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基于PCR的cDNA基因克隆技术研究进展 作者： 日期：基于PCR的cDNA基因克隆技术研究进展 蔡欣1 陈宏2, 3 汪虹英4(1.西北农林科技大学生命科学院，陕西省农业分子生物学重点实验室, 杨凌 712100; 2. 西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室, 杨凌 712100; 3. 徐州师范大学生物技术研究所, 徐州221116; 4. 甘肃省漳县一中, 甘肃漳县 748300)摘要 RT-PCR、single-sided(anchored) PCR、RACE以及step out RACE、DDRT-PCR、cDNA RDA、SSH等都是建立在PCR基础之上的cDNA分子克隆技术，本文介绍各种技术的优缺点、应用以及与同类技术进行比较，这些技术现在已经成功应用于大量EST的分离、cDNA文库的构建、编码产物未知的差别表达基因的分离以及全长cDNA基因序列的克隆等方面。关键词cDNA基因克隆; PCR; 特点；应用中图分类号:Q7Research Progress on PCR-based Techniques of cDNA Gene CloningCAI Xin1 CHEN Hong2, 3 WANG Hong-ying4(1College of Life Science, Northwest Sci-tech University of Agriculture and Forestry, Shaanxi Key Laboratory of Agriculture Molecular Biology, Yangling, Shaanxi 712100 China; 2 College of Animal Science and Technology, Northwest Sci-tech University of Agriculture and Forestry, Shaanxi Key Laboratory of Agriculture Molecular Biology, Yangling, Shaanxi 712100,China; 3. Institute of Biotechnology, Xuzhou Normal University, Xuzhou, Jiangsu 221116,China; 4 the First Middle School of Zhangxian County, Zhangxian, Gansu 748300,China)Abstract: RT-PCR, single-sided(anchored) PCR, RACE, step out RACE, DDRT-PCR, cDNA RDA and SSH are all the techniques of cDNA cloning based on PCR. The advantages and disadvantages of each technique were dicussed and compared with those of their counterparts. These techniques are now successfully used in the fields of isolation of numerous ESTs, construction of cDNA libraries, obtaining of differentially expressed new genes and cloning of cDNA in full length.Keywords: cDNA gene cloning; PCR; characteristics; applications Kary Mullis等在1983年发明的PCR技术1现在已经成为分子生物学及其相关领域的经典实验方法，目前由PCR技术衍生出许多重要的相关技术，它们在基因克隆、基因测序、基因检测、基因改造以及突变分析等分子生物学以及其它生命科学研究中具有重要的应用价值；目前有许多cDNA基因克隆方法主要是建立于PCR及其衍生技术之上的，原有技术被不断改进、新的技术被不断发明，它们在cDNA文库的构建、EST的分离、cDNA基因克隆、新基因的分离、基因表达的检测分析等研究领域发挥着重要的作用。1 RT-PCR当我们期望从某一序列已知的mRNA克隆cDNA时，就可以利用RT-PCR(reverse transcription PCR)，即逆转录PCR方法,其原理是由mRNA通过逆转录反应产生的DNA链作为模板进行常规PCR扩增2。由于RT-PCR的放大作用和很高的敏感性，所以具有显著的优点：首先，该方法不需要纯化mRNA，总RNA就可以作为合成单链cDNA的模板，因而避免了纯化过程中mRNA的降解以及丢失；其次，该方法中单链cDNA合成后其3末端要进行同聚物加尾，不会丢失末端的最后几个核苷酸，所以可以获得相当于mRNA 5末端的比较完整的序列，其中也包含着未知序列的cDNA群体3。RT-PCR还可以用于检测mRNA分子，PCR测序以及探针的制备等。项目基金 国家863项目(2001AA243052，2003AA243051),国家自然科学基金（30471238），中华农业科教基金（99-03-A-5）资助 作者简介: 蔡 欣(1973)，男，甘肃漳县人, 博士生，专业：生物化学与分子生物学通讯作者: 陈 宏(1955)，男，陕西长安人, 博士生导师，教授，研究方向：生物技术与动物分子遗传学2 single-sided(anchored) PCR利用RT-PCR方法进行cDNA基因克隆时，首先需要有mRNA或cDNA的全长序列资料，以便根据其设计合适的引物，然后才能进行目的mRNA或cDNA全长序列的扩增；而在实际工作中，我们往往获得到的是mRNA或cDNA的部分序列，如欲获取其全长序列信息，可以选择采用single-sided(anchored) PCR, 即单侧(锚式) PCR。