基因工程重点总结.doc

第1章 绪 论1、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。4、基因工程的基本操作程序（P7）（1）.从供体生物的基因组中分离获取带目的基因的DNA片段（2）限制性核酸内切酶将含有外源DNA和载体分子切开(3)DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段连接到载体分子上，形成DNA重组分子(4)将重组DNA分子引入到受体细胞（5)带有重组体的细胞培养拓增，获得大量的细胞繁殖群体 （6）筛选和坚定转化细胞，获得使外源基因高效稳定表达的记忆工程菌或细胞(7）将选出的细胞克隆的目的基因进一步演剧分析，并设法使之实现功能蛋白的表达第二章 基因工程的工具酶一、限制性核酸内切酶P15：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶hsd R：编码限制性核酸内切酶hsd M：编码限制性甲基化酶hsd S：表达产物协助酶识别特殊的作用位点。1、 粘性末端的意义P连接便利 i）不同的DNA双链只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。 5末端标记凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。 补平成平齐末端粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。2、同裂酶：是不同来源分离出来的不同酶，但具有相同的识别顺序，切割DNA的方式可以相同，也可不同。如XmaI和SmaI3、同尾酶：它们是不同的酶，但切割后可产生相同的粘性末端，因此同尾酶的切割片断之间可以相互连接，这种酶在分子生物学中有较大的价值。4、远距离裂解酶：这类酶的识别位点与切割位点不一致，它们在某一核苷酸区域与识别顺序结合，然后滑行到识别顺序以外的另一个位点进行切割。5、可变酶：这类酶是II型酶中的一个特例，它们的识别顺序中的1个或几个核苷酸是可变的，并且其识别顺序般大于6个碱基对。6、II 型限制性核酸内切酶酶解注意事项浓缩的酶应该用缓冲溶液稀释，稀释后应尽快用完；保存在50%甘油中，-20度条件下； 酶切反应的时候，最后加酶；酶从冰箱中取出后应该放置于冰上或者冰盒上；酶应该分成小份，避免反复冻融；取酶要用新的灭菌的吸头，避免污染；加酶的体积不要超过反应体系的1/10。7、 影响限制性核酸内切酶活性的因素DNA样品的纯度蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等解决方法：加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶加大反应总体积，延长反应时间。 DNA甲基化程度 反应条件高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即Star activity现象。EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%，可切割5PuPuATPyPy3酶的纯度酶切反应的温度和时间大多数的内切酶，最适反应温度为37度，但也有例外，如Sma I 为25度。酶解时间可以通过加大酶量而缩短。8、限制性内切酶的命名 二、DNA连接酶1. 两种DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶需要 NAD作物辅助因子只能连接粘性末端。（2） T4噬菌体DNA连接酶以ATP作为辅助因子；不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端；RNA:DNA杂交分子中RNA上的缺口。2. T4噬菌体RNA连接酶以ATP作为辅助因子；催化单链DNA或RNA的5-p与3-OH共价链接（1）连接条件1 必须是两条双链DNA。2 DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。3 需要能量动物或噬菌体中：ATP ；大肠杆菌中：NAD+4 只能连接相邻核苷酸之间的缺口3. 影响连接反应的因素 (1)DNA末端的浓度(2)反应温度（3）ATP浓度三、常用的DNA聚合酶的特点1. 共同特点把dNTPs连续地加到引物的3OH端。2. 主要区别持续合成能力和外切酶活性不同3. DNA聚合酶在基因工程中的用途（1） 大肠杆菌DNA聚合酶I基本性质：53的DNA聚合酶活性;53的核酸外切酶活性；35的核酸外切酶活性。基本用途缺口前移标记法：Nick translation （切口平移）；制备P标记的探针。（2） Klenow fragmentKlenow fragment的性质具有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。基本用途v 3端补平补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。v DNA 3末端标记在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。v 在cDNA克隆中，用于cDNA第二链的合成。v 双脱氧末端终止法测定DNA序列（3） T4 DNA聚合酶基本特性：a.具有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性。b.在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切c.在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止d.在有四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。基本用途a.补平隐蔽末端； b.DNA 3末端标记 标记a. 放射性标记b. 非放射性标记i）生物素标记： 生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R 可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。 生物素的识别亲和素：能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：抗生物素蛋白（avidin）：是一种鸡卵清蛋白链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：细菌中avidin的类似物ii）地高辛标记：可以与dNTP连接成地高辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。地高辛的结合物是抗地高辛抗体。iii）偶联酶及其底物常用的两种酶：辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRPO） 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, AP）酶的作用：催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。iv）用非放射性标记的探针检测原理探针DNA用生物素或地高辛标记，亲和素或地高辛抗体与酶偶联，酶催化一个发光或显色反应，亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。