食品生物专业技术导论.docx

食品生物技术：是现代生物技术在食品领域中的应用，是指现代生命科学的研究成果为基础，结合现代工程技术手段和其他学科的研究成果，用全新的方法和手段设计新型的食品和食品原料基因工程：又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品基因工程的理论基础：1、不同基因具有相同的物质基础2、基因是可切割和转移的3、多肽与基因之间存在对应关系4、基因的遗传信息是可以遗传的基因工程的主要内容：1、在供体细胞中用限制性内切酶切割基因，以分离出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制备运载体（质粒、病毒或噬菌体）2、把获得的目的基因与制备好的运载体用DNA连接酶连接组成重组体3、把重组体引入宿主细胞4、筛选、鉴定出含有外源目的基因或个体工具酶：限制性内切酶、核酸酶、连接酶、聚合酶型限制性内切酶：不能专门切割DNA的某个特殊位点（未大量使用）型限制性内切酶：可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段（广泛应用） 同裂酶：来源不同，具有相同的识别序列 同尾酶：识别序列不同，切割后，具有相同的DNA黏性末端型限制性内切酶：具有独特的识别方式和切割方法，如Mbo基因载体：质粒（能自主复制的双链DNA分子，在细菌中独立于染色体之外存在：具有复制起点 相对分子质量尽可能小 有单一的限制性内切酶识别位点 有一个或多个选择标记基因）、植物病毒、噬菌体理想的基因工程载体具备的特征：1、 能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制，在外源DNA插入其DNA复制的非必需区内，仍能保持稳定的复制状态和遗传特性2、 易于从宿主细胞中分离，并进行纯化3、 有适当的限制性内切酶单一酶切位点4、 具有能够直接观察的表型特征质粒载体pBR322：大小为4363bp，含有两个抗生素抗性基因（抗氨苄青霉素和抗四环素），还有单一的Bam H、Hind 和Sal的识别位点，这三个位点都在四环素抗性基因内；另一个单一的Pst识别位点在氨苄青霉素抗性基因内质粒载体 pUC19：pBR322带的单一克隆位点较少，筛选程序较费时，pUC19是在其发展的，有一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因（lac Z）的调节片段，一个调节lac Z基因表达的阻遏蛋白的基因lac，还有多个单克隆位点酵母质粒载体：既可以在大肠杆菌中复制，又可在酵母系统中复制，又称穿梭载体噬菌体载体：细菌病毒聚合酶链式反应法（PCR）：PCR模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列的快速聚合及扩增。能快速、简便地在体外扩增特定的DNA片段，具有高度的专一性和灵敏度。过程：变形退火延伸，如此反复进行约30个循环。条件：要有与被分离目的基因的DNA双链两端序列相互补的DNA引物（约20个碱基）有热稳定性的酶dNTP 作为模板的目的DNA序列 反应缓冲液克隆：将重组DNA导入受体细胞进行扩增和筛选，达到大量的重组分子，即外源基因的无性繁殖重组DNA导入受体细胞的方法：l 转化：将重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程为转化l 转染：将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法（又分为磷酸钙沉淀法与体外包装法）l 微注射技术：将外源基因直接注射到真核细胞内的方法l 电转化法：用到电转移l 微弹技术：也叫高速粒子轰击法或基因枪技术l 脂质体介导法：l 其他方法：加速冷冻法、碳化硅纤维介导法受体细胞：能摄取外源DNA并使其稳定保持的应用价值或理论研究价值的细胞选择受体细胞应考虑：安全性 便于重组DNA 分子的导入 便于筛选克隆分子 重组DNA分子在受体细胞内并能稳定维持 适于外源基因的自主表达、分泌或积累重组体的鉴定：报告基因的检测法：指在构建目的基因时将一种报告基因（如GUS、NPT、CAT、NOS、OCS、LUS、GFP）构建在一起，当目的基因转化受体细胞时，报告基因一同被转入（这种报告基因是受体细胞本身不存在的，而且具有易于检验的表型转基因生物的PCR鉴定：以被检测的DNA为模板，在外源基因的两侧设计合理的引物，通过PCR反应进行扩增，然后通过凝胶电泳分析扩增产物目的基因分子杂交检测方法：利用表达稳定、易于检测的报告基因的表达来间接地证明目的基因的存在与表达，若需进一步证明目的基因的存在、转录及表达程度，需用分子杂交方法来检测RNA沉默：指在真核生物（植物、动物、真菌）中保守的由双链RNA诱导的鉴定和破坏其细胞质中异常变异或过表达的RNA的一种机制。