欧洲药典-2．6．12非无菌产品的微生物限度检查.doc

1 2 6 12非无菌产品的微生物限度检查 有活力的需氧菌总数的计 数 本附录给出了两种测试方法第一种给出与专论相符合的相关测试方法除非说明采用第2种测试 参 照本章的内容采用第 种测试方法 考虑到申请上市许可的需要 第2种测试方法也是欧洲药典正式 方法的组成部分 一旦相关部分修改 用第 种测试方法代替第 种 第二种方法为了与日本药局 方和美国药典的要求一致 A 欧洲药典的方法 下述检验方法是对有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌数的计数检查 这些试验设计主要用来检查样品是否符合药典对微生物限度的要求 用于这一目的时要遵守以下 指导原则 包括样品的抽样数选取及结果的解释 这些试验也可以用于药典中抗菌防腐剂效力的检 验 5 1 3 它们可进一步用来监测原料质量 药物制剂的微生物质量监测 5 1 4 当用于这些目 的时 例如生产者用于原料和 或成品的检测或者用于认证过程评价时 进行测试的方法包括抽取 样品数及结果的解释是生产者和主管当局间协议中的事项 检定应该在样品不会被污染的条件下进行 用来防止污染的预防措施必须不影响在试验中微生物 的检出 如果被检测的产品含有抗菌活性 它必须被充分中和 并证明所用的灭活剂是有效的和对 微生物是无毒性的 本章描述了薄膜滤过法 培养板记数法测定有活力的需氧菌总数 当没有其它方法进行细菌计数时可用最大可能数法 方法的选择基于产品的性质及预期的微生物 数量这些因素 任何被选用的方法必须被适当地验证 当5 1 3章或5 1 4章联合应用时 可以 使用平皿法 pour plate 表面涂布平皿计数法 surface spread 及薄膜滤过法 供试品的准备 抽样计划 抽样必须遵循明确的抽样计划 抽样计划由一批样品的数量 与不被接受的高污染 产品相关的健康危险 产品的特性 预期污染水平等因素而定 除另有规定外 取10g或10ml 样品或制剂 按上述方法预处理 从原料中或从制剂包装中随机地选取样品 根据样品 原料或制剂 的特性 必要时可从多个包装中取 样 混合后 得到所需检品量 一个取样计划是否适用于样品的抽样方法的关键是样品均一性 因为 样品的均一性关系到微生物的分布 被认可的三个抽样种类是 1 可接受的样品 例如 每克或每毫升仅含少于m 个菌落形成单位的样品 在这里m 是相关章节 中的规定限度 2 边缘样品 例如 每克或每毫升所含菌落形成单位多于m个少于十倍m个的样品 3 缺陷样品 例如 每克或每毫升所含菌落形成单位超过十倍m个的样品 水溶性产品 取1O克或10毫升样品溶解或稀释到pH一7 0的氯化钠一蛋白胨缓冲液或其它合适的 2 液体中 通常预先准备1 1O的稀释液 然而 由于产品的特性及所需要的灵敏度不同 也有可能稀 释成其他的比例 如果该产品含有抗菌活性物质 应在稀释液中加入灭活剂 如果需要 调节pH值 到7左右 用相同的稀释剂做进一步的1O倍稀释 不溶于水的非脂溶性产品 取1O克 或10毫升 样品悬浮到pH一7 0的氯化钠一蛋白胨缓冲液 或另一种液体 中 通常预先准备 1 1O的悬浮液 由于产品特点 也可能要更大体积的稀释 一种适用的表面活性剂 例如 加入 lg L的聚山梨酸酯8O 有助于湿润性较差的物质的悬浮分散 如果该产品含有抗菌活性物质 可在 稀释液中加入灭活剂 如果需要 调节pH值到7左右 并且用相同的稀释剂做进一步的1O倍稀释 脂溶性产品 取样品1O克 或10毫升 加无菌聚山梨酸酯8O或其它适宜的表面活性剂 