基本原理是根据已知的mRNA或cDNA部分序列设计基因特异性引物(gene-specific primer, GSP), 同时利用寡聚胸腺嘧啶核苷酸oligo (dT)作锚定引物，进行已知序列上游序列或者下游序列的PCR扩增4。本方法适合于根据已知cDNA部分序列来扩增cDNA全长序列，在进行PCR扩增时除了设计的基因特异性引物(GSP)之外，还需要一条锚定引物oligo (dT)20，如果与待扩增的cDNA相应的mRNA不具有Poly(A)尾，此方法就不适用。理论上讲，锚式PCR只需要一条基因特异性引物(GSP)，但是在实际工作中为了提高扩增的特异性，常常需要设计第二条特异性引物进行第二轮PCR扩增，第二条特异性引物可以与第一条引物相邻或者部分重叠。3 RACERACE(rapid amplification of cDNA ends)，即cDNA末端的快速扩增，也是一种根据已知部分cDNA序列扩增未知序列的PCR技术, 其基本原理是：首先根据已知的cDNA部分序列设计GSP, 以mRNA为模板逆转录合成单链cDNA，再通过常规PCR扩增出从已知核苷酸序列内某一特定位点到3末端或者5末端之间的未知核苷酸序列，所以又可以分为3RACE和5RACE 5。 3RACE可以利用mRNA的Poly(A)尾设计锚定引物；但是进行5RACE时，先要将合成的第一条cDNA链3末端加上同聚物尾，再根据其设计锚定引物。4 step out RACE常规的RACE存在着步骤繁多、费时和特异性比较低等缺点。后来Matz6及其合作者在RACE方法的基础上，根据PCR抑制作用(PCR-suppression effect, PS-effect) 7和cDNA合成过程中存在的模板转辙作用(template-switching effect, TS-effect)8, 同时采用了touchdown PCR技术9，将5RACE和3RACE方法进行了改进，显著提高了灵敏度和扩增的效率，降低了扩增背景，将这种cDNA末端的快速扩增技术称为step out RACE，翻译为“越轨”RACE。此技术利用鼠白血病病毒莫勒尼株(Moloney murine leukemia virus，MMLV)逆转录酶在cDNA新链的合成到达mRNA模板的5末端时能够将若干个非模板的核苷酸(主要为dC)聚合到新合成cDNA链的3末端的特性，实现模板转辙作用；PCR扩增过程中过加入一对大小不同的SO-PCR(越轨PCR)引物，小引物与大引物的5端部分序列重叠，而大引物的3端序列与TS-oligo(模板转辙-寡聚核苷酸)的大部分序列重叠，则经过一轮PCR反应形成的DNA双链分子的各条单链都形成“锅柄”样(panhandle-like)结构而不能进行后续PCR扩增，进而实现PCR抑制作用。他们利用此项技术对人胎盘中的13种mRNA进行了检测，其中丰度最低的相应于干扰素受体和白细胞介素10的cDNA 5和3末端都被成功扩增。虽然step out RACE技术与同类的RACE技术5相比较具有操作简便、高效和灵敏的特点，但是它还是解决不了由于RT反应造成的RACE技术普遍存在的问题，如mRNA很长或者形成稳定的二级结构而致使合成的cDNA完整性降低等。邱为民等人10根据已知的EST序列设计引物，通过step out RACE技术成功地克隆出了三个人类精子发生相关基因的全长cDNA序列。5 DD-PCR或DDRT-PCR生物的发育、细胞的分化、细胞的周期变化、生物体对外界环境压力的反应以及细胞的凋亡和个体的衰老等所有的生命过程都可以归结于基因的差别表达，因此比较不同细胞或者不同基因型在基因表达上的差异，即mRNA 种类的差别为我们深入了解生命过程的本质打开了方便之门11。虽然应用传统的mRNA差减杂交和扣除杂交技术也分离到了一些重要的基因, 但是这两种方法存在费时费事、重复性差、难以适应成批样品的检测研究等。在PCR技术发展的基础上，1992年美国波士顿Dena-Farber癌症研究所的两位科学家Liang和Pardee12发明了DD-PCR(differential display mRNA by PCR)或DDRT-PCR(differential display reverse transcription PCR)技术，即mRNA差别显示PCR或者差别显示反转录PCR技术，在一定程度上克服了差减杂交和扣除杂交技术的不足之处。虽然该技术克服了差减杂交和扣除杂交技术的缺点，但是仍然存在着工作量大、成本高、假阳性率高、重复性差以及分离的cDNA片段比较短小等不足之处。6 cDNA RDA为了克服mRNA差别显示技术在实际应用中存在的不足之处，1994年, Hubank和Schatz13在Lisitsyn14等人发明的基因组代表性差示分析(representational difference analysis, RDA)技术基础上，发展了一种称为cDNA代表性差示分析技术, 简称cDNA RDA。此方法保留了差减杂交和DD-PCR的精华，同时充分发挥了PCR反应以指数形式扩增双链模板、以线性形式扩增单链模板这一特性，并通过降低cDNA群体复杂性和多次更换cDNA两端接头等方法，特异地扩增目的基因片段, 与DD-PCR相比具有假阳性低、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。