生物物质分离与提纯.doc

第一章 绪论一、生物分离纯化的概念指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。二、生物物质及来源生物物质：氨基酸及其衍生物活性多肽类蛋白质类酶类核酸及其降解物类糖类脂质类动物器官或组织制剂小动物制剂菌体制剂来源：动物器官与组织植物器官与组织微生物及其代谢物细胞培养产物血液、分泌物及其代谢物三、生物分离纯化技术的特点：环境复杂、分离纯化困难含量低、工艺复杂稳定性差、操作要求严格目标产物最终的质量要求很高最终产品纯度的均一性与化学分离上的纯度的概念不完全相同四、分离纯化方法选择的原则技术路线、工艺流程尽量简化尽可能采用低成本的材料与设备将完整工艺流程划分为不同的工序注意时效性采用成熟技术和可靠设备检测纯化过程中产物产量和活性五、原材料的选择1.与目标产物含量相关的因素：合适的生物品种；合适的组织器官；生物材料的种属特异性；合适的生长发育阶段；合适的生理状态2.天然生物材料的采后处理：原因：细胞自溶导致目标产物失活或降解；易受微生物污染导致目标产物失活或降解；易受光照、氧气等的作用导致其分子结构改变。一般植物材料需进行适当的干燥后再保存；动物材料须经清洗后速冻、有机溶剂脱水或制成丙酮粉在低温下保存六、成品的保存：影响生物产品保存的主要因素：空气（避空气）；温度（低温）；水分（干燥），光线（避光）；pH（缓冲液）；保存期蛋白质和酶制品的保存方法；低温保存（-205 ， -70最好）；制成干粉或结晶保存；保存时添加保护剂：a.惰性的生化或有机化合物（糖类、脂肪酸、牛血清白蛋白、氨基酸、多元醇等）b.中性盐（MgSO4 、 NaCl 、(NH4)2SO4等）c.巯基试剂（半胱氨酸或巯基乙醇）七、分离纯化的基本步骤：发酵液的预处理；固液分离；初步纯化（分离提取）；高度纯化（精制）；成品加工第二章 发酵液的预处理和固液分离一、预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。 相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。方法：凝聚和絮凝； 加热法；调节悬浮液的PH值；杂蛋白的去除；高价无机离子的去除；助滤剂和反应剂凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成 mm 大小块状凝聚体的过程。机理：中和粒子表面电荷；消除双电层结构；破坏水化膜。絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。机理：架桥作用，絮凝剂通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生架桥联结时，就形成较大絮团，产生絮凝作用。 絮凝的影响因素：发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）；絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一 半被聚合物覆盖；絮凝剂的分子量；pH 控制；搅拌速度。常见絮凝剂：人工合成有机高分子聚合物（聚丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物）、天然有机高分子聚合物、无机高分子聚合物、微生物絮凝剂杂蛋白的去除：沉淀法（等电点沉淀法；酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉淀）变性（加热；大幅度调节pH值；加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等）吸附法（加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白而除去）固液分离方法：过滤；离心；膜分离；双水相萃取设备：实验室用抽滤装置。工业生产：板框压滤机（间歇操作）；转筒真空过滤机（连续操作）；过滤式离心机；硅藻土过滤机离心机种类和用途：按速度和离心力：1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)10E4g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机 110E4-2.510E4rpm，相对离心力10E410E5g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3、超速离心机 转速2.5-810E4rpm，相对离心力510E5g；用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心。 按离心机的作用方式：斜角式；平抛式；管式；蝶式；螺旋式；多室第三章 细胞破碎破碎方式：1.机械法：固体剪切作用（珠磨法，压榨，研磨）；液体剪切作用（高压匀浆，超声破碎）；2.非机械法：干燥处理；溶胞作用（酶溶法，化学法，物理法）。酶法和化学法溶胞应用最广酶解法的特点：优点：发生酶解的条件温和；能选择性地释放产物；胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整。缺点：溶酶价格高；溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶)；产物抑制的存在。