不超过样品质量一半 混合均 匀 该表面活性剂起匀化检品的作用 如需要 可加热但不允许超过40 C 特殊情况下在特殊情况 下不超过45 小心混合 需要时 在水浴或培养箱内保持这个温度 加入预热的pH 7 0的氯化 钠一蛋白胨缓冲液使其成为1 1O供试品液 保温振摇以便形成乳状液 时间不超过3O分钟 如需要 做进一步的十倍稀释 可用pH 7 0的氯化钠一蛋白胨缓冲液 含一定比例无菌聚山梨酸酯8O或适宜 的表面活性剂 进行稀释 贴剂 取已用无菌镊子除去 释放衬垫 的本品十贴 具有粘性的一面朝上置无菌玻璃或塑料盘内 用 无菌的医用纱布 或起滤过作用的单纤维聚合体的栅格 覆盖在粘性面上 如需要 转移1O贴贴剂到 最 小500ml体积的pH 7 0的氯化钠一蛋白胨缓冲液 缓冲液中含适当的灭活剂或钝化剂 如 无菌聚 山梨酸酯8O和 或卵磷脂 剧烈振摇该制剂至少3O分钟 制剂A 同法制备另外1O贴 放置在至少 500ml肉汤培养基D中 剧烈振摇该制剂至少3O分钟 制剂B 供试品的检查 薄膜过滤 使用孔径不大于0 45um 具截留细菌效力的滤膜 该滤膜的材料选择能使细菌有效截留而不影 响供试品的检验 例如 硝酸纤维素滤器用于水溶液 油状和乙醇的稀溶液 醋酸纤维素滤器用于 乙醇的浓溶液 过滤器具应设计为滤膜可取下转移到培养基中 参照供试品制备一节 转移一定数 量 含1克供试品的数量 如估计样品含有大量菌落形成单位数 则可适当减少 供试品的稀释液 到两联滤器中的一个 立即过滤 相继用每次约100ml的合适液体如pH 7 0的氯化钠一蛋白胨缓冲液 冲洗每张滤膜三次 可以加入表面活性剂如聚山梨酸酯8O或针对抗菌物质的灭活荆 如经论证 则 冲洗不应超过三次 将主要准备作细菌计数的其中一联滤器的滤膜转移到一种琼脂培养基表面 如 培养基B或者其他的 准备作真菌计数的其中一联滤器的滤膜转移到一种琼脂培养基表面 如 培养 基C 如希望在较短时间内得到可靠的计数 检测细菌的平皿 装有培养基B的平m1 在30 35 培养5 天 检测直菌的平皿 装有培养基C的平皿 在2O 25 培养5天 选择小于100个菌落形成单位的有最 高生长菌落数的平皿进行计数 并且计算每克或每毫升供试品所含的菌落形成单位数 透皮吸收剂 检验时 制备A的滤液50ml 应分别用两张滤膜过滤 一张滤膜置琼脂培养基B上培养 计算需氧微 生物总数 另一张滤膜置琼脂培养基C上培养 计算真菌总数 平皿计数方法 3 a 平皿法 Pour Plate method 在直径9cm 的平皿中 每皿加入lml经预处理的受检制品和约15 20mI的液化琼脂培养基 此种培养 基适合细菌生长 如培养基B 或15 20ml适合真菌生长的液化琼脂培养基 如培养基C 液化培养 基的温度不超过4O 如果用较大的平皿 琼脂培养基的数量相应增加 稀释水平相同的培养基要 准备2只同样的平皿 要在较短的时间内得到可靠的计数 将准备检测细菌的培养皿 装有培养基B的 平皿 在3O 35 培养5天 真菌的培养皿 装有培养基C的平皿 在20 25 培养5天 菌落计数 根据 稀释度来选择用来计数的平皿 在该稀释度的平皿中细菌的菌落形成单位最多不超过300个 真菌的 菌落形成单位最多不超过100 取同一稀释度两个平皿菌落形成单位的算术平均值 用来计算每克 或每毫升样品所含的菌数 b 表面涂布平皿计数法 Surface spreadmethod 在直径9cm 的平皿中 每皿加入约15 20ml 45 左右的适合细菌生长的液化琼脂培养基 如培养基 B 或加入15 20ml 