高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用同时测定鸡肉与鸡肝中的7种砷形态.pdf

第 5期 杨丽君 等 高效液相色谱一 电感耦合等离子体质谱联用 同时测 定鸡 肉与鸡 肝 中的 7种 砷形 态 3 9 5 标 检测 法 G B1 3 0 7 9 9 1 检 测 了湖 南省 6个 地 区 2 0 种 猪 鸡 配 合 饲料 中总 砷 的 含量 结 果 显 示 8 5 的 样 品中总 砷 含 量 超 标 L a s k y等 研 究 发 现 美 国 市 场上 仔 鸡 肉中砷 残 留量平 均 为 0 3 9 mg k g 按 美 国人均 每 天摄人 6 0 g鸡 肉计算 每 天 通 过鸡 肉摄 入 的砷量 就 高 达 1 3 8 5 2 4 g 砷 是 一 种 毒 性 物 质 与多种癌症及疾病的发病有关 但是砷 的毒性不 仅与元素总量有关 还 与元素存在 的化学形态 密切 相关 如亚砷酸根和砷酸根等无机砷的毒性较大 国 际癌症 研究 委 员会 已将 无 机 砷 列 为 强致 癌 性 物 质 而 一 甲基砷 二 甲基 砷 砷甜 菜碱 和砷 胆碱 等有 机砷 毒性 很小 因此 通过 检测 砷 制剂原 形 和总 砷含 量来 监测 砷 制剂 的使 用 已不 能满 足 当前形 势下 的需 求 开发一种可 同时测定多种砷形态的分析方法具有重 要 的现 实 意义 目前 砷形态分析方法文献报道的大多为气相 色 谱 毛 细 管 电 泳 和 高 效 液 相 色 谱 法 H P L C 等分离技术与电感耦合等离子体质谱 I C P MS 联用 气相色谱法需衍生化 前处理操作 较 复杂 毛 细管 电泳 法虽 然具 有分 离效 率高 样 品需 要量少和分离速度快等优点 但是与电感耦合等离 子体质谱联用对接 口的要求较高 高效 液相色谱可 以将不同砷形态有效分离 电感 耦合 等离子体质谱 具有 抗干 扰 能力 强 灵 敏度 高 和线性 范 围宽 的特 点 因此 HP L C I C P MS已成为砷元素形态分析 中最具 有应 用前 景 的技术 之 一 已广 泛应 用 于 中药 海 产 品 和 水 等 样 品 但 未 见 应 用 于 鸡 肉和 鸡肝 本 研 究 采 用 人 工 胃液 前 处 理 技 术 和 HP L C I C P MS建 立 了 同时分 析 鸡 肉和鸡 肝 中 7种 主 要 有 机砷 和无 机砷 形态 的分 析方 法 1 实验部分 1 1仪器 试 剂与 材料 1 2 0 0高效液相色谱仪 7 5 0 0 c x电感耦合等离子 体质谱仪 色谱系统控制应用 I n s t r u me n t o n l i n e软 件 I C P MS系统控制应用 T o p软件 色谱数据处理 应 用 C h r o ma t o g r a p h y D a t a A n a l y s i s软 件 A g i l e n t 公 司 美 国 Mi l l i Q G r a d i e n t超 纯 水 净 化 器 Mi l l i p o r e公 司 美 国 I K A V o r t e x G e n i u s 3旋 涡混匀器 I K A公 司 德 国 C R 2 2 G N M 高速冷 冻 离心 机 日立 公 司 日本 标 准 品 亚砷 酸根 a r s e n i o u s a c i d A s 砷酸 根 a r s e n i c a c i d A s V 砷 胆 碱 a r s e n o c h o l i n e A s C 砷 甜菜 碱 a r s e n o b e t a i n e A s B 一 甲基 砷 mo n o me t h y l a r s o n i c a c i d MMA 和 二 甲 基 砷 d i me t h y l a r s i n i c a c i d D MA 购 于 中 国计 量 研 究 院 阿散 酸 P a r s a n i l i c a c i d A S A 9 8 购 于 上 海 晶 纯 试 剂 有 限 公 司 甲 醇 H P L C 级 德 国 C N W 科 技公 司 胃蛋 白酶 S i g ma公 司 美 国 碳 酸 铵 优 级纯 天 津 市 光 复 精 细化 工 研 究 所 2 5 氨 水等 其他试 剂 均为 分析 纯 实 验用 水 为去离 子水 人工胃液 按 中华人民共和 国药典 2 0 0 5版 制 备 取稀 盐 酸 1 6 4 mL 取 浓盐 酸 3 2 4 mL 用 去 离 子水 稀 释 至 1 0 0 0 mL 加 去 离 子 水 约 8 0 0 mL 胃 蛋 白酶 1 0 g 摇匀后 加 去 离 子水 稀 释 成 l 0 0 0 mL 即得人工 胃液 1 2样 品前 处理 准确 称取 2 O 0 g 精 确 到 0 0 1 g 鸡 肉或 鸡 肝 样 品于 5 0 