式展开，以防止在展开过程中薄层塌落。加石膏为粘合剂制成的薄层能耐腐蚀性显色剂的作用，可是它存在着薄层不够牢固，不能用铅笔在上面做记号的缺点。用羧甲基纤维素钠（CMC）和淀粉为粘合剂铺成的薄板较牢固，可在其上用铅笔写字，但显色时不宜用腐蚀性很强的显色剂，对于鉴定某些有机物会有干扰。在分配色谱中，作为固定液的一般是吸附在吸附剂上的水分，色谱分离就是基于试样中各组分在展开剂和固定液之间的分配系数的不同。作为固定液的除了水分以外，还可以用其他各种物质，在需要将薄层涂渍非水的固定液进行分配色谱时，常把固定液溶在某一易挥发的有机溶剂中配成一定浓度的溶液，把薄板浸入，取出后在空气中放置。此时，溶剂挥发，固定液留在薄层上。此法制成的薄层不太牢固，吸附剂易从板面脱落，但固定液涂渍较均匀，操作也较简便。常用作固定液的有，甲酰胺15%25%丙酮溶液浸渍涂布，显色前在110时烘10min，以除去甲酰胺；丙二醇30%丙酮溶液浸渍涂布；聚乙二醇（平均分子量1000）硅藻土作支持体，水作溶剂调成薄糊状制板；正十一烷5%10%石油醚溶液浸渍涂布，显色前在115120烘45min，以除去正十一烷。二、展开剂及其选择要获得良好的分离，必须选择适当的展开剂，在吸附薄层上，展开剂的选择常遵循两个原则，展开剂对被分离组分有一定的溶解度和展开剂对被分离组分有适当的亲和力。在一般情况下，展开剂的极性比被分离物质的极性略小。展开剂的选择除考虑被分离组分的极性外，还应结合考虑吸附剂的活性，即展开剂、被分离组分的极性和吸附剂的活性这三者是相互关联相互制约的。三角形图解法可作为选择展开剂的初步参考。图4-3 吸附色谱中三要素与展开剂极性的关系如图4-3所示，图中有一圆盘，其上有三种刻度：（1）代表被分离物质的极性；（2）代表吸附剂的活度；（3）代表展开剂的极性。圆盘中心有一个可以转动的正三角形指针，如图中实线位置。A指向中等极性的被分离物质，B指向活度级的吸附剂，则此时展开剂就应该是中等极性的（C指向），如转到虚线位置，则非极性的被分离物质，活度为级的吸附剂，应选用非极性的展开剂。在实际工作中，展开剂的选择还必须进行进一步的探索，一般通过下列两种方法。（1）微量圆环法将欲分离的物质，按常规方法点在薄板上，两点相距23cm，再用毛细管吸取所试验的溶剂系统，垂直放于样点的中心，让溶剂自毛细管中依重力流出进行展开，干燥后显色，观察斑点的分离情况，见图4-4。被测物质为未知物时，常先用低极性溶剂（如图中己烷）展开，如试样留在原点不动，则需增加溶剂的极性或增大洗脱剂的量，如移动过快（如图中氯仿），则必须用较低极性的溶剂来调整。图示试验中染料1、2分别以苯及二氯甲烷展开，有较好的分离效果。（2）小型色谱法用普通的载玻片（2.57.5cm）制成薄板，把欲分离的物质点在薄板上，放于小型玻璃缸或广口瓶中展开，干燥后显色，观察斑点分离情况。这方法和实际操作比较相近，并可节约时间，选择较为满意的展开剂。这两种方法操作简便，时间短，需要溶剂量少，前者在同一块板上可以进行多种展开剂的试验，并易于比较，后者则灵敏度高。在实际工作中，常选用两种或多种混合的溶剂作展开剂，他们所得的分离效果较单一的溶剂为佳。当所分离物质的极性基团相同或类似，但非极性部分的大小及构型不同，或者所分离的各物质溶解度相差较大，或者所分离物质的极性太强不适于吸附薄层法时，可考虑分配薄层色谱法。这时，展开剂首先应考虑选择各组分溶解度相差大的溶剂，而在展开过程中，展开剂必须先用固定液饱和，否则在展开过程中，展开剂会把支持体上的固定液带走，使薄板分离效果变差。