髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽免疫原性验证.doc

大学毕业论文题 目：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 MOG 抗原肽免疫原性验证学生姓名： XXX 学号： XXXXXXXXX 指导教师： XXX 职称： 教授 专 业： 生物技术 院（系）： 生物工程系 完成时间： 2011 年 5 月 25 日 2011 年 5 月 25 日摘要摘要目的：通过实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）小鼠模型的建立，验证固相合成法制备的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）抗原肽免疫原性。并通过观察 EAE 病理学变化，初步探讨多发性硬化（MS）的发病机制。方法：本实验室利用 Fmoc 固相合成法制备的 MOG3555抗原肽（纯度95%）加完全弗氏佐剂（CFA）免疫 C57BL/6 小鼠，观察小鼠发病情况，并采用双盲法进行神经功能评分。利用电子显微镜观察 EAE 小鼠的病理学变化，分别采用 HE 染色、Luxol Fast Blue髓鞘染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘脱失的情况。结果：MOG3555成功诱导了 C57BL/6 小鼠 EAE 模型。免疫后 15 天起，小鼠开始陆续出现临床症状，至第 21 天发病率达 100%。电子显微镜下可见 EAE 小鼠脊髓中典型脱髓鞘现象，并伴随有典型的炎性细胞的浸润。结论：用本实验室合成的抗原肽 MOG3555诱导的 C57BL/6 小鼠 EAE 模型，发病率高，模型稳定，为进一步研究多发性硬化（multiple sclerosis, MS）的发病机制与治疗打下基础。关键词关键词：髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、实验性自身免疫性脑脊髓炎、动物模型、神经病理学IAbstractObjectiveThe model of experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) was established in female C57BL/6 mice to validate the immunogenicity of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG), to observe pathological changes of EAE, and to explore the possible pathogenesis of multiple sclerosis(MS).MethodsEach mouse was injected s.c over flanks with MOG35-55, Mycobacterium H37Ra, and CFA, injected i.p with pertussis toxin. The clinical symptoms were observed and the pathological changes of EAE were studied with the electron microscopy. Consecutive sections were stained with hematoxylin/eosin(HE) and Luxol Fast Blue(LFB), to assess inflammation and demyelination.ResultsThe incidence of EAE in immunization animal reached 100%, most mice developed clinical EAE with in about 15 days of immunization MOG3555 peptides. With Electron microscopy, inflammatory cells in white matter and demyelination were observed. And the component of axon is