二氢杨梅素分离纯化的研究进展.doc

二氢杨梅素分离纯化的研究进展摘要：二氢杨梅素是黄酮类化合物中重要的一员，具有消炎、止咳、祛疚、镇痛、抑菌、抗高血压、消脂以及解乙醇中毒等药理作用；本文将对二氢杨梅素的理化性质及其分离纯化进行阐述。关键字：二氢杨梅素；理化性质；分离；纯化The progress of dihydromyricetin separate and purifyAbstract：Dihydromyricetin one of the important flavonoids，and have pharmacological effects of anti-inflammatory, cough, dispel remorse, analgesic, antibacterial, antihypertensive, Cellulite solution of ethanol poisoning; This paper will dihydromyricetinphysical and chemical properties and its purification described.Keywords：DihydromyricetinChemical propertiesSeparatePurification0、 前言二氢杨梅素(3，5，7，3 7，4，5一六羟基2，3-双氢黄酮醇，DMY)又名双氢杨梅树皮素、福建茶素、蛇葡萄素等，是黄酮类化合物的重要一员。该化合物首次由Kotake和Kubota于1940从葡萄科蛇葡萄属植物福建茶即楝叶玉葡萄A.Meliaefolia的叶中分离到，命名为蛇葡萄素1。DMY广泛存在于松柏类植物和木材中，如松属(pinus)和雪松属(cedrus)树皮中，也存在于木本被子植物，如杜娟花科植物饼砂杜娟(Rhodendron cinnnbariuunm)叶、连香树科植物连香树(Cercidiphyllum japonicus)木材中，是一种很好的抗氧化剂。该植物存在于杨梅科、杜娟科、藤黄科、大戟科等植物中，有抗癌、利胆和抗炎作用。近十年来，随着黄酮类化合物成为天然植物活性成分的研究热点后，DMY也受到人们的重视和关注，但由于在以上植物中存在含量不高的因素，一直无法进行大规模的应用和实验，直到在蛇葡萄科中发现并提取之后才引起人们极大的关注和重视。从目前研究情况表明，DMY大量存在于葡萄科植物中，尤其是在蛇葡萄属植物中更是大量存在。有研究表明，藤茶幼嫩茎叶中含量达2728，最高部位可达40以上；粤蛇葡萄中幼嫩茎叶中含量可达25以上2。DMY作为黄酮类成分中的重要一员，在天然植物中单体含量如此之高，实属罕见。1、 二氢杨梅素的理化性质DMY的分子中含有6个酚羟基，具有弱酸性，等电点在pH=5左右，因此其在酸性溶液中构型稳定，在中性和碱性溶液中酚羟基易发生解离。尤其是在强碱性条件下由于酚羟基大量的解离，改变了分子上的电子云分布，从而使分子发生了彻底的构型转换，在C环的氧原子处发生解环，生成了A环上的一个羟基，变成类似于查尔酮的结构3。1.1、二氢杨梅素良好的热稳定性林淑英等4研究发现，DMY在水相中的热稳定性与时间关系密切，100C下加热30 rain DMY在水中仍能保持稳定的构型，加热时间更长以后DMY发生氧化，变成亚醌式结构，C环发生断裂。DMY的DSC稳定性分析发现其熔点为245左右。1.2、二氢杨梅素的生理作用51.2.1、抗菌作用药理实验表明，二氢杨梅素对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、大肠埃希菌、产气杆菌、啤酒酵母、黏红酵母、青霉、黑曲霉、黄曲霉、毛霉及根霉均有抑菌作用, 尤其对革兰阳性、革兰阴性球菌或杆菌作用明显 。 1.2.2、对血糖、血脂的调节作用小鼠灌胃药理实验表明二氢杨梅素能明显抑制由四氧嘧啶、肾上腺素、链脲霉素等诱导的小鼠血糖升高，同时升高血清胰岛素水平, 胰腺组织中淋巴细胞浸润明显减少、炎症反应明显减轻, 胰岛数目明显增加。二氢杨梅素对链脲霉素诱导的高血糖大鼠血清三酰甘油( TG) 含量有降低作用, 对血清总胆固醇( TC) 、高密度脂蛋白胆固醇( HDL2C) 含量无明显影响。 1.2.3、护肝作用二氢杨梅素对体外培养的大鼠肝细胞四氯化碳中毒性损伤、D2半乳糖胺和脂多糖诱导的小鼠肝损伤有显著的保护作用。