哺乳动物组织基因组DNA提取.doc

本科学生实验报告姓名 陈明辉 学院 生命科学学院 专业 生物科学 班级08级A班 实验课程名称 分子生物学 指导教师及职称 倪娟老师 开课时间 2010至2011学年下学期云南师范大学教务处编印实验名称：哺乳动物组织基因组DNA提取Genomic DNA Extraction from Mammal Tissue实验时间：2011-5-24小组合作： 是 否一、实验预习1、 实验目的： (1) 掌握动物基因组DNA提取的操作方法; (2) 掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。 Experimental Purpose：After the experiment is finished, students should be able to extract genomic DNA from mammal tissue, and to run an agarose gel. 2、 实验设备及材料： Reagents and apparatus（1）Instruments： High speed refrigerated centrifuge（高速冷冻离心机）、 Glass homogenizer（玻璃匀浆器）、 Electrophoresis System（电泳系统）、 Ultraviolet transilluminator（紫外透射仪）、Ultra cold storage freezer（超低温冰箱）、Autoclave（高压灭菌锅）、 Pipettes（微量加样器）、Electronic balance（电子天平）、Acidometer（酸度计）（2）Material： Liver of rabbite（3）Reagents： Tris、SDS、EDTA、 HCl、 NaOH 、 Sodium acetate (NaAc)、 Acetic acid (HAc)、Phenol、Chloroform、Ethanol、Isoamylol、TE buffer 、Protease K、RNase A、Agarose、DNA molecular weight markers 、Boric acid、Sugar、Bromophenol blue、Fluorescent dye (Gelview)3、 实验原理及实验流程或装置示意图： 实验原理： （1）本实验利用去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠)是为了使蛋白变性并溶解细胞膜中的脂质从而导致细胞裂解，而细胞裂解物又常用蛋白酶K进行水解处理。 （2）随后用酚:氯仿进行抽提，以去除残留的蛋白质，这时蛋白质将进入有机相，或者假如己变性的话将呈现在有机相与水相之间。乙醇沉淀处理则可以浓缩DNA，同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。 （3）为了进一步保护DNA样品的完整性，通常需要在缓冲液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，这样将会减少脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因为该酶必须在有Mg2+存在时才会起作用。 Experimental Principle: （1）The detergents SDS ( sodium dodecyl sulfate) is added to denature proteins and solubilize lipids in membranes leading to cell lysis . The cell lysate is often treated with enzymes that hydrolyze RNA and proteins. （2）Then they are treated with phenol and chloroform to remove the remaining proteins, which will either enter the organic phase or, if they had denatured, appear at the interphase. Alcohol help to concentrate the DNA while removing nucleotides, amino acids, oligonucleotides and peptides. （3）We can add the eathylene diamine tetraacetic acid (EDTA) to keep the integrity of DNA. EDTA can chelate Mg2+ and reduce deoxyribonuclease (DNase) activity, because these enzymes require Mg2+ to work. 本实验方法分离得到的染色体DNA长度为100-150kb，适用于构建基因组文库和Southern杂交分析。如果要求得到较大分子量的DNA，则必须省略其中的振荡步骤。 试验流程1、冰浴处理生理盐水 酶解液 配制工作液 称取0.2g肝脏（冰冷的生理盐 玻璃匀浆器 组织匀浆液 水清洗（3次） 剪碎 （2ml匀浆液）玻璃匀浆器匀浆 移至1.5ml离心管 离心（45000rmin3060s ） 弃上清加400ul无菌水 吹散加400ul酶解液 水浴处理（55、1218h） 2、 酶解样品（加入20ul的RNase） 待抽提的样品（等量分装在两支离心管内加入等体积提取液(翻转混匀)） 配制TE缓冲液 抽提静置 离心（410000rmin10min） 移出水相 至离心管抽提静置（等体积提取液500ul） 410000rmin离心10min 移出水相 加1/10 NaAc 加2倍无水乙醇（-201-2h） 融化、12000rmin离心15min 离心 弃上清液 加入75%冷乙醇洗涤 12000rmin离心15min离心 弃上清液 干燥 加TE50ul混匀 DNA(4 存放) 3、(1)制备 0.3 琼脂糖凝胶。称取 0.06 g 琼脂糖，放人锥形瓶中，加入 20 mL的 0.5TBE 缓冲液，放入微波炉加热至完全溶化，则为 0.3 琼脂糖凝胶液。