disappeared.ConclusionThe immunogenicity of MOG3555 synthesized by the improved solid-phase synthesis method was identified by the induction of EAE in C57BL/6 mice with stable performance and high incidence, which may be helpful in exploring the mechanism and therapy of Multiple sclerosis(MS). Key Words: Myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG), Experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE), Mouse models, Pathological changesIIIII目录目录引言引言.1一、材料和方法一、材料和方法.21. 试剂和仪器.21.1. 主要试剂.21.2 主要仪器.22. 实验动物.22.1 小鼠来源.22.2 饲养.33. EAE 小鼠模型的制备.34. 神经功能评分.35. 脊髓组织病理学检测取材.36. 溶液的配制.37. H&E、LFB 染色.47.1 H&E 染色.47.2 LFB 染色.48. 数据分析及统计学处理.5二、实验结果与分析二、实验结果与分析.51. 临床评分.52 病理学检测结果.62.1 H&E 结果.62.2 LFB 的结果.7三、讨论三、讨论.8参考文献参考文献.10致谢致谢.12IV0引言引言实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）是研究多发性硬化（multiple sclerosis, MS）的经典动物模型，是由同种型、同种异型、异种型神经组织抗原诱导的中枢神经系统(central nervous system, CNS)白质免疫炎性脱髓鞘性模型。其病理特征和 MS 相似，均表现为 CNS 白质脱髓鞘改变和炎性细胞浸润。制备 EAE 动物模型的方法多种多样，可通过注射 CNS 髓鞘、特定的髓鞘蛋白或其选择肽段加完全弗氏佐剂主动诱导；或转移已致敏的 CD4+T 细胞进行过继免疫诱导。诱导 EAE 由于不同的致敏原，动物品系或诱导方法可以诱导产生不同类型或不同程度的EAE，所以制备 EAE 动物模型的方法多种多样。目前报道较多的 EAE 模型动物是 Lewis大鼠、SJL/J 小鼠、B10.PL 小鼠和 PL/J 小鼠等。但国内不易获得这些啮齿类动物，因而在制作 EAE 动物模型时均不作为首选。C57BL/6 小鼠也是具 EAE 敏感特性的品系之一，其对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的敏感抗原表位是 3555 位氨基酸。MOG3555抗原肽含 21 个氨基酸，分子量为2582.4 道尔顿，是唯一既能引起脱髓鞘抗体反应又能引起 T 细胞反应的中枢神经系统髓鞘蛋白成分。虽然 MOG 在髓鞘蛋白中含量很少，但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层，故具有高度免疫原性。近年来用 MOG 诱导的 EAE 逐渐成为国际上研究MS 的主要模型。参照国内外文献报道的方法，结合本实验室的条件加以改进，拟采用MOG3555作为抗原，辅以腹腔注射百日咳毒素，以期成功构建 C57BL/6 小鼠 EAE 模型，来验证其免疫原性；并采用双盲法进行神经功能评分，利用电镜观察 EAE 小鼠的病理学变化，分别采用 HE 染色、Luxol Fast Blue 髓鞘染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘脱失的情况。1一、材料和方法1. 试剂和仪器1.1. 主要试剂MOG35-55多肽 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK 由本实验室合成，合成纯度HPLC95%，完全弗氏佐剂（CFA, Chodrex），百日咳毒素（Pertussis toxin, Sigma），结晶紫 Cresyl viole（Sigma），碳酸锂(上海华硕精细化学品有限公司)，坚牢兰 Luxol-fast-blue（Alfa Aesar），伊红 Y(kermel)，PBS 缓冲液（0.01M，PH7.4），苏木素（郑州派尼化学试剂厂），多聚赖氨酸（Sigma），多聚甲醛（Kermel），无水乙醇，甘油。