Hubank等人通过此项技术成功地从小鼠成纤维细胞系TXH8中分离到了两个重组激活基因(recombination activation gene)RAG-1和RAG-2的编码序列，同时还从一个经咖啡因诱导的小鼠前B细胞系1-8中克隆到了胰岛素样生长因子1B(insulin like growth factor, IGF-1B)基因和与天然杀伤细胞抗原(natural killer cell antigen)基因NKR-P1类似的编码序列。但是令人遗憾的是，cDNA RDA技术美中不足，也存在着操作复杂、实验周期长以及费用高等缺点，为此刁丰秋15等人对此技术作了若干重要的改进，使实验程序大大简化。改进后的cDNA RDA技术可以用于高等动植物与发育相关以及其它差别表达的未知基因编码序列的克隆。7 SSHSSH(suppression substractive hybridization), 即抑制性消减杂交技术，是由Diatchenko16等人在PCR抑制作用7的基础上所创建的，是继DD-PCR和cDNA RDA技术之后又一新的表型克隆技术。减数cDNA杂交技术1719及其改进的技术是分离和鉴定差别表达基因的cDNA序列的强有力的工具，曾成功地应用于许多重要基因的鉴定，例如T-细胞受体基因20鉴定，但是对于低丰度表达的基因却无能为力，这些技术需要Poly(A) RNA的量为20g以上，还具有操作繁杂，实验周期长以及费用昂贵等不足之处；cDNA代表性差示分析技术(cDNA RDA)中虽然不需要分离单链cDNA(ss cDNA)和双链cDNA(ds cDNA)，并且被成功地应用于差别表达cDNA的克隆，但是由于各种mRNA的丰度存在着广泛的差异，所以在技术环节中仍然避免不了多重减数杂交；mRNA差别显示PCR技术(DD-PCR)和随机引物RNA指纹分析技术21尽管能够快速鉴定差别表达的基因，然而这两种方法都假阳性率高22,23，对于高丰度的mRNA分析效果好24，并且不适合于分析差别表达数目比较少的基因22。与上述技术相比，SSH具有突出的优点。首先，SSH通过两轮减数杂交和PCR特异性扩增，假阳性率被大大降低，提高了真阳性率)；其次，SSH利用了杂交二级动力学的原理，使低丰度差异表达mRNA目的序列得到了均等化和富集，降低了背景，提高了灵敏度；最后，SSH技术环节中不需要分离单链cDNA或者双链cDNA成分，只需要经过一轮减数杂交就可以使低丰度差别表达的基因序列富集1,000多倍，分离高、低丰度表达的基因都具有很高的效率，而且操作简便。SSH技术适用于分离和鉴定与疾病、发育、组织特异性等相关的差别表达基因。von Stein等人25利用SSH技术通过转移性肺癌细胞系Bps73-ASML与非转移性肺癌细胞系Bps73-AS之间的减数杂交成功地分离到了625个差别表达的cDNA序列，其中92个与已知基因序列具有100 %或者近乎100%的相似性，281个与人类或者小鼠已知基因的相似性在60%95 %之间，其余252个在GeneBank中没有同源序列。利用SSH技术，北京大学人类疾病基因研究中心在人前单核细胞U937细胞中分离出1种新型细胞因子，命名为趋化素样因子(chemokine-like factor 1,CKLF1) 26。在此基础上，进一步运用生物信息学的方法，发现与CKLF有同源性的其它8个新基因，分别命名为趋化素样因子超家族成员1-8(chemokine-like factor super family member 1-8，CKLFSF1-8)。徐德全等人27通过SSH技术成功构建了梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向减数cDNA文库，特异于两种肌肉组织的差异表达基因的富集效率分别为210和25倍，从中分别筛选到了709和673个阳性克隆，插入片段的长度主要分布于150bp750 bp之间。8 结束语cDNA基因文库的构建或基因的克隆中，应该根据实验的具体要求，考虑各种技术的优点以及局限性,选择相应的一种或者几种克隆方案。RT-PCR虽然操作简单，但是我们首先必须已知待扩增序列或者其同源序列以便设计引物，而且由于种种原因所获得到的往往是部分序列；而单侧(锚式) PCR 、RACE及其改进技术step out RACE可以弥补RT-PCR技术的不足，根据已获得的cDNA部分序列能够有效扩增其上下游序列，经过拼接可以获得cDNA全长基因序列。主要建立于差减杂交技术之上的DDRT-PCR、cDNA RDA 和SSH都充分利用了PCR反应以指数形式扩增双链模板、以线性形式扩增单链模板这一特性，它们在差别表达新基因的分离、鉴定以及减数cDNA文库的构建等方面具有广阔的应用前景。step out RACE对RACE作出了重大的改进，SSH相对DDRT-PCR和cDNA RDA具有明显的优点，但是任何技术都不是十全十美的，step out RACE和SSH也具有局限性，然而当今分子生物学技术的发展日新月异，现有的各种cDNA基因克隆技术一定会得到改进，而且还会不断涌现出许多分子克隆的新技术。参考文献1 Mullis K B, and Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reactionJ. Meth. Enzymol,1987,155:335-350.2 Weaver R F, Molecular Biology(影印版) M. 北京:科学出版社, 2000, P80.3 梁国栋主编. 最新分子生物学实验技术M. 北京:科学出版社, 2001, P32.4 Berchtold M W A. Simple method for direct cloning and sequencing cDNA by the use of a single specific oligonucleotide and oligo(dT) in a polymerase chain reaction(PCR)J. Nucleic Acids Res,1989, 17: 453. 