常用溶酶：溶菌酶，-1，3-葡聚糖酶，-1，6-葡聚糖酶，蛋白酶，甘露糖酶，糖苷酶，肽键内切酶，壳多糖酶适用范围：酶解法的特点是专一性强，因此在选择酶系统时，必须根据细胞的结构和化学组成来选择。溶菌酶能专一性地分解细胞壁上肽聚糖分子的-1,4糖苷键，因此主要用于细菌类细胞壁的裂解。革兰氏阳性菌悬浮液中加入溶菌酶，很快就产生溶壁现象。但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶无效果，必须与螯合剂EDTA一起使用。放线菌的细胞壁结构类似于革兰氏阳性菌，以肽聚糖为主要成分，所以也能采用溶菌酶，酵母和真菌由于细胞壁的组分主要是纤维素、葡聚糖、几丁质等，常用蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等。植物细胞壁的主要成分是纤维素，常采用纤维素酶和半纤维素酶裂解。有时采用几种酶的混合物会产生更好的效果，加入时需确定相应的次序。对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。化学渗透法：酸碱处理法，表面活性剂，有机溶剂，EDTA螯合剂特点：优：对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。缺点：通用性差；时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；有些化学试剂有毒；化学试剂的加入常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度机械法：高压匀浆破碎法，高速珠研磨破碎法，超声波破碎法包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性包涵体的纯化方法：收集菌体细胞细胞破碎包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性常见工艺路线及特点机械破碎（高压匀浆，高速珠磨）离心提取包涵体加变性剂溶解除变性剂复性。特点：利用了包涵体与细胞碎片的密度差，用离心法将包涵体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包涵体，再对包涵体溶解复性。优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包涵体的形成对分离纯化亦有好处。缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。机械破碎膜分离获得包涵体加变性剂溶解包涵体除变性剂复性。特点：应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。缺点：细胞碎片和包涵体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。化学破碎（加变性剂）离心除去细胞碎片除变性剂复性。特点：用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包涵体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。第四章 沉淀法沉淀法：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程常用沉淀法：盐析法；等电点沉淀法；有机溶剂沉淀法；非离子型聚合物沉淀法；聚电解质沉淀法；复合盐沉淀法；亲和沉淀法；选择性沉淀法。盐析：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。原理：（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集。将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，使蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域。由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。（3）中和电荷，减少静电斥力。中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。盐析的影响因素：pH值，温度，蛋白质浓度有机溶剂沉淀法：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。原理：A. 降低溶剂介电常数（介电常数D有机 D水） ，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。B. 破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。C. 相反力：疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层影响因素：1、温度。使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。因此，所用的有机溶剂须预先冷却到-10-20；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行 2、pH值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。