其它试剂均为国产分析纯。1.2 主要仪器TDL80-2B 离心机（Anke），超净工作台（苏州净化设备有限公司），电子天平（Sartorius），微量移液器（德国 Eppendorf 公司），4C 冰箱（Siemens），微波炉（海尔），冰盒，2ml、5ml 玻璃注射器（上海鸽牌玻璃厂），医用一次性三通管（德国贝朗医疗股份有限公司），Olympus BX51 荧光显微镜（日本 Olympus 公司），Leica 石蜡切片机（Leica，RM2145），手术器械（眼科剪、眼科镊、手术刀等）。2. 实验动物2.1 小鼠来源 健康 68 周龄的雌性野生型 C57BL/6(H-2b)小鼠(SPF 级)共 16 只。体重 1618g，购自中国医学科学院血液学研究所实验动物中心，许可证号：SCXK（津）2004-0001。正常组：8 只，不作任何处理，EAE 病理模型组 8 只，诱导 EAE 模型。2.2 饲养 在大学生物工程系 SPF 级动物房中饲养、繁殖，幼鼠至八周龄后进行实验。23. EAE 小鼠模型的制备C57BL/6 小鼠随机分为 EAE 组和正常组，各 8 只。MOG3555多肽用 PBS 稀释后与完全弗式佐剂（结核杆菌的终浓度为 4mg/ml）按等体积混合，用注射器反复推拉成油包水的乳剂，每只小鼠注射 0.2ml 乳剂，其中 MOG3555多肽剂量为 300g/只，分别于鼠背部两侧皮下注射；在第 1 次免疫后 0 小时和 48 小时腹腔注射百日咳毒素稀释液0.1ml，200ng/只。正常组不做任何处理。4. 神经功能评分自免疫当天开始，每日称体质量，观察小鼠的摄食情况，并从初次免疫第 0 天起至第 31 天实验终止前，采用盲法，每天 2 人至少 1 次在同一时间按 Benson 评分标准，对EAE 严重性进行临床评估，评分2 分以上者（包括 2 分）进行发病率的计算。1 级：尾部无力或蹒跚步态伴尾部有力；2 级：蹒跚步态伴尾部无力（共济失调）；2.5 级：共济失调伴部分单肢麻痹；3 级：单肢完全麻痹；3.5 级：单肢完全麻痹伴另一肢体部分麻痹；4 级：双肢完全麻痹；4.5 级：四肢麻痹；5 级：死亡。5. 脊髓组织病理学检测取材在 EAE 模型发病的高峰期，将小鼠脱颈处死，迅速取其脊髓，置于 4%的多聚甲醛中固定，0.1mol/l PBS 24 小时、70%酒精 30 分钟、95%酒精 I 60 分钟、95%酒精 II 60 分钟、100%酒精 I 60 分钟、100%酒精 II 60 分钟、60C 二甲苯 I 60 分钟、60C 二甲苯 II 60 分钟、60C 石蜡 I 60 分钟、60C 石蜡 II 60 分钟后包埋。将石蜡包块用切片机连续切成 34m 切片，分别作 H&E 染色、LFB 髓鞘染色。6. 溶液的配制6.1 Harris 苏木精的配制：苏示精 1g、硫酸铝钾 15g、无水乙醇 10ml、蒸馏水 200ml 先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸 1 分钟后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞 0.5g。继续加热至浆夜变为紫红色。用纱布盖瓶口，用前滤纸过滤后每 100ml 加冰醋酸 5ml。6.2 乙醇性伊红液 Y 的配制：伊红 Y0.5g、90%酒精 100ml 先将伊红溶于酒精，用玻棒研3碎溶解后，每 100ml 加冰醋酸 1 滴。6.3 盐酸酒精分化液的配制：浓盐酸 0.51ml、75%酒精 99ml。6.4 LFB 的配制：LFB 1.0g、95%酒精 100ml、10%冰醋酸 5.0ml 混匀、过滤。6.5 0.05%碳酸锂的配制：碳酸锂 0.5g、双蒸水 1000ml。6.6 0.25%Cresyl viole 结晶紫的配制：结晶紫 0.25g、双蒸水 100ml、10%冰醋酸 1.0ml 混匀、过滤。