二氢杨梅素可以保护肝脏，加速乙醇代谢产物乙醛迅速分解，变成无毒物质，降低对肝细胞的损害。此外，二氢杨梅素能够改善肝细胞损伤引起的血清乳酸脱氢酶活力增加，抑制肝性M细胞胶原纤维的形成，从而起到保肝护肝的作用，大幅度降低乙醇对肝脏的损伤，使肝脏正常状态迅速得到恢复。Microherb试验证明，二氢杨梅素可以保护肝脏，加速乙醇代谢产物乙醛迅速分解，变成无毒物质，降低对肝细胞的损害。二氢杨梅素起效迅速，并且作用持久，是保肝护肝，解酒醒酒的良品。 1.2.4、抗氧化作用纯度为98%的二氢杨梅素, 能明显抑制大鼠心肌、肝和脑组织匀浆中丙二醛(MDA)的生成, 并随二氢杨梅素浓度增加而抑制MDA生成的作用增加，含量99 %的二氢杨梅素对试验系统中二苯三硝基苯肼(DPPH) 自由基的清除率。二氢杨梅素能明显抑制油脂中MDA的生成, 随二氢杨梅素纯度(60 %90 %) 增加抗氧化作用增强; 对动物油和植物油均有很强的抗氧化作用。 1.2.5、抗肿瘤作用近年的抗肿瘤药效学研究发现其活性成分之一，蛇葡萄素小分子化合物具有较强的抗癌作用。体外内抗肿瘤作用研究发现该化合物可以通过抑制肿瘤血管生长、调节增强细胞免疫功能等作用达到提高肿瘤治疗效果和改善病人生命体症的目的，在白血病和鼻咽癌等肿瘤模型试验研究中都显示有明显的抑瘤作用。1.3、二氢杨梅素的合成反应分子中的酚羟基还能和一些酸、脂肪酰卤、糖等反应生成新的化合物，这些性质为DMY提供了更广阔的应用潜力。如李卫等6用月桂酰氯对DMY的羟基进行酯化，合成了DMY月桂酸酯。通过对DMY及DMY月桂酸酯在猪油中抗氧化性能的比较试验，证实DMY月桂酸酯能够持久、稳定地在猪油中发挥抗氧化作用，而且抗氧化能力比DMY还要强。Matsumo等7在实验中发现，从lix sachalinensis提取的DMY对Cladosporium herbarum真菌具极强的抑制作用，但DMY甲酯的抑菌能力为DMY的4倍。宁正祥8采用黄酮糖苷酶催化合成了DMY葡萄糖苷。通过对158例糖尿病患者为期9个月的治疗发现，DMY葡萄糖苷能使其血糖代谢基本回归到正常水平。2、 二氢杨梅素的分离纯化方法2.1、吸附法通常利用吸附法除去体系的杂质如色素等，也可以用吸附剂吸附有效成分。常用的吸附剂有氧化铝、活性炭、多孔树脂，分子筛等。Yoo等9报道了利用萃取吸附技术从Hovenia dulcis中提取纯化DMY的方法。将提取液经活性粘土P-1吸附过滤，再经硅藻土过滤吸附，甲醇洗提，洗液过硅胶柱后乙醚洗提，洗液经浓缩蒸发可得到纯度达50的DMY粗品。2.2、结晶法结晶法是分离和纯化固体成分的重要方法之一，是利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不同来达到分离的方法。结晶时应选择合适的溶剂、合适的温度和时间等；结晶法手所用的度依样品必须是具有一定纯度的样品才能采用此法纯化，如果粗液部分的纯度很差，则很难得到结晶，或者结晶后的纯然较低。对提取出的粗黄酮进行预处理后再进行重结晶可得到较高纯度产品。采用“增温溶解，保温过柱，温水解吸法从显齿蛇葡萄中提纯DMY，经此法后再重结晶的DMY可达到较高纯度要求。 高建华10对显齿蛇葡萄黄酮提取物DMY的提纯及结晶态进行了初步探讨。表明：以水作为结晶溶剂进行多次重结晶，可有效去除植物黄酮提取物的杂质，总黄酮含量又原来的86提高至965。DMY在水相中的结晶态多为针状结晶，水相保温结晶呈放射性棒状结晶。在pH45的条件下，其溶解度最低可获得较高的回收率。2.3、大孔树脂吸附法大孔吸附树脂具有物化稳定性高、比表面积大、吸附选择性好、不受无机物存在的影响、再生处理方便、吸附解吸条件温和、使用周期长、节省费用等优点，广泛应用于物质的分离纯化。由于吸附树脂理化性质不同，不同型号的树脂对黄酮的精制效果有较大的差异。陆志科等选用6种不同型号的树脂对竹叶黄酮的吸附特性进行比较研究，弱极性的AB一8树脂适宜竹叶黄酮的提取。分离纯化枸杞叶总黄酮时用HPDl00型大孔树脂效果较好。银杏叶黄酮的分离纯化采用DM一130型树脂具有较好的效果。除树脂的类型外，溶剂的种类及浓度对纯化的效果也具有很大的影响，有研究表明，D204、XDA2树脂吸附银杏叶黄酮后，用80乙醇洗脱效果最好，而D一254、D113则以95乙醇洗脱效果最好。