3、样品浓度：样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用 。一般认为蛋白质的初浓度以0.52为好，粘多糖则以12较合适。4、中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.010.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。 5、某些金属离子：一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。等电点沉淀法：在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为等电点沉淀。原理：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。亲和沉淀：利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的变小。选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。第五章 膜分离技术膜分离技术：用半透膜作为选择障碍层，利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的技术。常见技术：透析DS，微滤MF，超滤UF，纳滤NF，反渗透RO，电渗析ED，渗透气化PV过程膜结构驱动力应用对象实 例微滤对称微孔膜0.0510m压力差消毒、澄清收集细胞培养悬浮液除菌，产品消毒，细胞收集超滤不对称微孔膜0nm压力差大分子物质分离蛋白质的分离/浓缩/纯化/脱盐/去热源纳滤复合膜1nm压力差Donna效应小分子物质分离糖/二价盐/游离酸的分离反渗透致密膜、复合膜1nm压力差小分子物质浓缩单价盐/非游离酸的分离透析对称的或不对称的膜浓度差小分子有机物/无机离子除小分子有机物或无机离子道南（Donnan）效应：纳滤膜本体带有电荷性，对相同电荷的分子（阳离子）具有较高的截留率。表征膜性能的参数：截断分子量、水通量、孔道特征、pH适用范围、抗压能力、对热和溶剂的稳定性等膜两侧传递理论：1.浓差极化：在分离过程中，料液中溶剂在压力驱动下透过膜，大分子溶质被带到膜表面，但不能透过，被截留在膜的高压侧表面上，造成膜面浓度升高，于是在膜表面与临近膜面区域浓度越来越高，产生膜面到主体溶液之间的浓度梯度，形成边界层，使流体阻力与局部渗透压增加，从而导致溶液透过流量下降，同时这种浓度差导致溶质自膜反扩散到主体溶液中，这种膜面浓度高于主体浓度的现象称为浓差极化。在膜分离过程中，浓差极化是经常发生的现象，是影响膜分离技术在某些方面应用的拦路虎。改善浓差极化对策：提高膜面剪切力，减少边界层厚度，措施： 错流；两流体间的流动方向互为垂直交叉的流动。 进料流速； 湍流程度提高，设备改进：a. 小型设备装搅拌； b. 装湍流促进器；2.阻力模型：边界层的形成对透过通量产生附加的传质阻力3.管状收缩效应的影响：胶体溶液在管中流动时，颗粒有离开管壁向中心运动的趋向，称为管状收缩效应，由于这个现象，使膜面上沉积的颗粒具有向中心横向移动的速度，使膜面污染程度减轻，通量增大。影响膜分离的因素：压力；温度；浓度；流速；其它因素（如pH）膜污染：是指处理物料中的微粒，胶体或溶质大分子与膜存在物理化学作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸附，沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化现象。膜污染的表现一是膜通量下降；二是通过膜的压力和膜两侧的压差逐渐增大；三是膜对生物分子的截留性能改变。膜污染与浓差极化在概念上不同， 浓差极化加重了污染，但浓差极化是可逆的，即变更操作条件可使之消除，而污染是不可逆的，必须通过清洗的办法，才能消除。 膜污染：是指处理物料中的微粒，胶体或溶质大分子与膜存在物理化学作用或机械作用而引起的在膜表面或膜孔内吸附，沉积造成膜孔径变小或堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化现象。膜污染的表现一是膜通量下降；二是通过膜的压力和膜两侧的压差逐渐增大；三是膜对生物分子的截留性能改变。膜的污染类型：沉淀污染、吸附污染、生物污染 沉淀污染对RO和NF的影响尤为显著。当过滤液中盐的浓度超过了其溶解度，就会在膜上形成沉淀或结垢。普遍受人们关注的污染物是钙、镁、铁和其它金属的沉淀物，如氢氧化物、碳酸盐和硫酸盐等。有机物在膜表面的吸附通常是影响膜性能的主要因素。随时间的延长，污染物在膜孔内的吸附或累积会导致孔径减少和膜阻增大，这是难以恢复的。生物污染是指微生物在膜内积累，从而影响系统性能的现象。膜组件内部潮湿阴暗，是一个微生物生长的理想环境，微生物粘附和生长形成生物膜。老化生物膜主要分解成蛋白质、核酸、多糖酯等，强烈吸附在膜面上引起膜表面改性。微生物生物膜，可直接(通过酶作用)或间接(通过局部pH或还原电势作用)降解膜材料，造成膜寿命缩短，膜结构完整性被破坏。 细菌对不同聚合物粘附速率大不相同。如聚酰胺膜比醋酸纤维素膜更易受细菌污染。所以，生物亲和性被降低和易清洗的聚合物为材质的分离膜，会阻碍生物膜的生长。防止膜污染的方法：进料液的预处理：预过滤、pH及金属离子控制；选择合适的膜材料：减轻膜的吸附；改善操作条件：加大流速。清洗方法：利用膜的不对称性和膜组件的结构特点进行清洗化学法：选择清洗剂要注意三点：1要尽量判别是何种物质引起污染；2清洗剂要不致于对膜或装置有损害，3要符合产品要求。