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毕业论文 2稿范文 编号:xx041152毕业论文（xx届本科）论文题目大肠杆菌噬菌体分离纯化研究学院:生命科学与技术学院学院:生命科学与技术学院专业:生物科学专业:生物科学班级10级生科 （1）班班级10级生科 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名二O一四年五月二十日2大肠杆菌噬菌体生理特性研究郑小云（陇东学院生命科学与技术学院甘肃庆阳745000）摘要目的:通过分离纯化大肠杆菌噬菌体，研究其生理特性。 方法采用双层琼脂平板法从环境污水中分离纯化大肠杆菌噬菌体，测定大肠杆菌噬菌体的效价、观察噬菌体对大肠杆菌的裂解曲线和Ca2+、Mg2+对噬菌体裂解率的影响。 结果通过双层琼脂平板法以实验室保藏的E-coli N1和N2为宿主菌，分离得到了1株烈性噬菌体Pha1；初次分离所得的噬菌体噬菌斑较小，效价比较低，E.coli K99噬菌体的效价较高,株00/1:88噬菌体的效价相对较低；E-coli NO1菌体混合悬液的OD600值先升高后下降，说明噬菌体pha1对E-coli NO1有较强的裂解作用；E-coli NO2与噬菌体混合液的OD600值一直呈上升趋势，说明噬菌体pha1对E-coli NO2没有裂解作用；在培养基中添加Ca2+和Mg2+时，噬菌体出斑率明显高于对照，说明添加Ca2+和Mg2+均可促进噬菌体出斑；当加入200mg/L的Ca2+或250mg/L Mg2+时，相对出斑率最高，分别达到187%和178%。 结论不同大肠杆菌噬菌体的效价不同，同一种大肠杆菌噬菌体对于不同的宿主菌的裂解作用也不同，在培养基中添加Ca2+和Mg2+可以促进噬菌体出斑。 关键词关键词大肠杆菌噬菌体；生理特性；噬菌体效价；裂解作用；裂解率Research biologicalproperties ofcol iphages ZHENGXiao-yun(College oflife scienceand technology,Long dongUniversity,Qing yangGansu745000)Abstract:ObjectiveTo investigatebiologicalpropertiesof coliphagesbyisolating andpurifying coli phages.Methods usingdouble layerplate methodisolate andpurify coli phages fromthe environmentin thesewage,to surveyand evaluatee.coli phage titer,observe phagecracking curveof e.coli and the influenceof Ca2+andMg2+for phagebacteriolysis proportion.Resultsthrough thedouble layerplate methodin laboratory3preservation of E coli N1and N2as thehost,a strainisolated froma virulentphage Pha1;First separationof thephage plaqueis small,andthetiter islow,E coli K99phage titeris higher,00/1:88phage titeris relativelylow;E-coli NO1mixed bacteriasuspension OD600values fallafter risefirst,showed thephage pha1to E-coli NO1strong cracking;E-coli OD600value ofNO2and bacteriophagemixture hasbeen onthe rise,showed thephage pha1hasno cracking effect onE-coli NO2;Ca2+and Mg2+are addedin theculture mediumand phagebacteriolysis proportionis significantlyhigher thanthe contrast,showed thatadd Ca2+and Mg2+can promotephage outspot;When join200mg/L Ca2+or250mg/L Mg2+,the relativespot rateis highest,at187%and187%respectively.Conclusion:different Ecoliphagehas differenttiter,the samekind ofe.coliphagehas differentcracking effecton differenthost bacteria,Ca2+and Mg2+is addedin theculture mediumcan promoteto growphage plaques.Key word:E.coliphages;biologicalproperties;phagetiter;crackingeffect;bacteriolysis proportion1引言噬菌体是一类感染细菌、放线菌等微生物的病毒，体积微小、结构简单、具有严格的寄生性，广泛分布于自然界中。 