2.4、聚酰胺凝胶柱法对分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较理想的吸附剂。其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。柱层析分离黄酮类物质样品容量大、可逆、分离效果好，可使性质极相似的类似物得到分离。苷元相同，洗脱先后顺序一般是三糖苷、双糖苷、糖苷、苷元。大多数黄酮苷在10一40的乙醇液中就可以洗脱下来，而苷元在5095的乙醇液中才能洗脱下来。由于纯聚酰胺用于柱层析固定相存在滤水性差、单位质量吸附量小、有小分子夹带的问题。王怡红等对聚酰胺柱进行了改进，将聚酰胺涂装在硅藻土上，制成的改性聚酰胺柱，改善了滤水性，提高了单位质量聚酰胺的吸附量，消除Yd,分子夹带问题。此外，王怡红等通过实验还得出聚酰胺在该层析柱上的吸附为单分子层吸附的结论。郑国华等用聚酰胺柱层析法从藤茶的乙酸乙酯萃取部位分离得到3个化合物等。经过理化常数测定和光谱分析，确定为蛇葡萄素，杨梅素和杨梅苷。其中杨梅素和杨梅苷是首次从该植物中分得11。2.5、超临界CO2萃取法超临界CO2萃取作为一种有效的化上分离手段，集精馏(物质挥发度的差异)和液一液萃取(物质溶解度的差异)特点于一体，由于溶剂回收不需要潜热，因此比传统的方法能更有效地节省能量，由于超临界CO2，具有气体和液体之间的性质，所以提取分离的速度远比液体溶剂快，以进行高效分离。在黄酮类化合物的提取，黄酮类化合物广泛存在于植物中，主要存在于芸香科、唇型科、豆科、伞型科、银杏科与菌科等。该类化合物不但分布范围广，种类多，而且生物活性广泛，毒性小，因此很多制剂可长期使用，如水飞蓟有保肝作用，葛根素有明显的扩冠作用，已用于临床。超临界CO2萃取对于黄酮类化合物是一种非常有效的提取方法，与传统的溶剂法相比，其流程短，萃取分离一步完成，萃取得率高，而操作时间比传统方法大大缩短。沈露在用超临界CO2萃取DMY时，通过正交实验确定二氢杨梅素的最佳操作条件为:萃取压力25MPa，萃取温度为50，萃取时间为1.5h，C02流量控制在20L/h，在该条件下萃取得率为8.43%，纯度85.5%12。3、 二氢杨梅素的应用二氢杨梅素广泛应用于治疗呼吸道感染、酒精中毒的中成药制剂，如片剂、 胶囊、冲剂。近年的抗肿瘤药效学研究发现其活性成分之一，蛇葡萄素小分子化合物具有较强的抗癌作用。二氢杨梅素的研究已在制备抗白血病及鼻咽癌药物的应用领域取得了发明专利授权。已做为一类新药准备进入临床试验阶段。中药新药蛇葡萄素注射液的开发有望为广大的白血病、鼻咽癌患者提供一种新的治疗药物。 Microherb完成了藤茶提取物（显齿蛇葡萄总黄酮）和二氢杨梅素提取及其纯化技术，且完成了相关的毒理性实验和功效研究,并以二氢杨梅素为功效添加成分研制了的速溶茶、显齿蛇葡萄总黄酮含片、二氢杨梅素解酒保肝胶囊等保健食品13。参考文献：1 周天达，周雪仙藤茶中双氢黄酮醇的分离、结构鉴定及其药理活性J中国药学杂学，1996，3 1(8)：458-4612 张友胜，林淑英高速逆流色谱法纯化二氢杨梅素J天然产物研究与开发，2003b，15(5)：426-4283 郭清泉，林淑英，李大光，等二氢杨梅素抗氧化机制探讨J食品科学，2006b(5)：121-1234 林淑英，张友胜天然抗氧化剂二氢杨梅素的热稳定性及抗氧化性质研究J现代化工，2003，23：1885 The Chemical components of Ampelopsis grossedentata6 李卫，郑成DMY月桂酰酯在猪油中的抗氧化性研究J食品科学，2005，26(9)：73-757 Matsumo T，Tahara SAmpelopsin,a major antitungal constituent from Salixsachalinensis，and its methyl ethersJ Jpn Soc Biosci Biotechn Agrochem，2001，75(6)：6596678 宁正祥，战宇二氢杨梅素葡萄糖苷的合成及对糖尿病的疗效J食品与生物技术学报，2005，24(6)：921109 Yoo SM，Cai WJRecovery and prc-purification of(+)