是广泛存在于植物、动物、线虫和真菌等真核生中的一种高度保守的、序列特异的 RNA 降解机制. RNA 沉默对于调控发育、维持基因组的稳定性以响应生物和非生物胁迫等具有重要作用细胞工程：是以细胞为基本单位，在离体条件进行培养或人为的精细操作，使细胞在体外大规模地繁殖，使细胞的一些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到体外生产生物产品的目的细胞周期：指正常连续分裂的细胞从前一次分裂结束到下一次分裂完成所经历的连续动态过程（分为间期【G1期、S期、G2期】和分裂期【M期】）群体细胞的生长滞后期：当细胞接种或传代至合适培养基中，细胞并不马上立即进入快速对数生长期，而是存在一个缓慢生长阶段，称为滞后期对数生长期：经过滞后期准备，细胞适应了新的环境，只要细胞生长所需要的各种营养条件具备，细胞数目就呈几何级数增加，而进入对数生长期（传代接种或冻存细胞的理想时期）稳定期：新生的细胞数与死亡的细胞数大致相当，细胞数保持一个恒定数值，即进入了生长的稳定期衰亡期：处于稳定期的细胞如果不传代或不加入新鲜培养基，则会进入衰退死亡期（培养基中细胞总数不变，活细胞数显著下降）细胞的全能性：一个与合子具有相同遗传内容的体细胞具有产生完整生物个体的潜在能力（意味着每个培养细胞仍然保持着完整的遗传信息）细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程（过程：制备原生质体诱导细胞融合筛选杂合细胞）微生物细胞的培养基组成：碳源、氮源、无机盐（功能：构成菌体的组成 作为酶活性基团的组成部分 调节微生物体内的pH 主要元素：磷、硫、镁、钾、钙【以盐和化合物形式添加 微量元素：钴、铜、铁、锰、钼、锌【以杂质存在，不必添加】）、维生素培养基分类：成分不同（天然、合成），物理状态（固体、半固态、液体），用途（基础、加富、鉴别、选择）培养方法：固体培养（用于菌种的分离、纯化、保藏和种子的制备），液体培养（分为连续培养【恒浊培养：根据体系内微生物的生长密度，通过自控仪表调节料液的流量，以取得菌体浓度和生长速度恒定的微生物细胞的培养方式 恒化培养：保持培养液的流速不变，使培养罐内的营养物质浓度基本恒定，并使微生物始终在低于其最高生长速度的条件下进行繁殖】、中间补料培养、同步培养、混合培养）连续培养遇到的问题：植物细胞培养：广义上 指在无菌条件下，将离体的单个游离细胞在人工控制的环境里培养，以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他生物产品的一种技术 食品上 指细胞悬浮培养，即使游离的植物细胞或一些小的细胞团在液体培养基中增值并分离提取细胞产生的代谢产物组织培养：愈伤组织胚完整个体细胞培养：单个细胞大量细胞分泌的产物植物细胞培养基组成：碳源、植物生长激素、有机氮源、维生素、生长调节剂动物细胞培养：将动物细胞或组织从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，在体外继续生长和增殖的过程（过程： 取材 分散成单个细胞 制成悬液 传代 ）【动物胚胎或幼龄动物】 【胰蛋白酶】 【贴壁&悬浮】 【营养不足&空间障碍】（方法：悬浮培养【转瓶、滚瓶、发酵罐式】，贴壁培养【贴壁因子吸附接触贴壁扩展】固定化培养基【细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强】大规模培养法【空心纤维法、微载体法、微囊法】）动物细胞培养基组成：氨基酸（12种）、维生素、盐、糖类（葡萄糖）、有机添加剂、激素和生长因素、其他成分（血清）【没有细胞壁，易受污染】细胞融合技术：指在一定条件下，将不同来源的原生质体（除去细胞壁的细胞）相融合并使之分化再生，形成新物种或新品种的技术，又称为体细胞杂交（过程：两个亲本细胞并列，细胞膜相接触膜组织局部破坏形成包围融合细胞的连续胞膜）（方法：生物学法【病毒】，化学融合剂法，电处理融合法）植物细胞工程在食品工业的应用：生产香料 生产食品添加剂（色素、甜味剂、鲜味剂、防腐剂、增稠剂） 生产天然食品 生产植物药 生产抗氧化剂动物细胞工程的应用：疫苗生产 干扰素生产 单克隆抗体生产 干细胞体外诱导分化 