细菌生理生化实验.doc

精品文档细菌生理生化试验小木虫微生物生理生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区分的微生物。因此微生物生理生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物鉴定中常用的生理生化反应如下所示：(一) 糖、醇发酵试验原理：不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号：+）、产气（符号：），培养基由紫（蓝）变黄（指示剂溴甲酚紫或溴百里酚蓝由紫或蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：），培养基仍为紫（蓝）色。培养基配制：一般细菌常用休和李夫森二氏培养基：蛋白胨：2g ，K2HPO4 :0.2g ，NaCl:5g ，糖（醇、糖苷）：1% ，水洗琼脂：56g，蒸馏水：1000mL，PH:6.87.0，溴百里酚蓝：1%水溶液3mL(先用少量的95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)。先调PH后再加指示剂。芽孢杆菌培养基配制：(NH4)2HPO4:1g ，MgSO4:0.2g ，KCl:0.2g ，酵母膏：0.2g ，糖（醇、糖苷）：1%水洗琼脂：56g ，蒸馏水：1000mL ，溴甲酚紫：0.4%乙醇液2mL，PH:6.87.0。先调PH后再加指示剂。将以上培养基分装试管，培养基高度约为45cm ，115灭菌20min。测定的糖（醇、糖苷）类可以包括：葡萄糖、蔗糖、甘露糖、乳糖（1.5%）、半乳糖（1.5%）、D-山梨醇、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、纤维二糖、木糖、水杨苷等。注意：以上亦可用液体培养基。接种和观察结果：用1824h的幼龄菌种，用穿刺针接种于培养基中，适温培养1d，3d，5d后观察，颜色变黄为阳性，不变为阴性；有气泡产生为产气。结果记录：产酸：+，产气：，不产酸长气：- 。(二) 淀粉水解试验原理：某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。培养基配制：牛肉膏5g；NaCl:5g；可溶性淀粉5g；琼脂:20g；蒸馏水1000mL。PH:7.2121灭菌20min。试验方法：以1824h的纯培养物，点接于淀粉琼脂平板（一个平板可分区接种）或直接移种于淀粉肉汤中，于361培养2448h，或于20培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。结果记录：分解：+，不分解：-。(三) V-P试验原理：菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。培养基配制方法：蛋白胨5g；葡萄糖5g；NaCl(K2PO4):5g；蒸馏水：1000mL；PH:7.07.2，分装试管，毎管装约45cm，115灭菌20min。试剂：40%NaOH(或KOH)，a-萘酚。试验方法：将试验菌接种于上述培养基，于361C培养4天、培养液2.5ml先加入a萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动25min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或361C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。结果记录：阳性：+，阴性：- 。(四) 甲基红（Methyl Red）试验原理：有些细菌能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。培养基配制方法：与V-P试验培养基一致。试剂：甲基红:0.1g，95%乙醇：300mL，蒸馏水：200mL。试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于361C或30C（以30C较好）35天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂12滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阳性、即可判定结果。结果记录：阳性：+，阴性：- 。(五) 菌膜形成试验有些菌在液体培养基中能形成菌膜，利用这一特征可进行不同细菌的区别。培养基配制方法：蛋白胨：5g；氯化钠：5g；牛肉膏：10g；蒸馏水：1000mL；pH ：7.2。121灭菌1530min。试验方法：接种后于30培养24小时，观察培养物是否有菌膜形成，有菌膜为阳性。(六) 明胶（Gelatin）液化试验原理：有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。培养基配制方法：蛋白胨：5g，明胶：120g，蒸馏水：1000mL。PH:7.27.4，分装试管，毎管装约45cm，115灭菌20min。试验方法：挑取1824h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于2022培养714天。明胶高层亦可培养于361。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。否则为阴性。(七) 尿酶（Urease）试验原理：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。