图4-4 两种染料用微量圆环法测定的图谱展开剂：A-己烷 B-四氯化碳 C-苯 D-二氯甲烷 E-氯仿三、实验技术一般薄层色谱的实验操作包括制备薄层板（或用预制板）、点样、展开、显色（视需要而定）、RF的测定和定量测定。1点样点样时，常把样品溶解在一种低沸点的有机溶剂中（如氯仿、丙酮、甲醇、乙醇等），然后用毛细管或微量点样管将试液点加到薄层板上。要求点液集中、点量精确、面积恒定。点样量要适当，一般点样量少些，则分离较清晰。但要注意到检测灵敏度。例如，试液的浓度在0.1%1%之间，点样的体积约在1L10L之间。此时样点的直径约23mm，两样点间距离约为1.5cm2cm。通常控制样点位于离薄层板底边1.5cm的起始线上，此时展开剂浸没薄层的底端约0.5cm。点样时，要轻轻地将点样管的末端接触薄层，让试样逐渐渗入薄层，样点的大小直接影响到最后斑点的面积，对于较稀的试液可在原点进行多次重复点加的方式。如果样品在圆点上过分浓缩，尤其在采用非极性溶剂，样品溶解度小时，展开时会使斑点拖尾。此时，需要在浓缩的圆点上加一滴极性较强的溶剂，上样品扩散在较大的表面上。或者把样品点成条状，条形点样法也适用于微量制备和制备薄层色谱法。2展开薄层色谱法的展开方式有很多，有上行法、下行法、径向展开法等等。（1）上行法最常用的展开法是上行法，就是使展开剂展开的方向由下向上爬行。通常可将薄板放在盛有适当展开剂的标本缸、大量筒或方形玻璃缸中。薄板的放置角度可以垂直，也可以斜放。对于不加粘合剂干法制成的薄层，常常采用近水平方向的放置法，见图4-5A。加粘合剂的硬板采用近垂直方向的放置法，见图4-5B。还有一种称为夹层装置（sandwich型）的层析缸参见图4-5C，它可大量节省展开剂的用量和展开时间。图4-5 上行式展开示意图（A）卧式 （B）立式 （C）夹层装置（S型）1-薄层板 2-浸有展开剂的滤纸 3-层析缸 4-展开剂 5-挥发的展开剂 6-玻璃块（2）下行法展开剂展开的方向由上而下。由于此时展开剂受重力作用，移动较快，所以展开时间比上行法快，该法可使用极性较弱的展开剂，经长时间的展开以提高分离的效果。（3）径向展开法可将吸附剂涂成圆形或扇形，在圆心部分加入展开剂，使薄层径向展开。所用薄板可以在中心部位开一小孔，展开剂由上面加入，也可以将展开剂用纸芯引到圆心部位。此外，还有多次展开法和梯度展开法等。除了不同的展开方式外，根据不同的需要，可将薄层设计为不同的形状，如刮成S形，以增加展开距离，使难分离的化合物得以分离，另外，还可以刮成三角形的，这样组分在三角形板上移动时，由于展开剂前沿由宽变窄，使组分分子与固定相分子碰撞的机会减少，分离后组分区带明显收缩，从而增加了单位面积区带的组分浓度，降低了检测下限，提高了检测灵敏度。，而且可以比传统的矩形板节约固定相，还可以进行三次不同方向、不同展开剂的展开，增加展开距离，改善分离效果。3显色展开后，如物质有色，可明显地在薄层上观察到他们的位置，如无色，则要通过一定的方法显色、定位，以便确定斑点的位置大小。对已知化合物的定位和显色比较容易，对未知物质就要先使它显色，然后根据RF值、显色情况推断，对照标样或采用其他手段来确证。显色前最好先将展开剂挥发除尽。常用的显色方法有：（1）蒸气显色利用一些物质的蒸气与样品作用而显色。如多数有机物质遇碘蒸气时，吸附碘或与碘发生加成反应，而呈现黄或黄棕色斑点。另外如浓氨水、液体溴等挥发性物质，都可放在密闭的容器中，将薄板放在其中显色。