mL聚丙 烯 离 心 管 中 加 人 人 工 胃液 2 0 mL 漩 涡 混匀 3 0 S 3 7 超 声 提 取 2 h 于 0 6 0 0 0 r mi n条件下冷冻离心 5 mi n 收集上层清液 过 0 4 5 m 滤膜 供 H P L C I C P MS测定 1 3 HP LC I CP MS条 件 1 3 1 高效 液相 色谱 条件 色 谱 柱 D i o n e x I o n P a c A S 1 9 2 5 0 mE 4 mm 5 tx m 阴离 子分 析柱 柱温 3 0 进 样 量 2 0 L 流动 相 A 水 流 动 相 B 5 0 mmo l L碳 酸 铵 p H 9 7 梯 度 洗 脱 0到 l 0 mi n 流 动 相 B 由 0 逐 渐 上 升 到 1 0 0 l 0到 1 8 mi n 流 动 相 B 由 1 0 0 逐渐 下 降到 0 运行 时 间 2 0 mi n 1 3 2 电感 耦合 等 离子体质 谱条 件 同心雾化器 外部安装 P e l t i e r 半导体冷却雾室 系统 雾化室 温 度 2 炬 管 1 5 mE 采样 锥 截 取 锥 Ni 1 0 0 4 采样深度 8 1 mE 高频等离子体 发 射功 率 1 5 0 0 W 载气 氩 气 9 9 9 9 9 载 气 流 量 0 6 5 L mi n 载 气补偿 气 流量 0 3 8 L mi n 等离 子气流量 1 5 L rai n 辅助气流量 1 0 L mi n 蠕动 泵 0 3 r mi n 2结果与讨论 2 1 前 处 理条件 优 化 2 1 1 提取 液 的选择 优 化 7种 砷 形 态 中包 括 无 机 砷 和 有 机砷 提 取方 法 大多采用 甲醇 水或一定 比例 的甲醇一 水混合溶液 本 实验在 国内外研 究 的基 础 上 比较 了不 同 提取 溶 剂的提取效率 结果表明 含水 比例高可显著提高回 收率 但鸡肉样品中蛋白质含量较多 且 A s 1 l I 易 与蛋白上 的巯基结合 甲醇可很好地去除样 品基质 中的蛋白质 但 是并不能够将 A s 完 全提取 出 来 采用人工 胃液作为提取溶液 人工 胃液可将样 3 9 6 色 谱 第 2 9卷 品 中的蛋 白消化 使 A s 与 蛋 白上 的巯基结 合键 断裂 而游 离 出来 达 到 了很 好 的提取 效果 各砷 形态 回收率均达到 8 0 以上 蛋 白质沉淀好 提取液 澄 清 完全满足提取要求 2 1 2 提 取 方式 的选择优 化 一 般来 说人 工 胃液 消化 可 采 用 两 种方 式 振荡 过夜 和超声 提 取 考 虑 到振 荡 过 夜 所 需 时 间较 长 并且有 机 砷不稳 定 易于转 化 因此本 实验 采用 3 7 超声 提取 方式 实验分别考察了鸡肉和鸡肝样品基质中超声提 取时间对 7种砷形态提取效率的影响 见 图 1 由 图 1 a可 知 在 鸡 肉样 品 中 超 声 时 间对 A s B A s C MMA A s V 和 AS A的 回收率影 响 不大 回收 率均 可达 到 8 0 以上 而 对 D MA和 A s 超声 提取 3 0 mi n时回收率均在 7 0 左右 DMA在超声 6 0 mi n 时回收率达到最大值 A s 在超声 1 2 0 mi n时回 收率达 到最大 值 随着超 声时 间 的进 一 步增长 DMA和 A s 等砷形态的回收率有所 降低 因此 实验选 定鸡 肉样 品 的最佳 超声 时 间为 2 h 图 1 超 声时间对 a 鸡 肉和 b 鸡肝样 品中7种砷 形态 提 取效 率的影响 Fi g 1 I n flue nc e o f ul t r a s o ni c t i m e on t he e xt r a c t i o n e f fi c i e n c y o f 7 a r s e n i c s p e c i e s i n a c h i c k e n mu s c l e a n d b c h i c k e n l i v e r 由图 1 b可知 在鸡肝 样 品 中 超声 时问对 A s B A s C MMA D MA A s V 和 A S A 的 回收率 影 响不 大 回收率均可达到 8 0 以上 而 A s I l I 在超声提 取 3 0 mi n时回收率只有 3 0 左右 随着 时间的增 长 A s I U 在超声 1 2 0 mi n时回收率达到最大值约 为 8 5 因此选 定鸡肝 样 品的最佳 超声 时 问为 2 h 由于部分 砷 形 态 不 稳 定 2 h的提 取 时 间很 难 保证 在提 取过程 中砷 形态 不发 生转 化 人 工 胃液对 于含 蛋 白较多样 品中 A s 具 有 良好 的提取 效果 但是 As 与蛋白上的巯基结合 时间短不足以完 全将样 品消化 而将 A s I l I 有效 提取 出来 此外 当 需要 同 时处理 大批 样 品 时 该 方法 简 单 的 前处 理 操 作同时具备效率高的特点 采取 3 7 超声提取 可 有效 防止 高温造 成 的砷形 态 的转 化 实 验 中 良好 的 添加 回收率进一 步保 证 了方法 的可 靠性 2 2质谱 分析 条件 的优化 联机前使用 Ag i l e n t 公司提供的调谐液 L i Y C o C e和 T l 含量为 1 g L 对仪器进行调谐 以保 证仪器的最佳状态和仪器状态的稳定性 砷的电离 能较 高 难 以 电离 采 用 高 电离 能 1 5 0 0 W 保 证 各 砷形 态能 完全解 离 同时 调节采 样深 度 载气 流速 以 及炬管位置 提高灵敏度 以及降低氧化物和双电荷 的比率 满足氧化物产率为 C e O C e 1 5 双电 荷产率 C e C e 2 联机 后监测 质量 数 3 5 7 2 和 7 5 保 证 系统 内无 质 量 数 3 5和 7 5干 扰 且 质 量 数 7 2达最 高灵 敏度 2 3 色谱 分离 条件 的优化 2 3 1色谱柱 的选 择 根 据 各 砷 形 态 的 理 化性 质 选 用 C 色 谱 柱 和 阴离子 分 析柱对 7种砷 形 态 的分 离度 和灵 敏度进 行 了对 比试 验 结 果 表 明 C 色 谱 柱 和 阴 离子 分 析 柱 对于各砷形态的分离效果和检测灵敏度存在很大差 异 c 色谱柱不 能有效地将砷 胆碱和砷 甜菜碱分 离 而阴离 子分 析柱 可 以将 7种砷 形 态 完 全分 离 并 且具有 较 高 的灵 敏度 见 图 2 2 3 2 流动相 的选 择 与优化 流 动 相 的种 类 浓 度 和 p H 对 各 砷形 态 的分 离 和保留具有显著影响 实验发现磷酸盐体系不能很 好地 分离砷 胆碱 和 砷 甜菜 碱 而碳 酸 铵 体 系 可很 好 的分离 浓度越低分离效果越好 但分析时间会相应 增长 为缩短分析时间 并保证分离效果 最终采用 5 0 mmo l L碳酸铵 p H 9 7 和水作为流动相 采用 梯度 洗 脱方 式 在 2 0 mi n内实 现 了 7种 砷 形 态 的 良 好分离 并且峰形对称 尖锐 灵敏度高 见图 2 第 5期 杨丽君 等 高效液相色谱一 电感耦合等离子体质谱联用 同时测定鸡 肉与鸡肝中的7种砷形态 3 9 7 1 2000 1 000 0 8 0 0 0 6 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 0 l 2 0 0 0 1 0 0 0 0 8 0 0 0 6 0 0 0 4 0 0 0 2000 O 0 2 4 6 8 1 0 l 2 1 4 1 6 1 8 2 0 f m l n 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 l 6 1 8 2 0 f mi n 图 2 加标 a 鸡 肉和 b 鸡肝样品的 HP LC I CP MS 色谱 图 添加水平 1 0 p g k g F i g 2 HP L C I C P MS c h r o ma t o g r a ms o f a c h i c k e n mu s c l e a n d b c h i c k e n l i v e r s a mp l e s s p i k e d wi t h 1 0 p g kg 7 a r s e ni c s p e ci e s P e a k i d e n t i fi c a t i o n s 1 A s C 2 A s B 3 D MA 4 As n 1 5 MMA 6 As V 7 AS A 2 4 线 性范 围和定 量 限 在 1 5 0 p g k g范 围内配制 1 2 5 l 0 2 0和 5 0 g k g的 7种 砷 形态 的混 合标 准溶 液 以各砷 形态 的峰 面 积 Y 为 纵 坐 标 相 应 砷 形 态 的 含 量 X i x g k g 为 横 坐标 绘 制 各 砷 形 态 的标 准 校 正 曲线 结果 表 明 在此 浓度 范 围 内 7种 砷 形 态 的 标 准校 正 曲线 线 性 良好 相关 系数 均 大于 0 9 9 9 见 表 1 表 1 7种砷化合物的线性回归方程及相关系数 r Ta bl e 1 Li ne a r r e g r e s s i on eq ua t i ons a nd c or r e l a t i on c o e f f i c i e n t s r o f 7 a r s e n i c s p e c i e s Y pe ak a r e a X c o nt e n t g kg 在标 准 添 加 的 最 低 质 量 浓 度 点 1 g k g水 平 下 7种砷形态的信噪比 均大于 1 0 并且具有 较好 的 回收率 见表 2 故 确 定 7种 砷 形 态 的定 量 限为 1 g k g 表 