培养基配制方法：蛋白胨：1 g ；NaCl：5 g ；KH2PO4 ：2 g ；葡萄糖 1 g ；琼脂：15 g；酚红：0.012g；蒸馏水 1000 ml。除酚红外，溶解上述成分，并调节PH为6.86.9，然后加入酚红指示剂，使培养基呈橙黄色，分装，115灭菌20min。待培养基冷至50左右，加入预先过滤除菌的20%尿素水溶液，使其终浓度为2%。试验方法：挑取1824h待试菌培养物大量穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，培养14d观察结果，如为阴性应继续培养一下，作最终判定，变为粉红色为阳性。(八) 氧化酶（Oxidase）试验原理：氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。试剂：试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂12滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。(九) 过氧化氢酶试验(触酶试验)具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。方法：直接滴加3过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察，有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。(十) 精氨酸脱羧基酶试验培养基： K2HPO4: 1.0g NH4Cl: 1.0g MgSO4: 0.2g 酵母膏： 0.2g 葡萄糖： 1.0g DL-精氨酸： 1.0g 1.6%溴甲酚紫： 1mL H2O: 1000mL pH: 6.7-6.8分装试管，115灭菌30min。接种后置30培养24h，紫色者为阳性，呈黄色者为阳性。(十一) 卵磷脂酶试验：培养基： 蛋白胨： 10g 酵母膏： 3g NaCl: 5g 琼脂： 20gH2O: 1000mL pH: 7.0-7.2分装三角瓶，121灭菌30min。用75%乙醇将新鲜鸡蛋表面消毒，并用经火焰灭菌的镊子将鸡蛋打一个孔，倾去蛋清，然后用5mL无菌吸管吸出卵黄，加入到融化后冷却至50左右的培养基中，使卵黄含量为培养基总体积的2-3%，混匀后倒平板，点接菌种，30培养24h后观察，菌落边缘出现浑浊圈者为卵磷脂酶阳性。(十二) 蛋白质水解试验：（即明胶水解试验）培养基： 牛肉膏： 5.0g 蛋白胨： 1.0g 明胶： 4.0g 葡萄糖： 1.0g NaCl： 5.0g K2HPO4: 0.5g KH2PO4: 0.5g琼脂： 20g H2O: 1000mL分装三角瓶，121灭菌30min。将培养基融化后倒平板，并点接菌种，30培养2d，用酸性升汞溶液倾注于平板表面，如果菌落周围出现透明圈，则为阳性。(十三) 七叶苷试验（七叶灵试验）：培养基： 牛肉膏： 10g 七叶灵： 5g 琼脂： 20g H2O： 1000mL pH: 自然分装三角瓶，121灭菌30min。另配5%FeCl3水溶液，单独灭菌。培养基融化后，先将每个平板加上FeCl3溶液二滴，然后倒培养基混匀，凝固后点接菌种，30培养2-3d观察。菌苔周围出现深褐色区者为阳性反应。(十四) Tween 80试验：培养基： 蛋白胨： 10g NaCl: 5g CaCl2: 0.1g 琼脂： 9g H2O: 1000mL分装三角瓶，121灭菌20min。冷却至50，加入Tween 80至终浓度体积分数为1%，倒平板，点接测试菌，35培养7d。有晕圈者为阳性。(十五) 水杨苷试验：培养基: K2HPO4: 1.0g NH4Cl: 1.0g MgSO4: 0.2g 酵母膏： 0.2g 1.6%溴甲酚紫： 1mL H2O: 1000mLpH: 7.0-7.2水杨苷： 5.0g分装试管，115灭菌30min。接种后置30培养，培养基变黄者为糖发酵阳性。(十六) 实施几丁质利用实验：胶体几丁质： 10.0g蛋白胨： 3.0gMgSO4: 0.5gFeSO4: 0.01gKH2PO4: 0.3gK2HPO4: 0.7gZnSO4： 0.001g琼脂： 20gpH: 7.2-7.4H2O: 1000mL分装三角瓶，121灭菌15-30min。冷却至50倒平板，点接菌种，30培养适当的时间，能生长并且在菌落周围形成透明圈的为阳性。胶体几丁质的制备：称取5g几丁质加20mL丙酮，100mL浓盐酸，在4下电磁搅拌24h，使几丁质充分溶解。然后用玻璃纤维过滤到500mL的去离子冰水中，同时搅拌，用离心的方法将其洗至pH值近中性，最后加适量去离子水高压灭菌后保存。(十七) 精氨酸脱羧基酶试验培养基： K2HPO4: 1.0g NH4Cl: 1.0g MgSO4: 0.2g 酵母膏： 0.2g 葡萄糖： 1.0g DL-精氨酸： 1.0g 1.6%溴甲酚紫： 1mL H2O: 1000mL pH: 6.7-6.8分装试管，115灭菌30min。接种后置30培养24h，紫色者为阳性，呈黄色者为阳性。(十八) 卵磷脂酶试验：培养基： 蛋白胨： 10g 酵母膏： 3g NaCl: 5g 琼脂： 20gH2O: 1000mL pH: 7.0-7.2分装三角瓶，121灭菌30min。用75%乙醇将新鲜鸡蛋表面消毒，并用经火焰灭菌的镊子将鸡蛋打一个孔，倾去蛋清，然后用5mL无菌吸管吸出卵黄，加入到融化后冷却至50左右的培养基中，使卵黄含量为培养基总体积的2-3%，混匀后倒平板，点接菌种，30培养24h后观察，菌落边缘出现浑浊圈者为卵磷脂酶阳性。(十九) 蛋白质水解试验：（即明胶水解试验）培养基： 牛肉膏： 5.0g 蛋白胨： 1.0g 明胶： 4.0g 葡萄糖： 1.0g NaCl： 5.0g K2HPO4: 0.5g KH2PO4: 0.5g琼脂： 20g H2O: