《微生物学教程》周德庆(第二版)6.ppt

第6章微生物的生长及其控制 第1节测定生长繁殖的方法第2节微生物的生长规律第3节影响微生物生长的主要因素第4节微生物培养法概论第5节有害微生物的控制 微生物不论在自然条件下还是在人为条件下发生作用 都需要达到一定的数量才能实现 微生物生长的定义是指微生物个体数目的增加 即繁殖 微生物死亡的定义是指细胞永久失去繁殖的能力 第1节测定生长繁殖的方法一 测生长量 一 直接法测细胞干重测细胞湿重 二 间接法比浊法测生理指标 二 计个体数 一 直接法用计数板在光学显微镜下直接观察并计数 荧光染料染色 活菌为绿色 死菌为红色 二 间接计数法比法浊平板菌落计数法 1 浇注平板法 pourplate 2 涂布平板法 spreadplate 厌氧菌的菌落计数滚管培养法 教材P168 第2节微生物的生长规律一 微生物的个体生长和同步生长研究单细胞微生物的个体生长很困难 1 同步培养 synchronousculture 使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样的细胞生长和分裂周期的培养方法 2 同步生长 synchronousgrowth 某细胞群体中所有个体细胞处于分裂步调一致的生长状态 获得同步生长的方法 1 环境条件诱导法 2 机械筛选法 膜洗脱法 薄膜洗脱法收集的大肠杆菌在葡萄糖基础培养基中的同步生长 二 单细胞微生物的典型生长曲线 同步 封闭 单细胞微生物的典型生长曲线 一 延滞期 lagphase 培养开始最初细胞数目没有增加的一段时期 特点 生长速率常数为零 但合成代谢十分活跃 细胞形态变大或增长 细胞内RNA 尤其是rRNA 含量增高 对外界不良条件反应敏感 生长速率常数 R 单位时间内细胞数目或细胞量的变化 影响延滞期长短的主要因素 1 菌种生长快的菌比生长缓慢的菌延滞期短 2 接种菌菌龄采用对数生长期的菌作为接种菌可缩短延滞期 3 接种量适当提高接种量可缩短延滞期 4 培养基成分营养丰富 与种子培养条件接近的培养基可缩短延滞期 二 指数期 对数生长期 exponentialphase 紧接延滞期后细胞数目以几何级数增长的一段时期 特点 生长速率常数R最大 代时G最短 细胞进行平衡生长 酶系活跃 代谢旺盛 代时 G 1个细胞分裂为2个所需要的时间 影响指数期微生物代时长短的主要因素 菌种原核比真核短 小的真核比大的真核短 营养成分营养物浓度生长限制因子 growth limitedfacter 4 培养温度 教材表6 1 三 稳定期 stationaryphase 是在对数生长之后细胞群体进入的生长与死亡处于动态平衡的一段时期 特点 生长速率常数R 0菌体产量达到最高某些细胞开始启动一些特殊的代谢途径 形成芽孢 形成贮存颗粒 形成次级代谢产物 稳定期到来的原因 营养物质的耗尽 营养物比例失调 有害代谢产物的积累 pH 氧化还原势等条件越来越不适宜 四 衰亡期 declinephase deathphase 整个群体生长速率R为负值的时期 特点 个体死亡速度超过新生速度 R为负值 细胞形态发生多形化 细胞开始自溶 产生衰亡期的主要原因 环境对继续生长越来越不利 三 微生物的连续培养连续培养的目的长时间地保持微生物的对数生长状态以提高经济效益 连续培养的方式恒浊器恒化器 单级多级 单级多级 连续培养的利弊利 高效节约 自控 产品质量稳定弊 菌种易退化 易污染 营养物利用率低于单批培养 4 连续培养时间是有限制的 四 微生物的高密度培养自学教材P159 160 第3节影响微生物生长的主要因素 影响微生物生长的因素很多 但主要的因素有4个 水分 