（2）喷雾显色将显色剂配成一定浓度的溶液，然后用喷雾的方法均匀喷洒在薄层上，使斑点显色，要求喷出的雾点细而均匀，喷雾器与薄层的距离最好在0.61m，这样可使喷出的液滴均匀，也可避免破坏薄层。（3）荧光显色有荧光反应的物质，可在紫外光下观察斑点处的荧光激发，在涂有荧光指示剂的薄层板上，也可在紫外光下观察斑点处荧光的猝灭。4定性分析一般将已知标准样品与未知试样点加在同一块薄层板上，在相同的色谱条件下进行展开，显色，然后根据所测得的RF值和斑点的情况加以鉴定、确证。但是在应用RF值作为定性指标时必须注意到能影响RF值重现性的各种因素，如：薄层板的性质和厚度、所涂敷吸附剂的活度、置于空气中时间的长短、展开的方式、展开槽的饱和度、边缘效应、点样量的大小、样品和展开剂中的杂质以及温度等等。为了最大限度地减少这些因素的影响，除了在同一块板上进行外，还可用下列方法来增加定性检测的可靠性。（1）采用相对RF值用与待测组分性质相近的已知化合物作相对标准，在同样的色谱条件下作两者的平行测定。求出两者RF值的比值作为鉴定的指标。（2）采用待测化合物的纯品作对照在两种或两种以上不同展开剂系统中展开，假如未知试样的RF值与已知标样的RF值都相同，那么就可以肯定两者为同一种物质。（3）采用衍生物的方法将未知组分与纯的已知标样分别制成同一类衍生物，如果两者本身和他们的衍生物所具有的RF值都相同，就可以肯定两者为同一种物质。（4）其他方法如将分离后的斑点用溶剂洗下来后。配以质谱法、红外光谱法或其他仪器分析法来进行定性鉴定。5定量分析薄层色谱的定量分析可分为洗脱法和直接定量法。（1）洗脱法用洗脱法来定量分析的薄层，采用的显色定位指示剂必须尽可能不影响下一步的测定。用对照法显色可不受显色剂堵塞干扰，对照法是在厚度均匀的薄层板上点三个样：一个是标样，两个待测试样。展开后，将标样的斑点和一个未知样品进行显色。根据标样和未知样品显色斑点的位置和形状，将未显色的未知样相应位置的吸附剂用针画出来，再把此斑点从薄板上连同吸附剂一起刮下，置入离心管中，用溶剂把样品从吸附剂上抽提出来。离心除去吸附剂后的溶液，再辅以适当的方法如分光光度法或其他定量方法来进行定量测定。（2）直接定量法直接定量法又可分为测面积法和仪器测量法测面积法：该法优点为设备简单，易于推广。它的原理是基于展开后薄层上斑点的面积和样品含量之间存在着一定的线性关系。（i），即样品含量与斑点面积成直线关系；（ii），即样品含量与斑点面积的平方根成直线关系；（iii），即样品含量的对数与斑点面积的平方根成直线关系；（iv），即样品含量的对数与斑点面积成直线关系；（v），即样品含量的对数与斑点面积的对数成直线关系。斑点面积的测量可以用测面积仪，也可以用透明纸将斑点的轮廓描下来后，复在坐标纸上根据小方格数来计算面积。影响本法测量准确性的主要因素是薄层的性质、点样时原点的大小、展开、显色时的条件等，另外RF值最好控制在0.290.75之间，此时测定结果的重现性较高，测定较准确。仪器测量法薄板上含有试样的色斑及不含试样的底板对光的透过及反射势必有所差别，仪器直接测量的方法就是基于这个原理。目前常用的薄层色谱扫描仪常具备以下优点：（i）双波长法，采用双波长测光方式时，如果取得信号差，可以进行基线的校正，从而使微量检测得以进行。（ii）锯齿形扫描方式，用微小的光束进行二维扫描，消除由于斑点形状不规则所引起的误差。（iii）能够用已知的程序把通过锯齿形扫描所得到的各个微小部分每个时刻的吸光度值转换成与浓度成比例的值再进行积分，因此总是可以得到与整个斑点的总量成比例的定量数据。（iv）能够自动地校正由于薄层板污染所产生的基线波动。测定薄层色谱的方法基本上常用反射法，因为该法可利用200800nm的波长，而如用透射法，则常因玻璃板及薄层吸收330nm以下的光而受限制，同时对薄层厚度的不均匀度比用反射法敏感。6高效薄层色谱在微量定量分析中，高效薄层色谱法（HPTLC）由于突出的低检测限，高灵敏度以及快速的检测而呈现出它的优越性。从表4-5可以看出普通薄层色谱法（TLC）和高效薄层色谱法（HPTLC）的不同之处。同TLC相比，HPTLC所用薄层板较小，样品点样量及点样体积小，每块薄层板上点样数目多，操作要求更为精细，条件更为严格，所以完全依靠手工操作有一定的难度，这就促使了薄层色谱向仪器化，包括点样、展开、定量等各项操作的仪器化发展，提高了该法的重现性和准确度。表4-5 TLC与HPTLC的比较项目TLCHPTLC吸附剂颗粒直径（m）理论塔板高度（HETP）（m）点样体积（nL）原点直径（mm）点样量（ng）每块薄层板点样数目薄层板高度（mm）展开距离：直线（mm）检出灵敏度；可见光（ng）紫外光（ng）荧光 （ng）10403010005000350500012（2020）0.25（制备型约为3）100200550.15712502001150032（1010）0.1500.50.50.01由于吸附剂颗粒小的特点，HPTLC的流动相展开速度慢、平衡易于达到，质量传递的阻滞作用往往可以忽略不计。这样，展开后斑点的大小主要由化合物扩散系数决定。化合物展开后只要不走在溶剂的前面，均呈小而圆整的斑点，有利于分离。另外，在小颗粒吸附剂的高效薄层上，分子扩散系数较小、展开距离短、RF值较大的化合物能得到较好的分离效果。高效薄层几乎都用商品预制板，常用的有硅胶、氧化铝、纤维素以及某些化学键合相制备的板，如-C2、-C8、-C18、-NH2等。反应性的基团键合在薄层上制成的化学键合相预制板也有用低挥发性的或低极性以及高极性试剂浸渍后作固定相的薄层板。四、薄层色谱的应用近年来，薄层色谱的发展相当迅速，应用日益广泛，在有机化工、生化制品、天然产物提取、临床检验以及环保分析等等方面都得到了较为广泛的应用。1试样分析薄层色谱作为一种分离手段，其最终目的常常是在分离后对试样中的各种组分进行鉴定或测定。例如，中药黄连中生物碱的分离和测定，黄连试样在索氏抽提器中用甲醇抽提，抽提液浓缩定容后，点样于高效硅胶预制薄层上，用乙酸乙酯-氯仿-甲醇-二乙胺（8：2：2：1）展开剂，作圆形径向展开，可将小檗碱、巴马亭、药根碱三种生物碱分开，他们的RF值分别为0.63、0.42、0.24。然后用366nm的紫外光扫描定量。又如，染料中间体-氨基蒽醌中主要成分-氨基蒽醌含量的测定，工业用-氨基蒽醌中除了主成分外，经常含有各种异构体，为了测定主成分的含量，将试样溶于吡啶中，点样于中性氧化铝铺成的软板薄层上，待吡啶挥发后，以丙酮-四氯化碳-乙醇（6：16：1）的混合溶剂为展开剂，近水平方向展开，刮取黄色的-氨基蒽醌斑，用乙醇为溶剂洗下主色斑，收集洗液，用440nm单色光，以光度法测定之。2产品质量控制及杂质检验过去，有机产品的质量一般常以熔点等物理常数作为鉴定的指标来进行控制。用薄层色谱分离法以及显色的灵敏度来控制杂质限量。则灵敏度更高，结果更为可靠，在一些国家药典中已采用这种方法。为此，取一定量试样，点样展开后，喷雾显色，除主斑点外，不得出现其他杂质斑，或者杂质斑的大小及颜色深度不得超过作对照用的标准斑。例如，四环素中差向四环素的含量应低于一定标准，因为后者毒性较大，溶四环素试样于甲醇中配成一定浓度的溶液，取一份点于硅藻土薄层上，用丙酮-氯仿-乙酸乙酯（3：1：1）的混合溶剂为展开剂，展开后，用浓氨水熏，然后在254nm的紫外光下观察，除了四环素主斑点外不得出现差向四环素的杂质斑。