生物电子显微镜考试.docx

华南农业大学研究生期末考试答：1.透射电子显微镜主要由电子光学系统、真空系统和供电系统三大部分组成。其中 电子枪照明系统 聚光镜 样品室成像系统 中间镜电子光学系统 物 镜 投影镜 观察室 观察与记录系统 照相室 曝光装置 机械泵 油扩散泵真空系统 管道及自动阀门系统 冷阱、预抽室、真空干燥器 真空检测系统 交直流电源 高压电源电子学系统 透镜电源 真空电源与自动控制束偏转、消散器等电源及控制安全系统和辅助电源透射电子显微镜的功能及其应用为：利用质厚衬度（又称吸收衬度）像，对样品进行一般形貌观察。利用电子衍射、微区电子衍射、会聚束电子衍射等技术队样品进行物相分析，从而确定材料的物相、品系，甚至空间群。利用高分辨电子显微术可以直接“看”到晶体中原子或原子团在特定方向上的结构投影这一特点，确定晶体结构。利用衍衬像和高分辨电子显微像技术，观察晶体中存在的结构缺陷，确定缺陷的种类、估算缺陷密度。利用TEM所附加的能量色散X射线谱仪或电子能量损失谱仪对样品的微区化学成分进行分析。利用带有扫描附件和能量色散X射线谱仪的TEM，或者利用带有图像过滤器的TEM，对样品中的元素分布进行分析，确定样品中是否有成分偏析。扫描电子显微镜的主要结构：镜体（含样品室）电子枪，与TEM相同聚光镜，与TEM相同偏转线圈，特有部件物镜，会聚电子束光栏，控制束斑大小消像散器，用于消除像散样品室，比TEM大信号收集系统：各种信号探测器和放大器构成。图像显示与记录系统 观察部分：观察荧光屏和闭路电视记录部分：拍照荧光屏、照像机和电脑储存真空排气系统：与TEM基本相同，多数只有机械泵和油扩散泵，少数有离子泵。电子学系统：与TEM相同, 但高压较低，高达40kv,低达0.51kv.扫描电子显微镜的功能及其应用为： 扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体。（细胞、组织）表面的立体构像，可摄制成照片。主要用于：观察纳米材料 进口材料断口的分析 直接观察大试样的原始表面 观察厚试样 观察试样的各个区域的细节 在大视场、低放大倍数下观察样品 进行从高倍到低倍的连续观察 观察生物试样 进行动态观察 从试样表面形貌获得多方面资料 2. 凡用两种或两种以上固定剂先后对材料进行固定的，称双固定，常见的有醛锇双固定法。这种固定方法使用的两种固定剂是戊二醛和四氧化锇。戊二醛的性质和作用原理：它是一种五碳醛，含有两个醛基（分子式为C5H8O2） 分子量100.12，HP值4-5,商品为2550的水溶液，高温等都会失去醛基，降低固定效果。戊二醛的优点是对糖原、糖蛋白、微管、内质网和细胞基质等有较好的固定作用，对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保存某些酶的活力，长时间的固定(几周甚至12个月)不会使组织变脆。缺点是不能保存脂肪，没有电子染色作用，对细胞膜的显示较差。四氧化锇的性质和作用原理：四氧化锇(OsO4)是一种非电解质强氧化剂，分子量254.2，商品为浅黄色结晶体。其优点为a 对氮有较大亲和力，能固定蛋白质b能保存糖原c能固定不饱和脂肪酸生成四氧化锇二脂化合物；d具有电子反差作用；e对缓冲液要求不严格；f对磷脂蛋白有良好的固定作用。其缺点为a 渗透速度慢；b 不能固定糖元、核酸和微丝；c 固定时间不能太长，否则样品变脆；会使酶失活，不能用于组织细胞化学样品的固定；d 毒性大，对人体有害。它与氮原子有较强的亲和力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应，但不能固定天然DNA、RNA及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定的样品图象反差较好。