5 Frohman M A, Dush M K and Martin G R. Rapid production of full length cDNAs from rare transcripts: Amplification using a single gene-specific oligonucleotide primerJ. Proc. Natl. Acad. Sci,USA,1988,85(23): 8998-9002.6 Matz M, Shagin D, Bogdanova E, Britanova O, Lukyanov S, Diatchenko L and Chenchik A. Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCRJ. Nucleic Acids Res,1999,27(6): 1558-1560.7 Siebert P D, Chenchik A, Kellog D E, Lukyanov K A. and Lukyanov S A. An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNAJ. Nucleic Acids Res,1995,23: 1087-1088.8 Chenchik A, Zhu YY, Diatchenko L, Li R, Hill J and Siebert PD. In Siebert P and Larrick J(eds). Gene cloning and Analysis by RT-PCRM. BioTechniques Books, Natrick, MA. 1998, 305-319.9 Don R H, Cox P T, Wainwright BJ, Baker K and Mattick JS. Touchdown PCR to circumvent spurious priming during gene amplificationJ. Nucleic Acids Res,1991,19(14): 4008. 10 邱为民, 张思仲, 武辉, 张戈, 肖翠英. 一种新的cDNA末端快速扩增获取全长cDNA的方法J. 遗传,2001,23(5): 480-48211 吴乃虎主编. 基因工程原理(第二版，上册) M. 北京: 科学出版社, 2001,P359.12 Liang P, Pardee A D. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reactionJ. Science, 1992, 257(5072):967-971.13 Hubank M, Schatz D G. Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNAJ. Nucleic Acids Res, 1994,22(25):5640-5648.14 Lisitsyn N, Wigler M. Cloning the differences between two complex genomesJ. Science, 1993, 259(5079): 946-951.15 刁丰秋，吴乃虎. 高等植物转录因子与发育调控. 走向21世纪的植物分子生物学, 林忠平主编M. 北京:科学出版社, 2000,208-233.16 Diachenko L, Lan Y F, Campbell A P, Chenchik K, Moqadam F, Huang B, Lukyanov K, Gurskaya N, Sverdlov E D, Siebert P D. Suppression subtractive Hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and librariesJ. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(12): 6025-6030.17 Britten, R L & Davidson, E H. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, edsM. Hames B D & Higgins S J(IRL, Oxford), 3-15. 18 Duguin J L & Dinauer M C. Library substraction of in vitro cDNA libraries to identify differentially expressed genes in scrapie infectionJ. Nucleic Acid Res,1990,18:2789-2792.19 Hara E, Kato T, Nakada S, Sekiya L & Oda K. Subtractive cDNA cloning using Oligo(dT)30-latex and PCR: isolation of cDNA clones specific to undifferentiated human embryonic carcinoma cellsJ. Nucleic Acid Res,1991,19:7097-7104. 20 Hendrick S M, Cohen D L, Neilsen E L & Davis M M. Isolation of cDNA clones encoding T-cell specific membrane-associated proteinsJ. Nature(London),1984,308:149-153.21 Welsh J, Chada K, Da