45 C左右的适合于真菌的生长液化的琼脂培养基 如培养基C 固化平皿内的 培养基 如果用较大的陪替氏平皿 琼脂培养基的数量相应地增加 在培养箱或LAF工作台 上干燥碟子 在固化培养基表面涂布一定量 不少于0 1m1 的经过预处理的检品 每一稀释水平相 同培养基需要准备2只同样的平皿 培养方法及菌落形成单位计数方法均参照平皿法 Pour Plate method 最大可能数法 Most Probable Number 最大可能数 MPN 法的准确度和精密度都小于薄膜计数法和平皿计数法 特别在真菌计数结果不可靠 由于以上原因 在没有其它合适方法的情况下 才用于细菌计数 如果该方法经过验证可以应用 同时按以下操作进行 准备一系列 至少三个 连续的1 1O稀释度的样品 每一个连续稀释度均1克 或1毫升接种到装有9毫升适合的液体培养基 如肉汤培养基A 的试管中 使之成为1O毫升 如有需 要 一种表面活性剂例如聚山梨酸酯8O或针对抗菌物质的灭活剂可以被加入到培养基中 因此 三 个稀释度共接种9支试管 接种管在30 35 培养5天 记录每一稀释度有微生物生长的管子的数 目 由于样品的特性造成的读取结果困难或不确定 可再次用相同的培养基传代培养 或用另外一 种适宜琼脂培养基 如琼脂培养基B 在相同温度下培养18小时到24小时 并且以这次结果为准 查阅 表2 6 12 1获得样品每克或每毫升所含细菌的最大可能数 表 细菌的最大可能数评价 每一稀释级三管每一稀释级三管 阳性管数目阳性管数目每克样品每克样品类别类别 0 1 g0 01 g0 001 g最大可能数最大可能数12 置信区间置信区间 000 3 0103 x 1100 类别 1 正常的结果 95 的情况下得到此种结果 类别 2 可能性很小的结果 仅有 4 的情况下得到此种结果 在重要的决定中 此结果不被采用 结果出现的可能性小于种类 2 的 情况 没有列出并且也不被接受 培养基的有效性和计数方法的正确性 测试细菌分别用合适的液体培养基 如肉汤培养基A 在3O 35 C培养18小时到24小时 测试 真菌分别用合适的液体琼脂培养基 如不含抗菌物质的培养基C 在20 25 C培养 白色念珠菌培养48 小时 黑曲霉培养7天 金黄色葡萄球菌如 ATCC 6538 NCIMB 9518 CIP 4 83 大肠埃细菌如 ATCC 8739 NCIMB 8545 CIP 53 126 枯草芽孢杆菌如 ATCC 6633 NCIMB 8054 CIP 52 62 白色念珠菌如 ATCC 10231 NCPF 3179 IP 48 72 黑曲霉菌如 ATCC 16404 IMI 149007 IP 1431 83 用pH 7 0的氯化钠一蛋白胨缓冲液稀释每一种培养物若干份 使试验悬浮液每毫升含有活力的微生物 约100个菌落计数单位 在加和不加供试品的情况下 分别用每一种微生物的悬浮液作为计数方法的 对照组 当检查方法是膜过滤法或是平板计数法时 任何试验微生物的计数与接种物计算值的差异 不应超过5倍 当检查方法是最大可能数法 MPN 时 任何试验微生物的计数与接种物计算值应在95 的置信区间内 用无菌的pH 7 0的氯化钠一蛋白胨缓冲液作为试验制品进行需氧菌的计数 来检查 培养基和稀释剂是否无菌和是否无菌操作 必须无微生物生长 结果的解释 琼脂培养基B上的菌落形成单位的平均数被认为就是细菌数 琼脂培养基C上的菌落形成单位的平均 数被认为就是真菌数 需氧菌总数计数就是细菌数和真菌数的总和 如证明同类微生物能在两种培 养基上生长 这也是正确的 