锇酸常用浓度为1%，固定时间视环境温度而有所不同，一般在夏秋为1小时，冬春为1.52.0小时。缺点是固定时间过长容易造成组织发脆，不容易切片。织块固定常规采用戊二醛锇酸双重固定法。分预固定和后固定，中间用磷酸缓冲液或相应的缓冲液漂洗。前固定用2.5%戊二醛固定2小时以上、后固定用1%锇酸固定液固定12小时，pH7.27.4。固定完毕，用缓冲液漂洗30分钟后进行脱水。3.导电处理的目的：使样品表面导电。提高二次电子发射率。增强样品表面耐受电子轰击能力。防止来自样品内部的信号干扰。 导电处理的方法：(一)、金属镀膜法a真空镀膜(蒸发) 是在高真空下将金属材料加热熔化后，复盖在样品表面形成导电层的一种方法。使用仪器为真空蒸发仪，放入纯金和碳棒，蒸发点与样品距离在710 cm，加热时间12 min，电流1520Am，真空度在110-4乇以上时先镀碳后镀金，并进行旋转镀膜。b离子镀膜(溅射) 在低真空状态下利用离子溅射仪对扫描电镜样品进行覆膜的方法。在离子溅射仪的结构上有一个阴极金靶，下有一个阳极样品座。在阴极金靶上加高压、电流与阳极形成电场，从而使气体电离加速飞向阴极金靶，并击发出带负电位的金粒子而飞向阳极样品的表面上，形成粒子很细厚度均匀的导电层。(二)、组织导电法这种方法是利用含重金属的液体，浸透生物样品，使样品内外物质与重金属结合，从而使整个样品块改善导电能力。常用处理液为：(1)碘化钾组织导电液：碘化钾2g碘0.2g双蒸馏水100 ml2.5%戊二醛10 ml(2)硝酸银组织导电液：用0.1m磷酸缓冲液配的1.53%硝酸银溶液(暗环境保存)。(3) 丹宁酸组织导电液：用2%4%丹宁酸加8%戊二醛。4.透射电镜样品制备具体方法及过程：取材：取新鲜材料在滴有4%戊二醛固定的旧相纸上，用锋利刀片（用酒精棉球擦去油脂）切去1mm3的样品块，迅速转移在放有4%戊二醛固定液的青霉素小瓶中固定4小时以上（04条件下）、（戊二醛用量约为样品的40倍）。植物材料一般要放在真空机中抽真空，直至样品下沉为止，或将样品和固定剂在瓶中用注射器反复抽气直至样品下沉为止。固定与漂洗：采用双固定技术前固定，上述4%戊二醛04条件下固定4小时以上或过夜。漂洗，0.1M磷酸缓冲液漂洗11.5小时，中间换新鲜溶液56次。后固定，1%四氧化锇固定。动物材料不超过2小时，植物材料一般可超过2个小时，甚至过夜。操作应在通风橱中进行。漂洗：同。脱水：经漂洗后的样品，50%70%（可过夜）80%90%无水酒精（或丙酮，两次）脱水，每级1015分钟。过渡：用环氧丙烷或丙酮二次（用丙酮脱水的样品不用此过程），每次1015分钟。渗透：用环氧丙烷与环氧树酯包埋剂的混合液进行逐级渐进的渗透，比例为3：11：11：3纯包埋剂，时间分别为1小时2小时（或过夜）2小时4小时（或过夜），植物材料可相应长些，动物材料可相应短些。包埋：配制新鲜的Epon812*包埋剂2030ml，将样品用包埋剂包埋在模具中，并放入标签。聚合：将包埋好的样品放入恒温箱中45聚合24小时，然后再在60聚合24小时。聚合好的包埋块，取出置于干燥器中保存备用。以上即为透射电镜样品制备具体方法及过程。5. 扫描电镜样品制备具体方法及过程：取样：用锋利的刀片切取新鲜的生物试样，样品大小为35mm2，放入蒸馏水（生理盐水、缓冲液）中浸洗510分钟。较难清洗的样品可连同试样瓶一起放在超声波清洗器中12分钟。然后用吸管除清洗液。前固定：将清洗过的样品加入4%戊二醛（用量为1：20），放在4冰箱内停留4小时左右（具体时间视样品情况而定），然后吸除前固定液，进行液洗。浸洗：经前固定的样品加入磷酸缓冲液冲坡，停留1015分钟。然后再更换浸洗液，重复3次。后固定： 将浸洗过的样品加入1%的锇酸（用量为1:10），在4冰箱内停留2小时左右（植物样品可时间长些）。然后吸去后固定液，再加入磷酸缓冲液浸洗34次，每次1015分钟（以上的操作应在通