噬菌体作为指示微生物，在监测水质环境、指示污染程度等方面的研究也有了一些进展。 因此，分离和研究噬菌体，弄清噬菌体与其宿主之间的生态学关系，对于监测水质环境，控制水质污染等方面的工作无疑具有指导意义。 根据噬菌体与宿主菌的关系可分为裂解性噬菌体和溶原性噬菌体。 鉴于噬菌体有溶菌作用和严格的种型特异性，可利用噬菌体作细菌的鉴定和分型，亦可用于检测标本中的细菌和防治某些传染病。 噬菌体作为一种新的治疗制剂已受到广泛关注1,2，本实验旨在通过分离大肠杆菌噬菌体,研究其生理特性，为噬菌体作为一种生物制剂用于治疗细菌性感染提供实验依据。 42材料与方法2.1材料噬菌体样品阴沟污水（100ml），土壤菌种陇东学院生命科学与技术学院微生物实验室保藏的大肠杆菌E-coliNO1和E-coliNO2培养基3倍牛肉膏蛋白胨培养液（4瓶，每瓶50ml），牛肉膏培养液，牛肉膏蛋白胨半固体培养基（倒上层用），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒底层平板用）实验器材离心机，细菌滤器，抽滤装置，恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，无菌涂布器，无菌吸管，培养皿，三角瓶，移液管，试管，漏斗等2.2方法2.2.1大肠杆菌噬菌体的分离2.2方法2.2.1大肠杆菌噬菌体的分离A.培养大肠杆菌活化培养实验室保藏的大肠杆菌E.coli NO1和E.coli NO2至对数期600nm（OD值0.8左右）3B.增殖噬菌体样品取上述大肠杆菌培养液6ml于盛有50ml3倍牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，后加入污水样100ml（离心并过滤除菌），继续37摇床振荡培养1214h，以增殖噬菌体。 C.富集噬菌体将以上培养液3000r/min离心30min，将上清液过滤除菌，取100ml滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37培养1218h进行噬菌体富集。 将以上富集液3000r/min离心30min后，取上清液10mL加入5mL3倍牛肉膏蛋白胨培养液及相应宿主菌液1mL，室温下放置1h，37120rpm振荡培养3.5h。 D.收集噬菌体将上述培养液于4下12000g离心30min，上清液再经微孔滤膜（0.22m）过滤，滤液即为拟含有相应宿主菌噬菌体的原液。 E.验证噬菌体存在在大肠杆菌平板上，滴加上述滤液57小滴,同时滴加生5理盐水作为对照，进行标记，37培养1820h，若出现噬菌斑，则证明滤液中存在噬菌体。 4,52.2.2大肠杆菌噬菌体的纯化 (1)用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1ml大肠杆菌悬液，使混合均匀。 (2）取上层琼脂培养基，溶化并冷至48（可预先溶化、冷却，放48水溶箱内备用）,加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2ml，立即混匀，并立即倒人底层培养基上，混匀，置37培养12h。 (3）此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。 于37培养。 （5）等待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。 2.2.3噬菌体效价的测定 （1）倒平板将融化后冷却到45左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。 （2）稀释噬菌体按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。 （3）噬菌体与菌液混合:将11支灭菌空试管分别标记10- 4、10- 5、10-6和对照。 分别从10- 4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。 (4)接种上层平板:将11支融化并保温于45的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速摇匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。 水平静6置，凝固后置37培养。 （5）观察并计数观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有3030个噬菌斑的平板计算噬菌体效价。 6,7计算公式N=Y/VX（效价值，平均噬菌斑数皿，取样量，稀释度）例如当稀释度为106时，取样量为0.1mL/皿，同一稀释度中3个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为1860.11061.86109。 2.2.4噬菌体对大肠杆菌的裂解曲线在细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对细菌的裂解作用，导致细菌悬液OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对细菌的裂解曲线。 分别以E.coli NO1和E.coli NO2作为宿主菌。 将过夜培养的细菌悬液以1100的比例转接到100mL LB培养基中，37160rpm振荡培养1.5h（OD600约0.5，约1.5108cfu/mL），将菌悬液平均分装在2个无菌的锥形瓶中，向其中分别加入E.coli NO1和E.coli NO2噬菌体悬液1109pfu（经过0.22m微孔滤膜过滤），立即置于37160rpm振荡培养，每隔20min取样100L，测定OD600的值。 