如果计数是通过最大可能数 MPN 法得到的 则计数为细菌总数 在专论中 如果有限度规定 应作如下解释 1O2微生物 可接受的最大限度为5 102 1O3微生物 可接受的最大限度为5 103 以下依此类推 如果实行抽验计划后 如 三类抽样检验法 被执行 结果解释如以下说明 分别计算五份样品中每一份样品的需氧菌总数 符合下面条件的 则该物质或制剂通过检查 1 没有一份样品需氧菌总数超过规定限度的十倍以上 如 无 不能接受的样品 2 不超过2份样品的需氧菌总数虽超过规定限度但小于十倍的规定限度 如 不超过2份的 边缘样品 5 上述推荐使用的溶液和培养基参照总论章节的2 6 13 B 统一方法 非无菌产品的微生物限度检查 微生物计数试验 1 引言 下述检验方法是对有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌数的计数检查 这些试验设计主要用来检查样品或制剂是否符合已建立的微生物质量规范 用于这一目的时要遵守以下指导原则 包括样品的抽样数选取及结果的解释 该方法并不适用于生物样品 对于替代微生物的程序 包括自动化的方法 提供等价的药典方法的证明 一般程序 检定应该在样品不会被外在微生物污染的条件下进行 用来防止污染的预防措施必须不影响在试验 中微生物的检出 如果被检测的产品含有抗菌活性 尽可能除去或中和 并证明所用的灭活剂是有 效的和对微生物是无毒性的 如果使用表面活性剂用于样品的预处理 必须证明他们没有微生物毒性和符合灭活使 用 计数方法 按照规定使用膜过滤法或平板计数法 最大可能数 MPN 法对微生物计数最不准确的方法 但是对于 微生物负载很低的样品 它可能是最合适的方法 方法的选择基于样品的性质和规定的微生物限度等因素 选择的方法必须允许测试有足够样本大小 来判断符合规范 必须建立适合的方法 4促进生长试验和适宜的计算数方法 4 1 一般考虑 必须建立能检测现有样品中微生物能力的方法 如果产品或测试过程的改变有可能影响测试结果 它的适用性必须确认 4 2试验菌株的制备 使用标准化的稳定悬浮液的试验菌或按照如下说明准备 传代保存技术是从原始菌种 接种传代不超过 5 代 按照表2 6 12 2所描述分别测试每一个的细菌和真菌菌株成长 用 pH 7 0 的氯化钠一蛋白胨缓冲液稀释或 pH 7 2 的磷酸盐缓冲液制备悬浮液 制备黑曲霉孢 子 用 的聚山梨酯 80 添加到缓冲液中 如果储存在 2 8 C 可在 2 小时或 24 小 时内 使用 作为一种替代办法准备 可用新鲜的黑曲霉或枯草杆菌的营养细胞 一个稳定的孢子悬浮 液 然后准备一个适当的体积孢子悬浮用于试验接种 稳定的孢子悬浮可在 2 8 C 下保持 一个经过验证的时间 4 3阴性对照 阴性对照是用稀释剂代替样品进行实难以确认实验条件 阴性对照必须没有微生物生长 4 4 培养基的生长性实验培养基的生长性实验 测试每批随时准备中期和每批中 无论从编制中期或脱水的成分说明 按表2 6 12 2 提 示接种很少 不超过 cfu 于部分大豆消化肉汤培养液和酪蛋白大豆消化琼脂平板 每个菌使用一分离培养液 平板 固体培养基 绝不能获得比一个标准化的接种计算值差异 6 大于 2 对于刚准备接种 增长的微生物相比以前得到了检验和批准一批中等发生液体培 养基适合 如果清楚地看到增长的微生物相比以前得到了检验和批准一批中等发生 4 5 产品适宜的计数方法产品适宜的计数方法 4 5 1 样品的制备样品的制备 样品制备的方法取决于被测试样品的物理性质 如果下文所述的程序不能够证明是令人满 