7. H&E、LFB 染色7.1 H&E 染色1使用切片机将小鼠脊髓蜡块切为 3-4m 厚，用毛笔小心将其放入 45水浴锅中展片，并用涂抹过蛋白甘油的载玻片将其捞出，置于,60烘箱中烘干（3 小时）；2将切片依次直接放入有 500ml 的 100%二甲苯的两个染缸中，各 5 分钟；3之后再将切片依次放入有 500ml 的 95%酒精的两个染缸中，各 2 分钟；4结束后再将切片依次放入有 500ml 的 80%酒精的染缸中，染色 1 分钟；5之后将其置入蒸馏水中，浸泡 1 分钟；6取出后置入有 500ml 的 Harris 苏木素的染缸中，染色 5 分钟；7取出切片，快速用流水冲去多余 Harris 苏木素液（3s）。8，将切片快速依次置入有500ml 的 1%盐酸乙醇的两个染缸中，各分化 2 秒，并用流水冲去多余染液，20 分钟；8用蒸馏水冲一下，立即置入有 500mml 的伊红的染缸中，染色 2min；9用蒸馏水快速冲一下，2 秒，之后依次过 80%酒精，2 秒，95%酒精 3 秒，95%酒精5 秒，100%酒精两次，各 5 分钟，二甲苯两次，各 3 分钟；10 取出切片，自然晾干，之后滴加适量的中性树脂封片，并用显微镜观察和摄像。7.2 LFB 染色1使用切片机将小鼠脊髓蜡块切为 3-4m 厚，用毛笔小心将其放入 45水浴锅中展片，并用涂抹过蛋白甘油的载玻片将其捞出，置于 60烘箱中烘干（3 小时）；2将切片依次直接放入有 500ml 的 100%二甲苯的两个染缸中，各 7 分钟；43之后再将切片依次放入有 500ml 的 100%酒精的两个染缸中，各 2.5 分钟；4结束后再将切片依次放入有 500ml 的 95%酒精的三个染缸中，各 2.5 分钟；5再将切片置入有 500ml 的 LFB 染液的染缸中，置于 60水浴锅中 20 分钟，避光放置；6时间到时取出切片，用 95%酒精小心冲洗掉组织及玻片上的多余染液，之后用蒸馏水浸泡 20 分钟，使冲洗更干净；7将切片置入有 500ml 的 0.05%碳酸锂的染缸中，15 秒；8立即取出切片，依次置入有 500ml 的 70%酒精的两个染缸中分色 15 秒，之后用蒸馏水冲洗干净，并用显微镜观察，直至脊髓白质与灰质有鲜明的对比，核为无色，髓鞘在浅灰或是浅蓝色背景下为绿色，如不是，则重复 7，8 两个步骤；9合格后，再次将切片置入有 500ml 的 70%酒精的染缸中分色 15 秒；10 立即取出并置入有 500ml 的醇性伊红的染缸中，染色 30 秒，之后用蒸馏水冲洗干净，并浸泡 10 分钟；11 之后将切片置入有 500ml 的结晶紫的染缸中，染色 1 分钟，之后用蒸馏水冲洗干净，并浸泡 10 分钟；12 依次快速的将切片浸入有 500ml 的 95%酒精，以及有 500ml 的 100%酒精的两个染缸中，各 5 秒；13 再次依次将切片浸入有 500ml 的二甲苯的三个染缸中，各 4 分钟；14 取出切片，自然晾干，之后滴加适量的中性树脂封片，并用显微镜观察和摄像。8. 数据分析及统计学处理采用 SPSS 12.0 统计软件。组间比较用 t 检验。P0.05，差异有统计学意义。二、实验结果与分析1. 临床评分EAE 组 8 只小鼠从免疫后第 15 天开始陆续发病，大约在第 21 天达到发病高峰，发病率为 100%。发病后 EAE 组小鼠的一般状况较正常对照组差，表现为食欲降低、体质量减轻、皮毛不光滑、活动量减少。同时 EAE 组小鼠相继出现神经系统症状，表现为尾5部无力拖垂表现为尾部无力脱垂、步履蹒跚、后肢瘫痪、行动困难，进而发展为四肢瘫痪，最高评分为 4 分（见图 2）。正常对照组小鼠未出现临床神经系统症状，体质量持续增加（见图 1），神经功能评分为 0 分。两组小鼠临床症状打分比较，见图 3，组间p0.01。EAE 组症状显著，与正常对照组小鼠相比，具有显著的统计学差异。 图 1 对照组鼠 图 2 双后肢瘫痪（4 分） control 图 3 小鼠神经功能评分2 病理学检测结果2.1 H&E 结果EAE 组小鼠的脊髓白质和灰质中均有炎性细胞浸润，但病变分布以脊髓颈腰膨大为主 (见图 4B，箭头所示)，表现为大量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，浸润沿包膜和小血管由外向内延伸。正常对照组小鼠脊髓中未见异常改变（见图 4A）。6(A) (B)图 4 H&E 染色结果注：(A)：为正常的小鼠脊髓切片。(1020)；(B)：为病变的小鼠脊髓切片，箭头示炎性细胞侵润(1020)2.2 LFB 的结果可见 EAE 组小鼠的脊髓有大小不等的片状脱髓鞘区，并形成“空泡”。炎性细胞浸润弥散，灰白质受累，尤以灰白质交界区最重，前索及侧索内均有片状脱髓鞘区（见图5B，箭头所示）。正常对照组小鼠脊髓中未见异常改变（见图 5A）。