2 7种砷 形态的添加回收 率及其相对 标准偏差 RS D n 6 Tab l e 2 S pi k ed r e c o ve r i e s a nd t he i r r e l at i ve s t a n d a r d d e v i a t i o n s RS Ds f o r 7 a r s e n i c s p e c i e s l 6 3 9 8 色 谱 第 2 9卷 2 5回收率 和精密 度 选用 不 含 7种 待 测 砷 形 态 的 空 白样 品 分 别 添 加 1 2和 l 0 p b g k g 3个水平 的 7种砷形态 的混合 标 准溶 液 4 放 置 过 夜 按 1 2节 处 理 样 品 分 析 测定并计算其回收率和精密度 测得平均回收率 n 5 为 8 4 3 1 0 5 6 相 对 标 准偏 差 为 1 4 4 2 见表 2 2 6实 际样 品分析 对从市场上购买 的 1 0只活鸡的肉和肝脏样品 进行 分析 检 出含 有砷 甜菜 碱 二 甲基 砷 亚 砷 酸 根 和 砷酸 根等 砷形态 阳性鸡 肉样 品 见 图 3 a 中二 甲 基 砷 含 量 为 3 7 g k g 亚 砷 酸 根 含 量 为1 4 tz g k g 砷 酸 根 含 量 为 4 1 p b g k g 阳 性 鸡 肝 样 品 见 图 3 b 中砷甜 菜碱 含量很 低 未达 到定量 限 二 甲 基 砷 含 量 为 4 9 g k g 亚 砷 酸 根 含 量 为 2 0 g k g 砷酸 根含 量为 3 8 g k g 阳性 鸡 肉和鸡肝 样品的 H P L C I C P MS色谱 图见图 3 6 0 0 0 4 000 2 0 0 0 0 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8 2 0 t mi l l t rain 图 3阳性 a 鸡 肉和 b 鸡肝样品的 HP L C I C P MS色谱图 Fi g 3 HPLC I CP M S c hr omat o gr a m s f o r po s i t i ve s a mp l e s o f a c h i c k e n mu s c l e a n d b c h i c k e n l i ve r P e a k i d e n t i f i c a t i o n s 1 A s B 2 D MA 3 A s 4 A s V 3 结论 本研 究采 用人 工 胃液 消化 超 声提 取 法 处 理样 品 有效 提高 了蛋 白含量 较 高 的样 品基 质 中 A s 的提取效率 高效液相色谱对砷形态的良好分离以 及电感耦合等离子体质谱所具有的抗干扰能力强 灵敏 度高 和线性 范 围 宽 的优 势 为建 立 同 时分 析 鸡 肉和鸡肝 中 7种 主要 有机 砷和无 机砷 的形 态分 析方 法 提供 了技术 支持 该方 法前 处理 简单 灵敏 度高 重 现性好 实 用性强 能 满足 国 内外 对砷形 态分 析 的 要 求 适 用 于动物 源性食 品中砷形 态分 析检测 致谢 特别 感 谢 安 捷 伦 科 技 有 限公 司 中 国 陈 玉 红老 师在课 题进行 中给予 的帮 助和指 导 参考 文献 1 Y u a nH C h e n J F X i a n g J Z e t a 1 Hu n a n F e e d 袁慧 陈 竞峰 向建洲 等 湖南饲料 2 0 0 0 3 2 2 L a s k y T S u n W Y K a d r y A e t a 1 E n v i r o n He a l t h P e r s pe c t 2 0 0 4 1 1 2 1 1 8 3 C h e n J Z h o u L M Qu G L C h i n e s e J o u r n a l o f A n a l y t i c a l C h e mi s t r y 陈静 周黎 明 曲刚 莲 分 析 化 学 2 0 0 1 2 9 1 1 1 2 7 6 4 Y a n g G D Xu J H Z h e n g J P T a l a n t a 2 0 0 9 7 8 4 7 1 5 Z h a o Y Q Z h e n g J P Y a n g M W e t a 1 C h i n e s e J o u r n a l o f C h r o ma t o g r a p h y 赵 云 强 郑 进 平 杨 明 伟 等色 谱 2 01 1 2 9 2 1 1 1 6 B H y me r C C a r u s o J A J C h r o ma t o g r A 2 0 0 4 l 0 4 5 1 7 B a i J L u X F L e X C e t a l C h i n e s e J o u r n a l o f C h r o