意的 必须开发另一种程序 水溶性产品水溶性产品 取样品溶解或稀释 通常是 的进行稀释 到pH一7 0的氯化钠一蛋白胨缓冲液 pH 7 2 的磷酸盐缓冲液或酪蛋白大豆消化肉汤 如果需要 调节pH6 8 用相同的稀释剂做进一步的稀 释 表 2 6 12 2 准备和使用菌株 生长性实验生长性实验产品适宜的计数方法产品适宜的计数方法微生物微生物试验菌株的制备试验菌株的制备 总好氧微生物计总好氧微生物计 数数 总酵母菌总酵母菌 和霉菌计和霉菌计 数数 总好氧微生物计总好氧微生物计 数数 总酵母菌和霉总酵母菌和霉 菌计数菌计数 金黄色葡萄球 菌 酪蛋白大豆消化 琼脂或 酪蛋白 大豆消化肉汤 酪蛋白大豆消化 琼脂或 酪蛋白 大豆消化肉汤 酪蛋白大豆消化 琼脂 MPN 酪蛋 白大豆消化肉汤 such as 30 35 C 100 CFU 100 CFU ATCC 653818 24 h30 35 C30 35 C NCIMB 9518 3 days 3 days CIP 4 83 NBRC 13276 绿脓杆菌酪蛋白大豆消化 琼脂或 酪蛋白 大豆消化肉汤 酪蛋白大豆消化 琼脂或 酪蛋白 大豆消化肉汤 酪蛋白大豆消化 琼脂 MPN 酪蛋 白大豆消化肉汤 such as 30 35 C 100 CFU 100 CFU ATCC 902718 24 h30 35 C30 35 C NCIMB 8626 3 days 3 days CIP 82 118 NBRC 13275 枯草芽孢杆菌酪蛋白大豆消化 琼脂或 酪蛋白 大豆消化肉汤 酪蛋白大豆消化 琼脂或 酪蛋白 大豆消化肉汤 酪蛋白大豆消化 琼脂 MPN 酪蛋 白大豆消化肉汤 ATCC 663330 35 C 100 CFU 100 CFU NCIMB 805418 24 h30 35 C30 35 C CIP 52 62 3 days 3 days NBRC 3134 白色念珠菌萨布罗 葡萄糖琼 脂或萨布罗 葡萄 糖肉汤 酪蛋白大豆消化 琼脂 萨布罗 葡萄糖琼 脂 酪蛋白大豆消化 琼脂 萨布罗 葡萄糖 琼脂 such as 20 25 C 100 CFU 100 100 CFU 100 CFU 7 CFU ATCC 102312 3 days30 35 C20 25 C30 35 C20 25 C NCPF 3179 5 days 5 days 5 days 5 days IP 48 72 MPN 不可用 NBRC 1594 黑曲霉菌萨布罗 葡萄糖琼 脂 或马铃薯 葡 萄糖琼脂 酪蛋白大豆消化 琼脂 萨布罗 葡萄糖琼 脂 酪蛋白大豆消化 琼脂 萨布罗 葡萄糖 琼脂 such as 20 25 C 100 CFU 100 CFU 100 CFU 100 CFU ATCC 164045 7 days 或 直 到实现良好的孢 子 30 35 C20 25 C30 35 C20 25 C IMI 149007 5 days 5 days 5 days 5 days IP 1431 83 MPN 不可用 NBRC 9455 不溶于水的非脂肪产品不溶于水的非脂肪产品 使被检样品悬浮pH一7 0的氯化钠一蛋白胨缓冲液 pH 7 2的磷酸盐缓冲液或酪蛋白大豆消 化肉汤 一种适用的表面活性剂 例如 加入lg L的聚山梨酸酯8O 有助于湿润性较差的物质的 悬浮分散 如果需要 调节pH值到 并且用相同的稀释剂做进一步稀释 水溶性产品水溶性产品 取1O克或10毫升样品溶解或稀释到pH一7 0的氯化钠一蛋白胨缓冲液或其它合适的 液体中 