其他基因重组产品生产蛋白质的结构：一级结构（氨基酸排列顺序），二级结构（借助氢键沿一维方向具有周期性结构的构象），三级结构（借助次级键【非共价键】盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象），四级结构（寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系或结合方式）蛋白质的功能性质：指食品体系在加工、贮藏、制备和消费过程中蛋白质对食品生产需要特征的那些物理、化学性质（两大类：流体动力学性质【 水吸收和保持、溶胀性、黏附性、黏度、沉淀、胶凝、蛋白质面团和纤维这种结构起作用的性质】表面性质【湿润性、分散性、溶解性、表面张力、乳化作用、蛋白质的起泡特性、脂肪和风味的结合】）蛋白质工程：指通过生物技术对蛋白质的分子结构或者对编码蛋白质的基因进行改造，以便获得更适合人类需要的蛋白质产品的技术（研究内容：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的基因修饰和基因合成，对现有蛋白质加以定向改造、设计、构建，并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质 前提：了解蛋白质的结构和功能 核心手段：改造基因步骤：分离纯化目的蛋白，使之结晶并做分析，得到其空间结构的尽可能多的信息对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间相互关系的分析，找出关键的基因和结构围绕这些关键的基因和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实施对经过改造的蛋白质进行功能性测定，看看改造效果如何然后，重复和这两个步骤，直到获得比较理想的结果改造方法：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入【初级改造】蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接【高级结构】从头设计合成新型蛋白质主要采用的基因突变方法：基因定向诱变，盒式突变）盒式突变：又称片段取代法，是利用目标基因序列中适当限制酶切位点，插入各种合适的突变DNA片段，用以取代目标基因中特定DNA片段。（是一种常用的定点突变技术。适用于需要突变位点的两端有成对的酶切位点的情况）基因的定向诱变：在DNA水平上产生多肽编码顺序的特异性改变蛋白质结构和功能的关系：蛋白质是功能性大分子.每一种蛋白质都有特定的一级结构和空间结构,这些特定的结构是蛋白质行使蛋白质功能的物质基础,蛋白质的各种功能又是其结构的表现.蛋白质的任何功能都是通过其肽链上各种氨基酸残基的不同功能基团来实现的,所以,蛋白质的一级结构一旦确定,蛋白质的可能功能也就确定了,而且从某种程度上来说,蛋白质的三级结构比一级结构与功能的关系更大蛋白质结构对维系生物体生命活动的重要性：(1)蛋白质是细胞和生物体结构和生命活动的重要物质，如红细胞中与运输氧气有关的血红蛋白；细胞膜上与物质跨膜运输有关的载体蛋白及与细胞识别、传导有关的糖蛋白。(2)具有催化作用的酶大多是蛋白质，如唾液淀粉酶可把淀粉分解为麦芽糖；纤维素酶和果胶酶在植物细胞工程中用于除去细胞壁；胰蛋白酶在动物细胞工程中用于分离细胞；RNA聚合酶在基因表达过程中用于DNA转录为mRNA。(3)有些蛋白质具有调节作用，如垂体分泌的生长激素对动物生长有促进作用，若幼年缺乏，可导致侏儒症；胰岛B细胞分泌的胰岛素有降低血糖浓度的作用，若人体缺乏，则患糖尿病；胰高血糖素由胰岛A细胞分泌，有升高血糖浓度的作用，与胰岛素作用相拮抗。(4)特异性免疫中的免疫物质，既包括体液免疫中由浆细胞分泌的免疫球蛋白抗体，也包括细胞免疫中由效应T细胞产生的干扰素等淋巴因子。蛋白质的主要功能：催化功能：酶调节功能：激素结构功能：皮、毛、骨、牙、细胞骨架运输功能：血红蛋白免疫功能：免疫球蛋白运动功能：鞭毛、肌肉蛋白储藏功能：酪蛋白生物膜功能：及神经传导等如何理解蛋白质工程是第二代基因工程：蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程，是包含多学科的综合科技工程领域。基因工程是通过基因操作把外源基因转入适当的生物体内，并在其中进行表达，它的产品是该基因编码的天然存在的蛋白质。蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构与功能之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可分。蛋白质工程根据对分子预先设计的方案，通过对天然蛋白质的基因进行改造，来实现对它所编码的蛋白质进行改造。