（由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足）； (2)制胶器的安装； (3)将熔化的琼脂糖凝胶液转入Gelview专用的三角瓶中，然后加入Gelview 2l； (4)将冷到60左右，缓缓倒入制胶器(注意不要形成气泡)； (5)待胶凝固后（80min），轻轻拔掉梳子，将凝胶盘从制胶槽中取出，放入电泳槽内； (6)加入电泳缓冲液(0.5)至电泳槽中。4、通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图片。并将产物条带与已知分子量的标淮条带进行比较，便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定。 4、实验方法步骤及注意事项： 核酸的分离纯化、测定及研究方法 （1）分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。 1）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则： 保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。 2）核酸的纯度要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 3）核酸分离纯化的注意事项 为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意： 尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏； 减少化学物质对核酸的降解，为避免过酸、过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH410条件下进行； 防止核酸的生物降解。细胞内或外来的各种核酸酶水解核酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。其中DNA酶需要金属二价阳离子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等基本上可以抑制DNA酶的活性。RNA酶不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素； 减少物理因素对核酸的降解，物理降解因素主要是机械剪切力，其次是高温。 高温：如长时间煮沸，除水沸腾带来的剪切力外，高温本身对核酸分子中的某些化合键也有破坏作用。核酸提取过程中常规操作温度为04以降低核酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。 机械剪切力：包括强力高速的溶液振荡、搅拌，细胞突然置于低渗液中；细胞爆炸式地破裂及DNA样品的反复冻融等。这些操作细节在实验操作中应加倍注意。机械剪切作用的主要危害对象是大分子量的线性DNA分子，如真核细胞的染色体DNA等。 （2）核酸分离纯化的一般步骤 1）破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质纯化干燥溶解。 2）核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。 试验方法步骤 （1）储备液的制备 5 molL NaCl，1 molL Tris HCl pH8.0，0.5 molL EDTA pH8.0，dddH2O，3 molL NaAc pH5.2，生理盐水（0.85 NaCl），10SDS，5TBE，6凝胶加样缓冲液，10mgmL蛋白酶K -20保存，10mgmL无DNA酶的RNA酶 -20保存 （2）破碎、酶解细胞（过夜） （3）抽提DNA 、乙醇沉淀纯化DNA （4）琼脂糖凝胶电泳检测DNA （5）5TBE（电泳缓冲液100mL5.4gTris，2.75g硼酸， 2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)加蒸馏水到100mlpH8.0；0.25溴酚蓝：取60ml三蒸水，将250mg溴酚蓝溶解于其中40(WV)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖。实验现象、数据及观察结果实验现象（1） 随着电泳的开始，电泳槽内，出现水瀑布现象；（2） 随着瀑布的形成，点样孔里面材料也慢慢在电极的作用下渗入到琼脂糖凝胶里面；（3） 电泳后，在紫外灯下可以看到呈现出淡黄色的荧光物质；（4） 酚抽提除去蛋白质时，试液分层：上层为水相，下层为酚相。2、 对实验现象、数据及观察结果的分析与讨论： 实验结果如图： (1) 实验结果中，有的条带是边缘较整齐，亮度明显，颜色较清晰的呈现长方形状，这是DNA提取较好的；而有的条带则是毛边状边缘，呈现不规则状 ，说明DNA提取的纯度不高; (2) 由图可见，对于实验结果即使是同一个组的产物的纯度都会有所不同。3、 结论： （1）本次实验属于综合性实验，他需要我们在实验过程中明白所加入试剂的作用，进而加入的量要控制好，各小组组员在剂量的添加时，互相合作就显得非常重要了； （2）分子生物学实验最大的问题之一就是操作过程中实验现象不明显，直到最后电泳结束在紫外灯下才能看到，所以在前面操作时要特别小心每一个操作包括加的量，以及摇动的幅度等； （3）其实实验时对相关的器材操作的熟练也是一个非常重要的过程，例如移液枪的操作、离心机的操作等； （4）本次实验是对上面几次实验空白的补充，例如实验一、二中我们组没有做过琼脂凝胶，这次实验就可以进行相应的操作。3、 实验小结本次实验成败之处及其原因分析、改进措施： （1）本次实验的最后结果观察是整个大组一起进行的，所以紫外透射仪检测时，大家可以看到每个组的实验结果，进而通过对比交流明白自己在哪个步骤出问题和做得好； 提取结果不佳的原因： （1）实验材料的不新鲜即肝脏已经不新鲜了以及清洗不够； （2）匀浆不充分，使得组织液没有充分均匀分散，有DNA团块形成； （3）最大的问题还是不纯，含有蛋白质等杂质，可能是在酚抽提除去蛋白质是不慎将蛋白质混进水相； （4）再加入提取液时，进行了大幅度震荡； （5）再加入1/10 NaAc时计算失误。 改进措施： 在操作过程中要小组之间进行交流