3反应终点的控制在化学反应进行一定时间后，取反应液作薄层色谱分析，借此可以了解还剩下多少原料未起作用，从而判断和控制反应终点。例如，弱酸嫩黄2G酯化反应终点的控制，弱酸嫩黄2G是一种酸性染料，它是由对氨基苯酚重氮化后与1-(4-磺酸苯基)-3-甲基-5-吡唑酮偶合，再经过对甲苯磺酰氯酯化而成。其中酯化反应完成得好坏直接影响产品的色光性能和牢度。酯化反应的终点可通过薄层色谱控制，在酯化反应过程中，取试样溶于丙酮和水（2：1）的混合溶剂中0.5%的溶液。点样与硅胶G薄层上，以丁醇-乙醇-氨水（相对密度为0.88）=2：1：0.7混合溶剂为展开剂进行色谱分离。在酯化反应刚开始时，展开后薄层上仅出现一个橙色斑，随着酯化反应的进行，橙色斑渐渐减退，出现黄色斑，并渐渐增大、变深，最后橙色斑完全消失，仅留下一个黄色斑，这表示酯化反应已经进行完全，反应终点已经到达。弱酸嫩黄2G的酯化反应另外为了对某些未知物进行剖析，以确定其结构，常常需用薄层色谱。以上讨论了薄层色谱对于各种有机物质的分离，对薄层色谱应用于各种无机离子的分离也有过不少的研究。例如，对于H2S组阳离子，可以在硅胶G薄层上，用丙酮-苯（3：1）混合溶剂100mL，以酒石酸饱和后，再加入6mL10%硝酸作为展开剂色谱分离后之，然后用硫化铵或酸性、碱性的双硫腙溶液作显色剂，得到各种组分RF值的次序：HgBiSbCdAsPbCuTl；再用比较色斑大小以进行半定量的方法可测定面粉中的砷、血液中的铊、小便中的汞、茶叶中的砷和镉。又如对于硫化铵组阳离子。可在硅胶G薄层上用丙酮-浓盐酸-己二酮（100：1：0.5）作展开剂，展开10cm后，以氨水熏。再以0.5%8-羟基喹啉的60%乙醇溶液喷雾显色，得到各组分的RF值的顺序：FeZnCoMnCrNiAl。此外，也可以用薄层分离制备纯品，把粗制品点在较厚、较大的制备型薄层板上分离杂质，可达到制备纯品的目的。4-3萃取色谱法萃取色谱法是在50年代后发展起来的一种无机分离分析技术。它是用有机萃取剂作固定相，涂渍于多孔、疏水、惰性的支持体（或称载体、担体）上，用合适的酸及相应盐的水溶液作流动相进行洗脱分离的、特殊的反相分配色谱。它的主要特点是液-液萃取分离的高选择性与色谱分离的高效能相结合，实际上它是实现了多级萃取分离的最简单最有效的方法。目前已被广泛应用于碱金属、碱土金属、稀有金属、镧系元素等等的分离和分析，以及复杂物质中某些微量及痕量组分的分离和富集。但萃取色谱法也存在一些缺点，即大多数萃取色谱固定相在支持体上的牢固程度欠佳，柱的稳定性较差，影响柱的寿命，也影响分离效果，如果制成萃淋树脂，这个缺点就可以克服。萃取色谱法按照操作方法的不同可分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱三种，其中以柱色谱的应用较为广泛。本节主要讨论这一种。一、萃取色谱的保留机制在萃取色谱分离过程中，金属元素在两相间的转移规律，即萃取色谱的保留机制，一般可分为离子交换和分配两种。在第一种机制中，固定相如液体阴离子交换剂，涂渍在支持体上其性质如同离子交换树脂。例如，在盐酸溶液中，氯化铀酰在以胺类萃取剂为固定相的萃取色谱分离，就是一个离子交换过程：在液体阴离子萃取体系中，各种金属离子分配系数随盐酸浓度的变化情况，与在强碱性阴离子交换树脂上的行为类似。