通常预先准备1 1O的稀释液 然而 由于产品的特性及所需要的灵敏度不同 也有可能稀 释成其他的比例 如果该产品含有抗菌活性物质 应在稀释液中加入灭活剂 如果需要 调节pH值 到7左右 用相同的稀释剂做进一步的1O倍稀释 脂溶性产品脂溶性产品 溶解在十四烷酸异丙酯 过滤除菌或用所必需的最少量的无菌聚山梨酸酯8O混合产品或其它 非抑制作用的无菌表面活性剂 如需要 可加热但不允许超过40 C 特殊情况下在特殊情况下不 超过45 小心混合 需要时 在水浴锅中保持这个温度 加入预热的稀释剂使其成为1 1O供试 品液 保温振摇以便形成乳状液 进一步的十倍稀释可以用含一定比例无菌聚山梨酸酯8O或其它非 抑制作用的无菌表面活性剂 液体或固体气溶胶 在无菌将产品转移到膜过滤器具或无菌中容器做进一步采样 使用总 含量或确定的数量的计量剂量从每个容器中检验 贴剂贴剂 取已用无菌镊子除去 释放衬垫 的贴剂 具有粘性的一面朝上置无菌玻璃或塑料盘内 用无菌的多孔材料覆盖在粘的那一面 例如无菌纱布 以防止贴粘合在一起 转移贴剂到适 8 宜体积的含有无菌聚山梨酸酯8O和 或卵磷脂的稀释剂中 剧烈振摇该制剂至少3O分钟 4 5 2 接种和稀释接种和稀释 把不超过 CFU 的微生物悬液加到按上述 4 5 1 准备的样品和阴性对照 不含 测试物质 加入微生物悬液的体积应不超过供试液体积的 检测样品的微生物回率 可能的最低稀释级的样品必须用于测试 如果由于抗菌活性或不 易溶解达不到要求 必须开发更合适的方法 如果由于样品的抑菌性无法消除 微生物悬 液可在中和 稀释或过滤后加入 4 5 3 中和中和 消除消除抗菌活性 从按照从按照 4 5 2 中制备的样品溶液中回收的微生物的数目和按照 4 5 4所描述的程 序培养的的微生物的数目 与阴性对照中回收的微生物的数目比较 如果生长受到 抑制 减少 2 倍以上 然后修改实验程序再进行特别列举测试 以确保结果的有效性 实验程序的修改可以包括 1 增加稀释剂或培养基的体积 2 联合加入特定的或一般的中 和剂到稀释剂中 3 薄膜过滤 4 以上方法联合使用 中和剂 中和剂可用来中合抗菌活性 表 2 6 12 3 他们最好在灭菌前加到选择的 稀释剂或培养基中 如果使用 必须用有中合剂没有样品空白来证明其效率和没有微生 物毒性 表 2 6 12 3 对干扰物质的一般中和剂 干扰物质干扰物质潜在的中和方法潜在的中和方法 戊二醛 汞制剂亚硫酸钠 酚类物质 酒精 醛 山梨酸稀释 醛甘氨酸 季铵盐化合物 QACs 对羟基苯 甲酸类 双胍 卵磷脂 季铵盐化合物 碘 对羟基苯甲酸类吐温 汞制剂硫乙醇酸盐 汞制剂 卤素 醛硫乙醇酸盐 乙二胺四乙酸镁或钙离子 如果没有找到合适的中合方法 可以假定是由于样品杀菌活性导致分离不到接种的微 生物 这表明产品不可能受到给定种类微生物的污染 然而 它可能是该产品仅抑制某些 特别的微生物 但不抑制没有包括在试验菌株中的其他微生物 而后者则是不具代表性 然后 按照符合微生物生长和具体验收标准的最高稀释级进行实验 4 5 4 样品中微生物回收率样品中微生物回收率 对于每个列出来的微生物 进行单独测试 补充测试菌株也计算在内 薄膜过滤 使用孔径不大于0 45um 滤膜的材料选择能使细菌有效截留而不影响供试品的检验 每一个列出的 微生物做一张膜 转移一定数量的按照4 5 1到 4 5 3制备的样品 最好含1克供试品的数量 如 估计样品含有大量菌落 则可适当减少 到薄膜过滤器 立即过滤并且用适理体积的稀释剂进行冲 洗 9 对总好氧微生物计数 TAMC 