因此，它的产品已不再是天然的蛋白质，而是经过改造的、具有了人类所需要的优点的蛋白质如何理解蛋白质工程的非理性设计：非理性蛋白质设计技术是在不了解有关酶结构与功能之间的关系等信息的情况下通过对酶基因的随机突变和基因片段的重组来创造突变库，然后通过高通量的筛选手段鉴定性能改善的突变体，挑出的有益突变基因可以作为下一轮突变的模板，进行多轮突变和筛选，以进一步提高酶的性能。这些失败可能是因为对要改造的酶性质的内在机制缺乏理解，有很多失败例子都是将氨基酸序列同源作为氨基酸替换的唯一标准，忽视了蛋白质的结构特性，这样做的结果是导致替换的氨基酸不但对要改变的酶特性无影响，而且常常因氨基酸改变导致酶构像的改变而使酶钝化。蛋白质工程理性设计：在理性设计中，首先要根据蛋白质的结构，功能和机制等详细资料对氨基酸序列中要突变的位点进行精确设计，然后通过取代、插入或缺失等手段改变蛋白质分子中特定的氨基酸。从而鉴定出与酶特性相关的关键残基和结构元件。理性设计的方法有寡核苷酸介导的重组PCR，限制性内切酶酶切片段取代法，盒式突变法和化学合成法。与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相比，定点突变具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。蛋白质工程的改造策略1、疏水氨基酸常常出现在蛋白质的活动中心区域；螺旋和折叠区通常不会是酶的活性中心以及底物结合的中心，而是作为结构的支架；环区、转角区域和带电荷区域通常位于蛋白质的表面。2、进行定点突变时，应注意保守氨基酸残基。如果要改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的性质，则应尽量保留保守残基。3、应注意保留潜在的N糖基化位点(Asn-X-SerThr-X-Pro)中的Asn(天门冬酰胺)、Set(丝氨酸)或Thr(苏氨酸)。4、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白其余部分的正确折叠。5、构建两个同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当两个非同源蛋白组成嵌合体时，则应使接合部分尽量位于所预测结构的边缘。6、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那么可以在目的序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域。插入六聚体接头后，在原蛋白质序列中添加两个氨基酸，比插入更多的氨基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻。7、进行缺失突变时，应避免直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。蛋白质工程在食品中的应用：l 提高蛋白的稳定性包括以下几个方面：延长酶的半衰期；提高酶的热稳定性；延长药用蛋白的保存期；抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。一、消除酶的被抑制特性1985年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位突变技术，用19种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第222位残基上易氧化的Met，获得了一系列活性差异很大的突变酶。发现除了用Cys代替Met的突变体以外，其他突变体的酶活性都降低了。二、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性溶菌酶分子：由一条肽链构成，并在空间上折叠形成二个相对独立的结构域，酶活性中心位于二个结构域之间。该酶分子在第97位和54位残基上是两个未形成二硫键的半胱氨酸。由于二硫键是一种稳定蛋白质分子空间结构的重要共价化学键，能将分子中的不同部位牢固地联结在一起。因此，提高酶热稳定性最常用的办法是在分子中增加一对或数对二硫键。三、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性在高温下Asn和Gln容易脱氨形成Asp和Glu，而导致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有2个Asn，由于它们都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决定性作用。