核酸探针杂交筛选法的缺点是：只检测是否有外源DNA插入，而不论该DNA是否表达出产物。（4） T7 DNA聚合酶从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成： T7基因5编码的大亚基：有53的DNA聚合酶和35的核酸外切酶活性 大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白， 增加大亚基对模板的亲和性T7 DNA聚合酶的特点：u 持续合成能力强：一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。u 35外切酶活性高：单链和双链都能降解。u 不受DNA二级结构的影响T7 DNA聚合酶的用途 以大分子量DNA为模板的合成：如M13 进行末端标记：与T4 DNA聚合酶相同 补平隐蔽末端：合成补平3隐蔽末端； 水 解修平3突出末端。（5） 修饰后的T7 DNA聚合酶 T7DNA聚合酶的化学修饰 去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚 合速率提高了3倍。修饰后的T7 DNA聚合酶的用途l Sanger双脱氧链终止法对长片段DNA进行测 序的理想用酶 l 标记DNA 3隐蔽末端l 更有效地补平末端（6） Taq-DNA聚合酶 具有耐95左右高温达30min以上的特性； 催化53的DNA新链合成，最适温度6872，合成速度1200bases/min； 在合成的DNA链的3端常多一个“A”； 不具35的外切酶活性,即无校正功能，大约每合成500个碱基要错配一个； 具微弱的53的DNA外切酶活性。（7） pfu聚合酶v 具有耐95左右高温达30min以上的特性； v 催化53的DNA新链合成，最适温度6872，合成速度600bases/min；v 合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A；v 合成的DNA片段长度在2kb以内；v 具35的外切酶活性,即有校正功能；v 无53的DNA外切酶活性。（8） Taq Plus I DNA Polymerase 具有耐95左右高温达30min以上的特性； 催化53DNA新链合成，6872最适； 可合成10-30kb的长DNA片段； 合成的DNA为平端,TA克隆时要用Taq酶加A； 具35的外切酶活性,有很强的校正功能， 大约每合成1.6x106个碱基要错配一个； 具微弱的53的DNA外切酶活性。（9） Pyrobest DNA polymeraseu 高保真性（High Fidelity）和Pfu 等DNA聚合酶相同， Taq 的10倍以上。u 良好的扩增性能，优于 Pfu 等DNA聚合酶。u 扩增得到的PCR产物为平滑末端（10） 依赖于RNA的DNA聚合酶反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链1 M-MuLV:鼠源RT, 来源于鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)最适温度42, 以RNA、DNA或RNADNA杂分子为模板，需引物，需Mg2+或Mn2+为辅助因子，具有RNase H活性，特异性地对RNADNA杂分子中的RNA降解2 禽源RT, 来源于鸡成髓细胞增多症病毒(Avian Myeloblastosis virus) （特点同上）3 Powerscript Reverse TranscriptaseCLONETECH公司的专利产品，源于M-MuLV的一个点突变。无RNase H活性，故合成的cDNA不会因此变短。具有末端转移酶活性，倾向加3个“C”。用于合成全长cDNA。3、 核酸酶1. 单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+2. 双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）大肠杆菌的核酸外切酶 III 特异性地从3端外切3.双链核酸外切酶：核酸外切酶（ Exo）核酸外切酶特异性地从5 端外切4.单链核酸内切酶：S1核酸酶S1核酸酶基本特性：降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍；Zn2+必需；最适pH范围为4.0 - 4.3；需要NaCl 10 - 300 mM；降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍。5.Bal31核酸酶Bal31核酸酶的基本特性：A: 来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）B: 单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA突变四、核酸修饰酶1.末端脱氧核苷酸转移酶 53DNA聚合酶活性末端转移酶的特性： 需要3OH、二甲胂酸缓冲液。 不需要模板。 底物可以是单链DNA是3OH突出的双 链DNA平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。 随机添加的dNTPs，如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。末端转移酶的用途： 同聚物加尾：给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。 再生酶切位点：便于回收克隆片断。 非放射性标记DNA片断的3端：催化非放射性标记物参入DNA片断的3端。 （生物素-11-dUTP等）2.T4多核苷酸激酶P35功能：催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。（不论5-OH端突出与否）如果ATP的磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5端。但天然的DNA的5端都是磷酸化的。多核苷酸激酶的用途：u 正向反应（forward reaction）u 交换反应标记法反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时， 多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的g-32P与DNA5端的磷酸交换。3. 碱性磷酸酶（参见P35） 来源于牛小肠碱性磷酸酶可催化核酸分子的脱磷作用，使DNA或RNA的5磷酸变为5-OH末端第三章 用于基因克隆的载体载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。载体应具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性），具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，具有较高的外源DNA的载装能力，具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点， 具有合适的筛选标记。