转移膜到酪蛋白大豆消化琼脂的表面 对总酵母菌 霉 菌计数 TYMC 转移膜到沙氏 葡萄糖琼脂的表面 按表2 6 12 2 培养平皿并进行 计数 4 5 4 2 平皿计数法 进行平皿计数方法时 每种培养基至少做两平皿并且使用的平均计数的结果 4 5 4 2 1倒平皿的方法 在直径9cm 的平皿中 每皿加入lml按照4 5 1到 4 5 3处理的受检制品和约15 20mI的酪蛋白大 豆消化琼脂或沙氏 葡萄糖琼脂 培养基的温度不超过4 如果用较大的平皿 琼脂培养基 的数量相应增加 表2 6 12 2中列出的微生物 每种最少两块平皿 按照表2 6 12 2要求进行培养 计算每种培养基算术平均值 并计算接种的菌落 4 5 4 2 2表面涂布平皿计数法 在直径9cm 的平皿中 每皿加入15 20mI温度约4 左右的酪蛋白大豆消化琼脂或沙氏 葡萄糖 琼脂培养基 让其凝固 果用较大的平皿 琼脂培养基的数量相应增加 在培养箱或层流工作台 上干燥碟子 表2 6 12 2 中列出的微生物 每种最少两块平皿 在培养基表面涂布一 定量不少于 0 1m1 的按照4 5 1 到 4 5 3处理的检品 按4 5 4 2 1 的描述培养计数平 皿 4 5 4 3最大可能数法 Most Probable Number 最大可能数 MPN 法的准确度和精密度都小于薄膜计数法和平皿计数法 特别在真菌计数结果不可靠 由于以上原因 在没有其它合适方法的情况下 才用于对总好氧微生物计数 如果该方法经过验证可以应用 同时按以下操作进行 准备一系列按照4 5 1 到 4 5 3 制备的 至少三个连续的1 1O稀释度的样品 每一个连续稀释度均1克或1毫升接种到装有9 毫升的酪蛋 白大豆消化肉汤 接种管在30 35 培养 天以上 由于样品的特性造成的读取结果困难或不 确定 可再次用相同的培养基传代培养 或酪蛋白大豆消化琼脂在相同的温度下培养 天 并 且以这次的结果为准 查阅表2 6 12 4 获得样品每克或每毫升所含微生物的最大可能数 4 6 结果与解释结果与解释 当验证薄膜过滤法或平板计数的适用性时 任何测试微生物的平均计数的计算值差异不大 于 2 的价值界定的 4 5 2 控制的情况下的产品 当验证最大可能数法的适用性时最大可能 数法接种计算值与阴性必须获得在 95 的置信范围结果 如果上述标准不能满足一个或更 多的生物测试的任何描述方法 该方法和测试条件 用最接近的标准是测试条件来测试样 品 5 测试样品 5 1 用于测试样品的数量用于测试样品的数量 10 除另有规定外 除另有规定外 用 10 克或 10 毫升的产品进行样品检查并按上文方法提到采取的预防污染 的措施 对于液体或固体气溶胶 取 个容器 对于贴剂 取 贴 对于活性物质 在制定的下列情况下 进行测试的数量可能会减少 每剂量单位 如片剂 胶囊 注射 剂 小于或等于 1mg 或每克或毫升小于 mg 对于没有用剂量单位表示样品 在这种情 况下 进行测试的样品量不比在 10 剂量单位或 10 克或 10 毫升的产品的数量少 对于 对于做为活性物质的原料 其样本数量是有限的或批大小是非常小的 少于 ml 或 g 测试的数量应为批产量的百分之一 除非在较小的数额是合理的 规定或声 明的 当一批产品在总数小于 200 如临床试验中使用的样本 样本大小可能会减少到 2 个 单位 如果总数小于 100 为 个单位 从大量的物料或从现有准备的容器随机选取样本 为获得要求的数量 混合足够多的容器 中的物料来获得样品 5 2 测试样品测试样品 5 2 1 薄膜过滤 薄膜过滤 用可以转