通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第14位和第78位上的2个Asn分别转变成Thr(苏氨酸)和Ile(异亮氨酸)残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。四、改变酶的最适pH值条件葡萄糖异构酶最适pH为碱性，在80稳定，而在碱性条件下，80时使高果糖浆焦化产生有害物质，反应只能在60进行。采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸(Glu或Asp)集中的区域置换为碱性氨基酸(Arg或Lys)，可使葡萄糖异构酶的最适pH值变为酸性，即可在高温下进行反应。五、提高酶的催化活性酶的催化活性由酶分子上的必需基团决定，如对酪氨酸-tRNA合成酶进行定点突变。在天然状态下，酪氨酸-tRNA合成酶分子内第51位苏氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环上的氧原子形成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与另一底物ATP的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶分子第51位苏氨酸残基改变为脯氨酸残基，酶(Pro-51)与ATP的亲和力被增加了近100倍，而且最大反应速度亦大幅度提高。六、修饰酶的催化特异性利用定点突变技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心的GLu、Asp被Gln、Asn取代时，突变体酶分解-1，4糖苷键和-1，4糖苷键的活性比例发生明显改变。七、修饰Nisin的生物防腐效应Nisin是乳酸球菌分泌的有较强抗菌作用的小分子肽，可用于罐头食品、乳制品、肉制品的保藏。Nisin由34个氨基酸残基构成。Nisin分子结构中包含5种稀有氨基酸，即ABA、DHA、DHB、ALA-S-ALA和ALA-S-ABA，它们通过硫醚键形成五个内环。改变Nisin氨基酸的序列，可增强其稳定性、溶解度和扩大抑菌谱等，扩大Nisin的应用范围。酶工程：又称酶技术，就是利用酶催化的作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品的过程，是酶学理论与化工技术相结合而形成的一种新技术化学酶工程：亦称初级酶工程，指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用l 天然酶：材料提取，工业应用l 化学修饰酶：化学修饰，酶学研究和疾病治疗l 固定化酶：束缚于支持物上，反复使用l 人工合成酶：化学合成生物酶工程：亦称高级酶工程，是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。l 用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）l 修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）l 设计新酶基因，合成自然界不曾有的酶（新酶）。获取酶制剂的方法：组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶微生物发酵：最大量的来源化学及生物合成：生物重组利用微生物产酶的优点： 酶种丰富：微生物种类多、菌株易诱变，菌种多样 酶产量高：微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶 生产成本低：微生物培养基来源广泛、价格便宜 可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高 可改造性强：可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种酶生产菌的要求： 安全可靠，非致病菌 不易退化，不易感染噬菌体 产酶量高，而且最好产生胞外酶，以利于酶产品的分离纯化 能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养酶的发酵方法：固体发酵法：优点是设备简单，操作方便。缺点是缺点是劳动强度较大，原料利用率较低，生产周期较长液体发酵法：液体深层发酵是目前酶发酵生产的主要方式固定化细胞发酵：历史不长，技术要求较高，需特殊的固定化细胞反应器，只适用于胞外酶的生产提高酶产量的方法：(1)通过条件控制提高酶产量添加诱导物降低阻遏物浓度(2)通过遗传控制使诱导型变成组成型使阻遏型变成去阻遏型(3)添加产酶促进剂添加表面活性剂