同时以不加噬菌体的细菌作为对照。 试验重复三次。 2.2.5Ca2+、Mg2+对噬菌体裂解率的影响在下层固体琼脂和上层半固体琼脂中分别加入Mg2+,使终浓度分别为 0、 50、 100、 150、 200、 250、 300、 350、 400、450mg/l,然后取1.0103pfu/mL的噬菌体液和培养8h的菌液，用双层平板法，测定出斑情况。 83结果与分析3.1噬菌体的分离与纯化本试验采用双层琼脂平板法分离纯化噬菌体，以实验室保藏的E-coliN1和N2为宿主菌，分离得到了1株烈性噬菌体Pha1。 初次分离所得的噬菌体噬菌斑较7小，效价比较低，故需进一步纯化扩增。 为得到效价较高、裂解能力较强的噬菌体，对初次分离得到的噬菌体进行反复分离纯化，直到噬菌斑在形态和大小上基本一致，即可得到纯化的大肠杆菌噬菌体(图1)。 图1.分离所得大肠杆菌噬菌斑Fig1.Plaques ofpha1图1.分离所得大肠杆菌噬菌斑Fig1.Plaques ofpha13.2噬菌体的效价采用双层平板法测定纯化增殖的噬菌体效价，E.coliK99噬菌体的效价较高,株00/1:88噬菌体的效价相对较低(见表1)。 3.3噬菌体pha1对大肠杆菌的裂解曲线00.511.522.533.50204060801001xx0160180xx20240260280300时间(min)吸光值(OD600)CKE-coli NO1图2噬菌体pha1对大肠杆菌E-coli NO1的裂解曲线Fig.2The curvesof E.coli NO1lysed bypha1图2噬菌体pha1对大肠杆菌E-coli NO1的裂解曲线Fig.2The curvesof E.coli NO1lysed bypha1800.511.522.533.50204060801001xx0160180xx20240260280300时间(min)吸光值(OD600)CKE-coli NO2图3噬菌体pha1对大肠杆菌E-coli NO2的裂解曲线Fig.2The curvesof E.coli NO2lysed bypha1图3噬菌体pha1对大肠杆菌E-coli NO2的裂解曲线Fig.2The curvesofE.coli NO2lysed bypha1由图2和3可知，E-coli NO1菌体混合悬液的OD600值先升高后下降，说明噬菌体pha1对E-coli NO1有较强的裂解作用；E-coli NO2与噬菌体混合液的OD600值一直呈上升趋势，故噬菌体pha1对E-coli NO2没有裂解作用3.4Mg2+、Ca2+对噬菌体裂解率的影响由结果(图4)可知，在培养基中添加Ca2+和Mg2+时，噬菌体出斑率明显高于对照，说明添加Ca2+和Mg2+均可促进噬菌体出斑。 当加入200mg/L的Ca2+或250mg/L Mg2+时，相对出斑率最高，分别达到187%和178%。 60801001xx0160180200050100150xx50300350400450Ca2+和Mg2+浓度(mg/l)相对出斑率(%)Ca2+处理相对出斑率Mg2+处理相对出斑率图4Ca2+和Mg2+离子对噬菌体出斑率的影响94讨论噬菌体是感染细菌的病毒,按其与宿主的关系可将其可分为烈性噬菌体与温和噬菌体。 噬菌体对宿主的裂解和感染是特异性的,是由受体决定的,很少产生耐药性的问题,也不会造成机体的菌群失调,每种细菌都有自身敏感的噬菌体。 9,10本实验从污水中分离出1株烈性大肠噬菌体Pha1。 初次分离所得的噬菌体噬菌斑较小，效价比较低，对初次分离得到的噬菌体进行反复分离纯化可以得到效价较高、裂解能力较强的噬菌体。 我们知道噬菌体对宿主菌的裂解作用具有极强的特异性，实验得出噬菌体pha1对E-coli NO1有较强的裂解作用，对E-coli NO2没有裂解作用，说明噬菌体pha1对E-coli NO1有特异性。 Ca2+和Mg2+能够促进噬菌体的吸附与注入11，有利于噬菌体的繁殖，对促进噬菌体的形成有明显效果，所以在培养基中添加Ca2+和Mg2+时，噬菌体出斑率明显高于对照。 5参考文献1Tseng ChCh,Li ChSh.Collection efficienciesof aerosolsamplers forvirus-containing aerosols.J AerosolSci,xx,36:593?607.2帖金凤,张文福.几种噬菌体与脊髓灰质炎病毒对三氯异氰尿酸抗力的比较.中国消毒学杂志(Chinese Journalof Disinfection),xx,24 (3),208?211.3Jamalludeen N,John sonRP,Fri endship R,et al.Isolation andcharacterization ofnine bacteriophagesthat lyseO149enterotox-igenic E.col iJ.VetMicrobiol,xx,124:47-57.4Anonymous.Water quality.Detect ionand enumerationofbacteriophages part1:Enumeration ofF-specific RNAbacteriophages.International Organizationfor Standardization,ISO10705-1.Geneva,Switzerland,1995.5Anonymous.Water quality.Detect ionand enumerationofbacterioph