(A) (B)7(C) (D)图 5 LFB 染色结果注：(A)(C)：为正常的小鼠脊髓切片。(1020)；(B)(D)：为病变的小鼠脊髓切片，箭头示炎性细胞侵润和髓鞘脱落形成“空泡”(1020)三、讨论从鸟类到哺乳动物的多种动物均可成功诱发 EAE 模型，但不同品系的动物敏感性有很大不同。对 MOG3555敏感的动物有：Lewis，DA 大鼠和 C57BL/6(H-2b)，鉴于对 EAE敏感的 Lewis 和 DA 大鼠，价格昂贵、不易获得。C57BL/6(H-2b)小鼠对诱发 EAE 相当敏感，且品系纯正，遗传背景知识全面、丰富，遗传学、免疫学等的研究也较深入，因此小鼠更适用于有关基因、细胞间相互作用和发病机制等领域的研究。用小鼠 MOG3555多肽免疫 C57BL/6 小鼠，产生的 EAE 慢性非缓解性 EAE，其症状与人类 MS 很相似，表现为脊髓、大脑和视神经的炎症和髓鞘脱失。虽然 MOG 在髓鞘蛋白中含量很少，但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层，故具有高度免疫原性。近年来用 MOG诱导的 EAE 逐渐成为国际上研究 MS 的主要模型。固相合成是多肽合成领域的一个重大突破，在合成多肽中具有快速、简便、高效等优点，因此，本实验室研究人员利用改进后的 Fmoc 固相合成法，合成 MOG3555多肽，经 RP-HPLC 纯化后，合成的 MOG3555纯度可达 95%，精肽产率达到 13.58%。本研究中选用的实验动物 C57BL/6 纯系小鼠在国内的来源较为广泛，而且 MOG 多肽的结构明确，并可精确定量，在此基础上建立的 EAE 模型更适合从分子免疫学的角度探讨 EAE 的发病机制。特别值得注意的是，本研究以合成的 MOG3555抗原肽制备8C57BL/6 小鼠 EAE 模型发病率达到 100%，对后续在某些免疫调节相关基因突变型小鼠中制备 EAE 模型，研究这些基因在疾病进程中的作用和设计成为药靶的可能性打下了良好基础。总之，通过对 C57BL/6 小鼠 EAE 模型行为学和病理学的检测，验证了 MOG3555抗原肽的免疫原性。即本实验室采用改进的 Fmoc 固相合成法，可获得具有良好免疫原性的 MOG3555抗原肽，用以制备的 C57BL/6 小鼠 EAE 模型稳定可靠、发病率高，可为进一步研究 MS 免疫学发病机制提供帮助。9参考文献1. Juedes AE,Hjelmstrom P,Bergman CM,et al.Kinetics and Cellular Origin of Cytokines in the Central Nercous System: Insight into Mechanisms of Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein-Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J Immunol,2000,16.4(1):419-426.2. 邢清和，王永铭，郑荣远.影响 EAE 动物模型建立的因素分析.中国临床神经科学.2000，8（4）：305-306.3. 魏岗之，袁锦楣，张津等.神经系统脱髓鞘性疾病.第一版.北京.人民军医出版社,2003,50-51.4. 穆阳. 不同剂量 MOG 抗原免疫诱导小鼠自身免疫性脑脊髓炎模型的比较. 中国实验动物学报 2010, 18.5. 王超. 多发性硬化的 T 细胞研究进展. 中国神经免疫学和神经病学杂志. 2009.16.6. 邢清和. 2000. 影响 EAE 动物模型建立的因素分析. 中国临床神经科学 8.7. Costa O,Divoux D,Ischenko A, et al. Optimization of an animal model of experimental autoimmune encephalomyelitis achieved with a multiple MOG3555 peptide in C57BL6/J strain of miceJ. J Autoimmun, 2003, 20(1): 51-61. 8. Han X, Gu J. Application of Solid-phase Peptides SynthesisJ. Progress in Pharmaceutical Sciences, 2004, 28(1)