温度 氧气和pH值 一 水分对微生物生长的影响水活度水活度 wateractivity aw 它表示在天然或人工环境中 微生物可实际利用的自由水或游离水的含量 aw PP0 教材P93 农业土壤中的aw一般在0 9 1之间 生长最低aw 细菌 一般 0 90 0 98嗜盐菌 0 75 约5 5MNaCl 酵母菌 一般 0 87 0 91高渗酵母 0 61 0 65鲁氏酵母 0 60 霉菌 一般 0 80 0 87耐旱菌 0 65 0 75双孢旱霉 0 60 调剂溶质 compatiblesolutes 生活在水活度低 渗透压高 的环境中的微生物如何获得水分 细胞处于正态水平衡positivewaterbalance 靠提高细胞内部溶质的浓度 1 泵入无机离子 2 合成或提高某种有机溶质的浓度 直接合成或从环境中积累 用来调节细胞内水活度或溶质浓度的溶质叫调剂溶质 compatiblesolutes 它必须不阻碍细胞内其他生化过程 细胞内调剂溶质的浓度取决于外部溶质浓度 每种生物合成或积累调剂溶质的最大量是由每种生物的基因决定的一种特性 这决定了不同的生物对水活度的不同耐受性 微生物的调剂溶质微生物积累的主要溶质生长最低aw 细菌甜菜碱 脯氨酸 G 0 97 0 90淡水蓝藻蔗糖 海藻糖0 98海水蓝藻 葡萄糖基甘油0 92盐湖蓝藻甜菜碱0 90 0 75嗜盐厌氧甜菜碱 ectoine 海藻糖0 90 0 75光合细菌极端嗜盐古菌KCl0 75和一些细菌 微生物的调剂溶质微生物积累的主要溶质生长最低aw 海洋藻类甘露醇 各种糖苷 0 92脯氨酸 二甲基巯基丙酸杜氏藻甘油0 75 嗜盐绿藻 耐干旱酵母甘油0 83 0 62耐旱丝状真菌甘油0 72 0 61 杜氏藻 Dunaliella 微生物中几种主要的有机调剂溶质 甜菜碱 海藻糖 蔗糖 甘油 甘露醇 二甲基巯基丙酸 二 温度对微生物生长的影响微生物生长的三个温度常数 温度三基点最低生长温度 minimumtemperature 最适生长温度 optimumtemperature 最高生长温度 maximumtemperature 三基点对于每种微生物一般是其特有的 但又不完全固定 它们能被其他的环境因子轻微地改变 尤其是生长的培养基质对基本温度的影响大 最低生长温度 在此温度下 生长不会发生 细胞膜不能保持流动状态 影响营养物质的运输和质子动力的形成 最高生长温度 超过这一温度 不可能生长 高温使一些分子失活 细胞膜破裂 最适生长温度 生长最快 微生物生长的温度范围根据微生物的最适温度可将它们划分为4大群 1 嗜冷菌 psychrophiles Topt 15 永久寒冷的地区 2 嗜温菌 mesophiles Topt 45 温血动物 热带与温带土壤 水域 3 嗜热菌 thermophiles 很热的环境中 堆肥 Topt 45 4 超嗜热菌 hyperthermophiles Topt 80 极端热的环境 火山口 硫磺热泉 自燃煤堆 Growthrate 3 嗜冷菌冷适应的分子机理酶在冷的条件下能发挥最佳功能 膜中含有较高浓度的不饱和脂肪酸4 嗜热菌热适应的分子机理酶和其他蛋白质对热的稳定性更高 在高温有最好的功能 增加盐桥 大量的疏水内核 细胞内特殊的溶质 环2 3 二磷酸甘油 细胞内存在大量的分子伴侣 膜中含饱和脂肪酸 植烷和醚形成的单层膜 三 氧气对微生物生长的影响1 按照微生物与氧的关系 可将它们分为2大类 好氧微生物 aerobes 厌氧微生物 anaerobes 2大类又可进一步分为5类 专性好氧 obligateorstrictaerobes 兼性厌氧 facultativeanaerobes 