一、质粒载体（P42-43）A: 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；B: 质粒常见于原核细菌和真菌中；C: 绝大多数的质粒是DNA型的；D: 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA；E: 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb。1.天然质粒的缺陷（1）分子量大，拷贝数低；（2）筛选标记不理想。2.理想载体条件 （1）具有较小的分子质量和较高的拷贝数（2）具有若干限制性内切酶的单一酶切位点，以满足基因克隆的需要（3）具有两个以上的选择标记基因(4)缺失的mob基因（5）插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达3.质粒的选择标记及其工作原理绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记：氨苄青霉素抗性 （Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）,青霉素的衍生物。a.抑菌原理，通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。b细菌抗性原理：Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）a.抑菌原理：通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。b.细菌抗性原理： Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。iii）卡那霉素（kanamycin，Kan）a.杀菌原理：通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读。杀死细菌。b细菌抗性原理：Kanr编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。iv）链霉素（Streptomycin，Str）a. 杀菌原理：通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译。杀死细菌。b. 细菌抗性原理： Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。v）四环素（Tetracycline，Tet）a. 抑菌原理：通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。b. 细菌抗性原理：Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。4. 重要的大肠杆菌质粒载体（1）pBR322:松弛型复制；氯霉素可扩增；拷贝数 50 - 100 / cell；用于基因克隆。a.元件来源： 复制起点 ori：pMB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点； Ampr基因：pSP2124质粒的Ampr基因； Tetr基因：pSC101的Tetr 基因。b.选择标记:氨苄青霉素和四环素抗性c.pBR322的优点: 双抗菌素抗性选择标记：插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet其中之一中死亡。 分子小，克隆能力大：载体越小越好。 10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。 高拷贝数：氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy安全：失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。（2） pUC18 / 19(P43)：拷贝数 2000 - 3000 / cell；装有多克隆位点（MCS）；正选择颜色标记 lacZ；用于基因克隆和测序。a. 元件来源: 复制起点:pBR322的 ori Ampr 基因:pBR322的Ampr基因，但其上失去了克隆位点。 lacZ的启动子:大肠杆菌 lacZ基因:大肠杆菌lacZ的-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断。b.正选择标记 lacZ 的显色原理:-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。-肽（ lacZ ）：-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.;受体菌lacZ突变（lacZM15）受体菌基因组的-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal 载体lacZ与互补pUC质粒载体上的lacZ编码肽与这个缺失突变的-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。互补的插入失活pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。不能互补。c.IPTG的诱导作用IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的lacZ 的C端部分和载体的lacZa肽都表达。从而互补。d.pUC系列载体的优点 更小的分子量 选择方便:Xgal显色、抗菌素双重直接选择。 克隆便利:具有多克隆位点（MCS） 测序方便（3） pGEM-3Z由pUC派生而来,与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录pGEM-3Z的特点： 如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA 外源基因正接反接都可以转录。 MCS与pUC18的完全一样。（5）噬菌体或病毒DNA(P52-56)噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：a.高效的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；b.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。（6）单链噬菌体载体M13的生活周期M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA，+DNA合成DNA，形成RF dsDNA，DNA转录mRNA、合成+DNA、翻译形成噬菌体蛋白，组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞。M13载体的构建a.克隆区域的选定i.基因间隔区（intergenic region, IG区）M13基因组中只有基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区。ii.酶切位点IG区内只有一个 BsuI 切点。b.加入酶切位点i.在IG区内加入单一内切酶位点（7）黏粒质粒（P71-76）:组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性标记（ampr）、cos位点（8）噬菌粒（phagemid or phasmid）噬菌粒载体的特点噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体a.