GB15193.12-2003体外哺乳类细胞基因突变试验(pdf 4页).pdf

I CS 0r 5 3中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 矛GB 1 5 1 9 3 . 1 2 - 2体外哺乳类细胞（ v 7 9 / x G P x I 其 n 空 亦 亏 才盼z r yn /r rr;m 一 一一 、 二 一s， n n气 - n a - 夕 d 分 淆中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部 h 买 1 初 嘴净 大藉，艰 兰 发 卜 堪拿 桩 味 珍 习良 吊 查GB 1 5 1 9 3 . 1 2 - 2 0 0 3前 山 曰本标准全文强制。本标准代替 G B 1 5 1 9 3 . 1 2 -1 9 9 4 体外哺乳类细胞（ V 7 9 / H G P R T ） 基因突变试验 。本标准与 G B 1 5 1 9 3 . 1 2 -1 9 9 4 相比主要修改如下：在“ 范围” 中增加了受试物的具体内容： 食品生产、 加工、 保藏、 运输和销售过程中所涉及的可能 对健康造成危害的化学、 生物和物理因素， 检验对象包括食品添加剂（ 含营养强化剂） 、 食品新 资源及其成分 、 新资源食品、 辐照食品、 食品容器与包装材料、 食品工具、 设备、 洗涤剂、 消毒剂、 农药残留、 兽药残留、 食品工业用微生物等。自 本标准实施之日 起， G B 1 5 1 9 3 . 1 2 -1 9 9 4 同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位： 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。本标准主要起草人 ： 冯继农、 高丸。本标准于 1 9 9 4 年首次发布， 本次为第一次修订。GB 1 51 9 3 . 1 2 - 2 0 0 3体外哺乳类细胞（ V 7 9 / H G P R T ） 基因突变试验1 范 围 本标准规定了体外哺乳类细胞（ V 7 9 / H G P R T ） 基因突变试验的基本技术要求。 本标准适用于评价食品生产、 加工、 保藏、 运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的遗传毒性， 检验对象包括食品添加剂（ 含营养强化剂） 、 食品新资源及其成分、 新资源食品、 辐照食品、 食品容器与包装材料、 食品工具、 设备、 洗涤剂、 消毒剂、 农药残留、 兽药残留、 食品工业用微生物等。2 原 理 细胞在正常培养条件下， 对 6 - T G的毒性作用敏感， 不能生存， 在致癌物和 或致突变物作用下， 某些细胞 X染色体上控制次黄嗦吟鸟嚓吟磷酸核糖转移酶（ H G P R T ） 的结构基因发生突变， 不能再产生H G P R T ， 从而使突变细胞对 6 - T G具有抗性作用。这些突变细胞在含有 6 - T G的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。根据突变集落形成数， 计算突变率以判定受试物的致突变性 。3 材料和试 剂3 . 1 细胞： 使用中国仓鼠肺（ V 7 9 ) 细胞株。为了减少 自发突变率， 正式实验前先将野生型细胞群体中存在的自 发H G P R T座位突变体选择性杀灭， 方法是将野生型细胞接种于含次黄嚷吟及胸腺嗜吮、 氨甲喋吟、 甘氨酸的 ME M培养液中培养 1 周， 然后重新接种于 ME M 培养液中。3 . 2 培养液： 采用ME M ( E a g l e ） 基础培养液或D ME M培养液， 补以1 0 小牛血清及适量抗菌素（ 青霉素、 链霉素） 。3 . 3 磷酸盐缓冲液（ 无钙、 镁 P B S ) 磷酸二氢钾（ K H 2 P O O 2 0 0 m g 磷酸氢二钠（ N a t H P O 1 2 H , 0 ) 2 . 8 9 g 氯化钾（ K C ll 2 0 0 m g 氯化钠（ N a C I ) 8 . 0 g 双蒸水1 0 0 0 m l . 高压消毒， 1 2 1 0C, O . 1 0 3 MP a , 2 0 m in ,3 . 4 胰蛋白酶 E D T A溶液： 用无钙、 镁 P B S 配制， 胰酶的浓度为 0 . 0 5 Y o , E D T A的浓度为 0 . 0 2 %, 胰蛋白酶与 E D T A溶液按 1 ， 1 混合。-2 0 储存。3 . 5 受试物： 最好能溶于培养液。也可溶于二甲基亚枫( D MS O ) ， 其浓度应低于 0 . 5 %（ 体积分数） 。3 . 6 阳性对照物： 可根据受试物的性质和结构选用不同的阳性对照物， 例如乙基磺酸醋( E MS ) ， 丝裂霉素 C ( MMC ) ， 甲基硝基亚硝基肌( MN N G ) ， 苯并（ a ) 花( B P ) 等。3 . 7 6 - T G ： 用 。 。 5 碳酸氢钠溶液配成 1 . 0 m g / m L , 4 储存。3 . 8 大鼠肝匀浆 S - 9 混合液： 按 A m e s 试验程序制备。4 操作步骤4 . 1 细胞准备： 将 5 X1 0 个细胞接种于直径为 1 0 0 m m平皿中， 于 3 7 0C, 5 二氧化碳培养箱中放置2 4 h o4 . 2 接触受试物： 吸去培养液， P B S 洗两次， 加人无血清培养液及一定浓度的受试物（ 需代谢活化者同GB 1 51 9 3 . 1 2 - 20 0 3时加人大鼠肝匀浆 S - 9 混合物） ， 置于培养箱中 2h ， 结束后吸去含受试物的培养液， 用 P B S 洗细胞两次， 换入含 1 0 血清的培养液， 继续培养 1 9 h -2 2 h ,4 . 3 表达： 接触受试物的细胞继续培养 1 9 h -2 2 h 后用胰酶- E D T A消化， 待细胞脱落后， 加入含 1 0 %血清培养液终止消化， 混匀， 放人离心管以 8 0 0 r / m i n -1 0 0 0 r / m in的速度离心 5 m i n -7 m in ， 弃去上清液， 制成细胞悬液， 计数， 以 5 X 1 0 5 个细胞接种于直径为 1 0 0 m m的平皿 ， 3 天后分传一次， 仍接种5 X1 0 5 个细胞培养 3 天。4 . 4 细胞毒性测定： 将上述首次消化计数后的细胞每皿接种2 0 0 个， 每组5 个皿， 3 7 0C, 5 二氧化碳条件下培养7 天， 固定， G ie rn s a 染色， 计数每皿集落数， 以相对于溶剂对照组的集落形成率表示细胞毒性。即以溶剂对照的集落形成率为1 0 0 写( 1 . 0 0 ) ， 求出各检品试验组的相对值。A ） 1 0 0 。 二， 。 。 。 。 。 。 一 （1） 只BC 式中： A 相对集落形成率 ； B 试验组集落形成率， C -溶剂对照组集落形成率。4 . 5 突变体的选择及集落形成率的测定： 表达结束后， 消化细胞， 分种， 每组5 个皿， 每皿种2 X1 0 5 个细胞， 待细胞贴壁后加人6 - T G， 终浓度为5 K g / m g ， 放人培养箱培养8 天1 0 天后固定， G ie m s a 染色，统计每皿集落数， 并计算突变率。同时另做集落形成率测定。每皿接种2 0 0 个细胞， 不加6 - T G ， 每组5个皿， 7 天后固定染色， 计算集落形成率。（2）式 中：D 集落形成率；E 一 一 实际存活的细胞集落数；F一 一接种细胞数 。（3 ）1D 火式中：G 突变率；H 突变集落数；I - 一 接种细胞数；D 集落形成率。5 结果判定5 . 2若阴性对照中， 集