微好氧 microaerophilicbacteria 耐氧菌 aerotolerantanaerobes 专性厌氧菌 obligateanaerobes 好氧 厌氧 5类细菌在含有巯基乙醇的培养基中的生长和分布 氧的毒性形式的产生和消除羟自由基 OH 超氧化物 O2 单一态氧 O2 过氧化氢 H2O2 在呼吸过程中O2还原成H2O中产生的不可逆副产物 氧的毒性形式 1 过氧化氢 hydrogenperoxide H2O2 O2氧化黄素蛋白无一例外地要产生一种有毒的化合物 H2O2 O2 e H H2O2 FP H2O2 H2O22H2O O2 Catalase H2O2 NADH H 2H2O NAD Peroxidase 过氧化氢酶 过氧化物酶 2 超氧化物 superoxide O2 由H2O2的氧化作用以及其他酶 黄素蛋白 Q 铁硫蛋白 催化的氧化作用或加氧作用产生 2O2 2H O2 H2O2 超氧化物岐化酶 SOD 2H2O22H2O O2 过氧化氢酶 catalase O2 e O2 FP FeS Q等 3 羟自由基 hydroylradical OH 由离子辐射产生 少量的羟自由基可由于细胞内H2O2的积累而产生 H2O2 e H H2O OH 4 单一态氧 singletoxygen O2 能量很高 外围电子高度活化 产生方式 光化学反应 细胞含光敏色素P P hvP P O2 O2生物化学反应 各种过氧化物酶 类胡萝卜素能淬灭单一态氧 小结 毒性氧形式的产生O2 e O2 O2 e 2H H2O2H2O2 e H OH OH e H H2O O2 光 光敏色素过氧化物酶 O2 有毒氧的消除 超过氧化物岐化酶酶superoxidedismutase2O2 2H O2 H2O2过氧化氢酶catalaseH2O2 H2O22H2O O2过氧化物酶peroxidaseH2O2 NADH H 2H2O NAD 类胡萝卜素淬灭单一态氧 四 pH值对微生物生长的影响每一种生物都有一生长的pH值范围 一般有相当固定的最佳pH值 绝大多数自然环境的pH值在5 9之间 只有少数生物能在低于2或高于10的pH中生长 真菌最适pH 5细菌最适pH一般为中性6 0 7 5放线菌最适pH7 0 8 0 专性嗜酸菌 obligateacidophilicbacteria 在pH2 0 4 0生长 但不能在中性条件下生长 专性嗜酸菌的细胞膜在中性pH时溶解 细胞裂解死亡 专性嗜酸菌包括 硫杆菌属 Thiobacillus 硫化叶菌 Sulfolobus 嗜热支原体 Thermoplasm 等 嗜碱微生物 alkaliphilicmicroorganisms 生长最适pH10 11 在中性条件下不生长 嗜碱微生物包括 细菌 芽孢杆菌 外硫红螺菌 Ectothiorhodospira 放线菌 链霉菌 棒状杆菌蓝细菌古细菌真菌 参阅 土壤与环境微生物学 第20章 必须记住 这里讲的pH值是指外部pH值 细胞内的pH值一般都是保持中性左右的 在极端嗜酸或极端嗜碱菌中 细胞内的pH值可能比中性偏移1 1 5pH单位 大多数微生物的最适pH是在6 8之间 它们叫嗜中性微生物 细胞质pH保持中性或与中性非常接近 缓冲剂 Buffers 培养基中常需要加缓冲剂来维持pH的相对稳定 缓冲剂的有效pH范围很窄 不同的pH范围需要不同的缓冲剂 磷酸盐 常用KH2PO4 是接近中性的pH 6 7 5 范围的极好的缓冲剂 第4节微生物培养法概论一 实验室培养法 一 固体培养法1 好氧菌的固体培养琼脂平板 试管斜面 克氏扁瓶 2 厌氧菌的固体培养 1 高层琼脂柱 4 厌氧罐 