能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 ；b.能像质粒那样在受体细胞中自主复制；c.装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb）；d.通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA；e.重组操作简便，筛选容易（9） 人工染色体酵母人工染色体载体（YAC）细菌人工染色体载体(BAC)（10） 表达载体构建的原则 1阅读框与外源基因高效表达2启动子与外源基因高效表达3转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达4有效地翻译起始与外源基因高效表达5终止密码选择与外源基因高效表达6外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达 第四章 核酸操作的基本技术1 核酸提取基本原理 （1） 碱抽提法提取质粒DNA原理闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；染色体线性DNA或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。（2） 所用的试剂作用 溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。 葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。EDTAMg2+、Ca2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SDSNaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质变性沉淀。 NaAc-HAc缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。高浓度的NaAc有利于变性的大分子沉淀。 乙醇用于沉淀DNA。DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 RNase A降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE缓冲液DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。（3） 碱抽提法提取质粒DNA的步骤 第一步：溶菌使用“溶液”溶解细菌细胞壁。Solution I 的配制：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNase A第二步：破膜，蛋白质和DNA变性溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。Solution II 的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS第三步：中和溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。Solution III的配制：3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）第四步：离心除去沉淀上清液中含有闭合质粒DNA。第五步：纯化DNA上清液过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。2基因组或其他DNA的提取3 DNA的定量和纯度测定4 核酸的保存（1）DNA的保存最好是溶于TE中，短时间保存可放于4冷藏室。70下DNA能保存5年以上，一般的长期保存只需放于20。DNA样品中加入1滴氯仿，可避免细菌和核酸酶污染，但实验前需通过乙醇沉淀及洗涤去除氯仿。（2）RNA的保存RNA溶可溶于0.3mol/L的醋酸钠（pH5.2）或无RNase的双蒸消毒水，70保存。RNA的长期保存可以以沉淀形式贮存于乙醇中，在20至80保存。RNA溶液中，加一滴0.2mol.L的VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于70，可保存数年。5 DNA的凝胶电泳（p102）：DNA琼脂糖凝胶电泳,对0.8到10kb的dna有最佳的分离效果;聚丙烯酰胺凝胶电泳，分辨效率高，可分辨100bp到1kb的大分子，最单核苷酸链来说分辨率额可以达到1bp6 核酸的分子杂交（P104-108）分子杂交：不同来源的单链核酸（DNA或RNA），只要它们具有大致相同的碱基序列，经过退火处理，就能重新形成杂种双螺旋，这一现象称为分子杂交（molecular hybridization）。Southern bloting：Zorthern blotingWestern bloting7 DNA序列分析（1） 双脱氧链终止法原理1 DNA复制是以一条链为模板，按碱基配 对的原则进行的。2 脱氧核糖的连接是以35磷酸二脂键。3 复制反应可以在体外进行。 4 2和3双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。（2）双脱氧链终止法技术要点 a. 制备单链DNA模板b. 制备一小段单链引物（DNA或RNA）需带有放射性或荧光标记。c. 特殊的DNA多聚酶i.不能有53和35的外切酶活性； ii.与模板的亲和力高，不会提前脱离模板d. 制备2和3双脱氧的ddNTP第五章 聚合酶链式反应1.PCR反应原理（1）DNA模板变性 95oC双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。（2） DNA模板与引物复性 40-65oC引物（primer）:人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。（3） DNA链的延伸 72oCDNA聚合酶按碱基配对原则延伸DNA链。（4） 新一轮循环开始变性复性延伸。理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。（5）1个循环的结果2.PCR反应曲线 3. PCR的过程（1） 第一步 变性（denature）94-95 oC下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。（2） 第二步 复性（anneal）50-60 oC下1分钟，引物与模板复性。 引物的浓度高， 引物的链短。（3） 第三步 延伸（extend）72 oC下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。（4）第四步 变性（denature）94 oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（5） 第五步 重复（repeat）4. PCR的特点（1） 特异性强 PCR使用专门合成的DNA引物。 延伸过程是在高温下进行。这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。（2） 敏感性高 ：需要的模板量极低（3） 快速：整个PCR过程约4小时即可完成。（4）简便：对模板的纯度要求低。（5）可以扩增mRNA RT-PCR：先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。5. 影响 PCR的因素（1）Taq DNA聚合酶 热稳定性 最适温度高最适温度：72-78 oC 延伸速度：约1000nt/min酶分子 最长延伸长度：6.7kb Taq酶的功能缺点具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。 Taq DNA聚合酶的激活剂 金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol/L。（2）引物（primer)位置：与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（5端相同）的短DNA。引物的长度理论计算：419=2.751011。即2.751011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约210-11）。引物的碱基序列3端必须与模板正确配对，5端可以不配对。引物的碱基组成i.尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力。ii.避免连续相同碱基排列或内部回文序列.iii.避免形成引物二聚体（dimer），两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。引物的Tm值手工计算：Tm=（G+C)4 + (A+T)2一般估计：当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55oC。实际复性温度选择低于Tm值5oC 引物的浓度简并引物如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。套嵌引物（nested primers)设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。（3） dNTPdNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失dNTP溶液呈酸性，使用时应小量分装，-20冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，浓度过低会降低PCR产物的产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性（4）模板DNA 纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。 模板的量：不能太多，100l反应体系中100ng足够。（5） Mg2+Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响在一般的 PCR反应中，dNTP浓度200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少6.标准的PCR反应体系10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ul7. 提高PCR扩增的特异性 一定范围内提高退火温度； 缩短退火和延伸时间，可减少错误引发及 多余的DNA聚合酶参与酶促延伸的机会； 降低引物和酶的浓度可以减少错误引发， 尤其是能减少引物二聚体的引发； 改变Mg2+的浓度； 引物设计的特异性； 减少循环次数； 热启动（Hot Start） 采用二对引物即外引物和内引物进行扩增来 提高扩增的特异性8. 引物设计的基本原则：典型的引物1到30个核苷酸长 ；选择GC含量为45到55碱基的分布是随机的；避免引物间和引物内产生碱基以上互补；避免3末端的错误配对；设计5端和中间区为G或C的引物；避免引物对3末端存在互补序列；避免3末端富含GC，设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。避免存在可能会产生内部二级结构的序列。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性引物量：每条引物的浓度0.1 1umol或10 100 pmolRT-PCR 引物设计特别注意：跨越两个外显子附加序列:目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响特异性。9 聚合酶链式反应技术类型（1）巢式PCR：是为了增加扩增的灵敏度,对已知序列设计出第一对引物,扩增25个循环,然后根据序列设计第二对引物(在第一对引物内部),如此扩增,不受平台效应限制,灵敏度高。（2） 降落PCR：其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，在不知道最佳退火温度时比较适合。（3） 竞争引物PCR：有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。（4） 不对称PCR：用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。技术关键：两个引物的浓度相差100倍。（5） 锚定PCR锚定PCR是在未知DNA cDNA片段的一个末端人工接上一个已知序列片段,利用一个基因特异引物与这个人工序列区引物（锚定引物）进行扩增，所以它是一种半特异性扩增。 （6） 反向PCR扩增两个引物外侧的未知序列技术关键：把线性DNA模板转变成环形分子。（7） 兼并引物PCR（Degenerate Primer）兼并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，产物特异性越强。设计引物时应尽量选择兼并性小的氨基酸，并避免引物3末端兼并，因为3端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR；次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。（8） RT-PCR（reverse transcription-PCR）在逆转录酶的作用下、以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应。技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。（9）实时荧光定量PCR常规定量PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量，重复性差，半定量。实时定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量。实时荧光定量PCR原理在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。i.Ct 值C代表Cycle，t代表threshold(荧光域值)。含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 ii.荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15iii.Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。iv.荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针，荧光染料。v.TaqMan荧光探针与目标序列互补的寡核苷酸探针两端分别标记一个报告荧光基团(荧光素)和一个淬灭荧光基团(淬灭剂)。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。实时荧光定量PCR的特点:特异性强：具有引物和探针的双重特异性重复性好：同一标本的Ct值相同敏感性高：可检测百万分之一个感染细胞或10病毒DNA分子线性范围广：定量的动态范围达5-6个数量级，因而相差较大的DNA起始拷贝数也不需稀释工作效率高：一次定量96个样品仅需1-2h 但仪器及配套试剂极其昂贵10.聚合链式反应的应用 （P133-152） 第六章 目的基因的克隆与基因文库的构建（P187）一、基因组DNA片断化1.限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。优点：由于有粘性末端，产物可以直接与载体连接。缺点：目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！2.随机片断化限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。a.限制性内切酶的选用原则i.内切酶识别位点的碱基数：影响所切出的产物的长度和随机程度。1）4bp的内切酶：平均每44（256）bp一个切点。随机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。2）6bp的内切酶：平均每46（4096）bp一个切点。ii.内切酶粘性末端：能与常用克隆位点相连机械切割法a. 超声波：超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。b. 高速搅拌：1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。二、基因文库的构建1. 基因文库（gene library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。2. 构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。（1） 对载体的要求载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。3. 基因文库构建的一般步骤（1）染色体DNA大片段的制备断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。 物理切割法：超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 酶切法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。（2） 载体与基因组DNA大片段的连接 粘性末端直接连接人工接头法（adapter） 同聚物加尾4. 基因组文库的大小 5. 理想的基因文库应具备下列条件 重组克隆总数不宜过大 载体的装载量最好大于基因的长度 克隆之间必须有足够长度的重叠区域以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸下 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选三、 cDNA文库的构建1. cDNA以mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。2. cDNA library利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。3. cDNA文库的特点（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。4. 构建cDNA文库的一般步骤（1） 总RNA（total RNA）提取（2） mRNA的分离纯化 原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA的分离纯化（3）cDNA的合成 cDNA第一链合成 (P143-144)逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 降解mRNA模板用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。 cDNA第二链合成(P144-147)剩下的cDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。去掉发卡结构用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。妙用RNaseH：这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。5.cDNA与载体连接：在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。四、目的基因的分离和扩增1. mRNA消解杂交原理：羟基磷灰石柱（Hydroxylapatite column）：结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。 将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。 不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。 用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。2. mRNA差异显示PCR（DD RT-PCR）（1）3端的锚定引物Oligo(dT)引物的3端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。（2）12种锚定引物（3）5端的随即引物（4） 随机引物与锚定引物成对扩增引物组合：12种锚定引物，若与20种随机引物，可组成240组引物。（5） 随机-锚定引物PCR的产物电泳比较五、PCR扩增获得目的基因由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基A，由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆。1. 直接从基因组中扩增（1） 提取基因组DNA作模板（2） 根据目的基因序列设计引物（3） PCR扩增2. 从mRNA中扩增: RT-PCR（1） 提取 total RNA（2） 反转录合成总cDNA作模板（3） 根据目的基因序列设计引物（4） PCR扩增六、化学合成目的基因 目前常用的方法：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法。第7章 基因的重组与转移1、 外源DNA与载体DNA重组的主要方法及优缺点 2、 防止载体分子的自身环化的方法:5端去磷酸化3、 PCR产物的连接1. 在引物的5端设计酶切位点（1） 设计原则符合