又如一些难溶的有机磷酸，如二-(2-乙基己基)磷酸（HDEHP）的二聚体，对金属阳离子的萃取，具有阳离子交换的特性，因而称为液体阳离子交换剂，萃取反应可以表示如下：式中(HA)2代表HDEHP的二聚体。用实验测得这种萃取色谱法的分配系数和液液分配萃取法测得的相应结果非常一致。属于分配机制的有以磷酸三丁酯（TBP）等中性有机磷化合物为固定相的萃取色谱法。I.Akaza在研究TBP-HCl体系的萃取柱色谱分离金、铂和钯时，曾研究了溶剂萃取法和萃取柱色谱法测得的分配比和lgTBP、lgHCl之间的关系。其中对于铂的关系曲线如图4-6所示。可见溶剂萃取和萃取色谱法的关系曲线是十分相似的。图4-6 (a) TBP-HCl体系中Pt的分配比与HCl浓度关系实线：萃取柱色谱法；虚线：溶剂萃取法（b）TBP-HCl体系中Pt的分配比与TBP浓度关系实线：萃取柱色谱法；虚线：溶剂萃取法形成螯合物的萃取体系在分析化学中十分重要，但由于螯合物萃取的速率往往较慢，因此用螯合剂作固定相的萃取柱色谱分离过程中可能没有达到平衡，这样他们之间的关系就不如上述萃取体系明显。但I.Akaza曾以TTA-MIBK为固定相，聚三氟氯乙烯为支持体。pH=5.5的醋酸缓冲溶液为流动相，用萃取柱色谱法测定了钙离子的分配比与有机相中TTA浓度对数之间的关系曲线。这种关系曲线与液液分配萃取法所得的结果也是相似的。二、萃取色谱法的实验技术1支持体的选择萃取色谱法中的固定相是以液膜形式分散在支持体颗粒表面的，因此支持体必须对用作固定相的各类萃取剂具有良好的浸润性，以便可保留较多的固定相，浸渍在支持体上的固定相应有一定的牢固性与稳定性，不易流失在流动相中；支持体应该是化学惰性的，它既不能被固定相所溶解，或者产生明显的溶胀现象，又不能被流动相所侵蚀；支持体应该是具有较大表面积的多孔性物质，具有足够的机械强度，在装柱、萃取剂溶液浸泡以及色谱柱的再生等等过程中，不至于破碎；支持体还必须易于获得，使用简便。能完全满足以上要求的支持体还不多，但许多其他色谱方法所用的支持体基本上能满足上述要求。目前常用的支持体的种类很多，性能各异，大致可分为三类。第一类是无机物质，如硅胶、硅藻土、玻璃粉、氧化铝等。这些支持体表面常被羟基所覆盖，对水的润湿性较好，但不能被有机萃取剂所浸润，因此在使用前应进行硅烷化处理，使之疏水化。第二类是各种有机聚合物，如聚乙烯、聚氯乙烯、聚三氟氯乙烯、聚四氟乙烯、氯乙烯-乙酸乙酯共聚物、苯乙烯-二乙烯苯共聚物等。此外还有用泡沫橡胶、纤维粉等等的。萃取色谱对支持体粒度大小的要求，随被分离对象而定。对于一些比较容易分离的元素，可以选用粒度不太细小的支持体，如100160目（粒径0.1360.079mm）的粉粒是适宜的。若用过细的支持体，将使淋洗的流速减慢，延长分离所需的时间。对于少数难于分离的元素，则应选用粒度很细的支持体。例如，在高效萃取色谱分离中，通常选用的支持体粒度小于400目（粒径在30m以下），而且最好颗粒形状是呈圆球形的，这样可使色谱柱装得十分紧密而又均匀，有利于提高分离效率。筛选不同大小粒度的支持体，最简单的方法是用标准孔眼的网筛过筛。在制备高效萃取色谱柱时，为了选取粒度细而均匀的支持体，通常需用液体沉降分级法或逆流浮选法进行处理。无机吸附剂表面的硅烷化处理也是萃取色谱法中的一项技术，因为目前以商品出售的憎水性含硅无机支持体还很少，通常都需要在实验室里自行制备这类支持体。硅烷化处理无机吸附剂所用的有机硅化合物有：DMCS（dimethyl-dichlorosilane，二甲基二氯硅烷）和TMCS（trimethyl-chlorosilane，三甲基