2 厌氧培养皿 5 厌氧手套箱 3 亨盖特滚管技术 厌氧菌的分离 稀释摇管法 二 液体培养法1 好氧菌的液体培养在液体培养中 氧的供应始终是好氧菌生长繁殖的限制因子 提高氧浓度的措施有 1 浅层液体静止培养 2 摇瓶培养 3 深层液体底部通气 4 对培养液进行机械搅拌 2 好氧菌液体培养法 1 试管液体培养 2 三角瓶浅层液体培养 3 摇瓶培养 4 台式发酵罐3 厌氧菌的液体培养法 1 在培养液中加入还原剂 巯基乙醇 半胱氨酸 VC 疱肉 2 将培养物放入厌氧罐或厌氧手套箱中 3 在液面封上石蜡油 凡士林 石蜡油 二 生产实践中培养微生物的装置 一 固态培养法1 好氧菌的曲法培养2 厌氧菌的堆积培养 二 液体培养法1 浅盘培养2 深层液体通气培养发酵罐 第5节有害微生物的控制一 几个基本概念 控制害菌的措施 杀灭 抑制 灭菌 彻底杀灭 一切微生物 消毒 部分杀灭 仅杀灭病原菌 防腐 抑制霉腐微生物化疗 抑制宿主体内的病原菌 sterilization disinfection antisepsis chemotherapy 二 物理灭菌因素的代表 高温高温 辐射 超声波 微波 激光 静高压 过滤 一 高温灭菌的种类 高温灭菌 干热灭菌湿热灭菌 灼烧烘箱内热空气灭菌法 常压加压 常规加压灭菌 连续加压灭菌 巴氏消毒法煮沸消毒法间歇灭菌法 1 干热灭菌 dryheatsteriliazayion 灼烧 烧红 接种环 针烘箱 150 170 1 2h 干燥培养皿 移液管等玻璃器皿2 湿热灭菌 moistheatsterilization 用100 以上的加压蒸汽进行灭菌 1 常规加压蒸气灭菌法 normalautoclaving 121 1kg cm2 15 20min115 0 7kg cm2 30 35min 2 连续加压蒸气灭菌 continuousautoclaving 仅用于大型发酵厂的大批培养基灭菌 让培养基在管道的流动过程中快速升温 135 140 维持 5 15s 和冷却 然后流进发酵罐 3 间歇灭菌 fractionalsterilization tyndallization 适用于不耐热的培养基的灭菌 80 100 15 60min 37 保温过夜 重复3天 4 巴氏消毒法 pasteurization 专用于液态风味食品或调料 60 63 30minLTH72 15sHTST 5 煮沸消毒法100 数分钟 热死时间 thermaldeathtime 热死温度 thermaldeathpoint 二 影响加压蒸气灭菌效果的因素1 灭菌物体含菌量含菌量越高 需要的灭菌时间越长 2 灭菌锅内空气排除程度3 灭菌对象的pH值pH 6 0时 微生物易死pH60 8 0时 不易死亡4 灭菌对象的体积 三 高温对培养基成分的有害影响及其防止1 有害影响形成沉淀破坏营养改变pH 2 防止方法分别灭菌低压间歇灭菌过滤除菌其他方法 三 化学杀菌剂 消毒剂和治疗剂 化学因素 表面消毒剂 化学治疗剂 液体气体 抗代谢药物 黄胺抗生素生物药物素 一 表面消毒剂 二 化学治疗剂化学治疗 chemotherapy 是应用对寄生生物有专门作用的化学合成药物 这种药物能够杀死寄生物或抑制寄生物在机体内增殖 而对宿主没有或很小毒性 化学治疗剂 chemotherapeutant 用于化学治疗的化学物质 包括化学合成的药物 抗生素等 自学教材178 182页 化学治疗剂对微生物的作用范围 氮二烯五环 吡咯 多烯 烃 亚胺环己酮 放线菌酮 抗生素 antibiotics 1 定义抗生素是一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次级代谢产物或其人工衍生物 它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物的生命活动 2 产抗生素的生物种类大多数抗生素是三种主要的微生物 细菌 放线菌和丝状真菌的次级代谢产物 只有少数抗生素是较高级的真菌 藻类和植物所产生 而且这些抗生素都普遍具有较低的抗菌活性和较低的专一性 放线菌产生了数量最多 品种最多的抗生素 细菌产生的抗生素大多为多肽类 粘细菌研究较少 但已经显示出产生抗生素的频率很高 抗生素 多学科研究入门 美 GiancarloLancini编 王以光译 人民卫生出版社 1998 3 抗生素的作用部位 靶位 1 细胞壁 2 细胞膜 3 特殊代谢过程 4 核糖体 5 DNA 6 RNA的合成 4 抗细菌的抗生素 1 青霉素 主要抗G 青霉素G 对G 菌有强效 对G 菌效果差一点 对酸敏感 对青霉素酶敏感 6 APA 青霉素V 比青霉素G对酸稳定 氨苄青霉素 对酸稳定 抗G 和G 羧苄青霉素 抗G 对酸稳定 吸收差 甲氧西林 抗青霉素酶 效果不如青霉素G 对酸不稳定 Ticarcillin 类似羧苄青霉素 但对假单胞菌更有效 红霉素erythromicin 2 红霉素 主要抗G 是最常用的大环内脂类抗生素 由红霉素链霉菌 Streptomycinerythraeus 产生 与核糖体50S亚基作用 抑制蛋白质的合成 对军团菌尤其有效 3 链霉素 抗G 菌为主 也抗结核分枝杆菌 链霉素 卡那霉素 kanamycin 庆大霉素 gentamycin 新霉素 neomycin 等都是氨基苷类抗生素 过去临床上常用来抗G 细菌 现在一般作为保留药物 只有当其他抗生素无效时才起用 链霉素与细菌30S亚基反应 抑制细菌蛋白质的合成 链霉素streptomycin 链霉胍 链霉糖 与30S亚基反应 抑制蛋白质的合成 庆大霉素Gentamicin 庆大霉素由紫红小单胞菌Micromonosporapurpurea产生 抗G 和G 4 万古霉素 抗G 和G 万古霉素 vancomycin 由东方链霉菌Streptomycinorientalis产生 阻断新生肽聚糖单位的聚合 抑制细菌细胞壁的合成 5 头孢霉素 抗G 和G 头孢霉素 Cephalosporins 从真菌顶头孢霉 Cephalosporiumacremonium 中发现 抗菌谱广 一般需注射 7 氨基头孢霉素烷酸 第一代头孢对G 菌疗效好 第二代头孢对G 菌疗效好 对很多G 菌疗效也好 第三代头孢对许多G 菌 如铜绿假单胞菌 具有抗性且不被内酰胺酶所破坏 常能达到中枢神经系统 6 广谱抗生素 氯霉素 四环素 金霉素 土霉素 氯霉素Chloramphenicol 氯霉素 Chloramphenicol 最早由委内瑞拉链霉菌Streptomycinvenezuelae生产 现由化学合成 毒性大 只在不得已时应用 四环素 Tetracycline 由链霉菌产生 或由半合成而来 主要是抑菌 高剂量会产生恶心 腹泻 小儿黄牙 并对肝肾造成损害 5 抗真菌的抗生素 1 与麦角甾醇结合 多烯烃 polyene 类抗生素两性霉素B AmphotericinB 制霉菌素 Nystatin 作用机制 与细胞膜上麦角甾醇结合 破坏细胞膜的结构 影响细胞膜的透性 使细胞裂解 疗效与副作用相当 仅用于危及生命的感染 都由链霉菌产生 2 抑制麦角甾醇合成 吡咯类 azole 抗生素和丙烯胺 allylamines 咪唑 imidazole 酮康唑 Ketoconazole 作用机制 抑制麦角甾醇的合成 使细胞裂解 几乎没有严重的副作用 具有广