常用清洗剂：NaOH，酸，表面活性剂，氧化剂，酶，有机溶剂物理法：海绵球擦洗，热水法，反冲洗和循环清洗常见的膜过滤装置有四种类型：平板式 卷式（螺旋式）管式 中空纤维式膜分离的应用：膜分离技术目前已经广泛应用于各个工业领域，并已使海水淡化，乳品加工等多种传统的生产面貌发生了根本性的变化。膜分离技术已经形成了一个相当规模的工业技术体系。应用领域：1、海水淡化、高质量饮用水、工业供水、医药用水：采用活性炭吸附过滤和超滤结合制取高质量饮用水，设备投资少，成本低，是优质饮用水制备的经济有效方法。医药针剂用水是采用多级蒸馏制备的，其工艺繁琐、能耗高、而且质量常常得不到保证。用膜技术除针剂热源，取得很好效果。2、膜技术在各种工业生产中的应用：凡涉及分子级的浓缩和分离的过程，都有膜技术应用的机会。汽车电泳漆的在线纯化采用超滤膜除去杂质；燃料工业用超滤膜技术分离和浓缩中间体。3、在环境保护和废水的应用：膜技术在废水处理（印染、影印、电镀、造纸）得到广泛应用。在许多情况下，不仅处理了废水，保护环境，还能回收有用物质。4、膜技术在食品领域的应用：酱油、醋、果汁澄清和浓缩、乳制品生产、制糖工业、食用菜籽油的纯化都采用了膜技术。应用：水的纯化，固液分离，纯化小分子，浓缩大分子，去热原，膜生物反应器第六章 溶剂萃取法萃取 : 溶质从料液转移到萃取剂的过程。当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时，生化物质倾向于在两相之间进行分配，当条件选择得恰当时，所需提取的生化物质就会有选择性地发生转移，集中到一相中，而原来溶液中所混有的其它杂质（如中间代谢产物、杂蛋白等）分配在另一相中，这样就能达到某种程度的提纯和浓缩 反萃取：溶质从萃取剂转移到反萃剂的过程。完成萃取操作后，为进一步纯化目标产物或便于下一步分离操作的实施，将目标产物从有机相转入水相的操作就称为反萃取物理萃取和化学萃取：物理萃取的理论基础是分配定律，而化学萃取服从相律及一般化学反应的平衡定律。化学萃取：利用可与被萃目标物发生反应的非极性物质作为萃取剂进行的反应。物理萃取：利用溶剂对需分离组分有较高的溶解能力，分离过程纯属物理过程。料液：在溶剂萃取中，被提取的溶液溶质：其中欲提取的物质萃取剂：用以进行萃取的溶剂萃取液：经接触分离后，大部分溶质转移到萃取剂中，得到的溶液，余液：被萃取出溶质的料液。带溶剂：对于水溶性强的溶质，可利用脂溶性萃取剂与溶质间的化学反应生成脂溶性复合分子，使溶质向有机相转移。这种溶剂称为带溶剂。乳化：水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象去乳化：根据乳化的程度和乳浊液的形式，采用适当的方法去除乳化现象，如采用过滤或离心，加热、稀释、加电解质等方法发酵液乳化的原因：蛋白质的存在，起到表面活性剂的作用 ；固体粉末对界面的稳定作用除去方法：物理法：离心、加热，吸附，稀释；化学法：加电解质、其他表面活性剂溶剂萃取法的特点：萃取过程有选择性；能与其它步聚相配合；通过相转移减少产品水解；适用于不同规模；传质快；周期短，便于连续操作；毒性与安全环境问题弱电解质在有机溶剂-水相的分配平衡：分配系数中CL和CH 必须是同一种分子类型，即不发生缔合或离解。对于弱电解质，在水中发生解离，则只有两相中的单分子化合物的浓度才符合分配定律。 例如青霉素在水中部分离解成负离子（青COO），而在有机溶剂相中则仅以游离酸（青COOH）的形式存在，则只有两相中的游离酸分子才符合分配定律。此时，同时存在着两种平衡，一种是青霉素游离酸分子在有机溶剂相和水相间的分配平衡；另一种是青霉素游离酸在水中的电离平衡（图18-2）。前者用分配系数K0来表征，后者用电离常数Kp来表征。对于弱碱性物质也有类似的情况。 为什么青霉素在酸性（pH2.5）条件下，而红霉素却要在碱性（pH9.8）条件下才能被萃取到丁酯中去呢？1 根据表观分配系数公式可知，弱酸的表观分配系数：K=K0 /(1 10 pH pK )；弱碱的表观分配系数： K=K0 /(1 10 pK pH )对于弱酸：pH pK 时，分配系数大2 不同pH条件影响弱电解质电离，从而影响分子的极性，根据相似相溶原则，在弱极性的丁酯中极性小的分子溶解度比水中大，故从水相转入丁酯相中，而发酵液中存在的其它杂质由于极性情况与抗生素不同，故很少进入丁酯中，这样就达到一定程度的纯化青霉素 红霉素酸碱性pHpK弱酸性(2.75) 弱碱性(9.4) 游离分子 “ + ” “ ” 游离分子 影响溶剂萃取的因素：pH、温度、盐析。pH低有利于酸性物质分配在有机相，碱性物质分配在水相。T，分子扩散速度，故萃取速度，一般生化物质的萃取在室温或较低温度下进行。无机盐氯化钠、硫酸铵，作用：生化物质在水中溶解度，K ；两相比重差 两相互溶度操作方式：单级萃取，多级错流萃取，多级逆流萃取单级萃取：只包括一个混合器和一个分离器多级错流萃取：料液经萃取后，萃余液再与新鲜萃取剂接触，再进行萃取。第一级的萃余液进入第二级作为料液，并加入新鲜萃取剂进行萃取；第二级的萃余液再作为第三级的料液，以此类推。此法特点在于每级中都加溶剂，故溶剂消耗量大，而得到的萃取剂平均浓度较稀，但萃取较完全。多级逆流萃取：在多级逆流萃取中，在第一级中连续加入料液，并逐渐向下一级移动，而在最后一级中连续加入萃取剂，并逐渐向前一级移动。料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故称为逆流萃取。在逆流萃取中，只在最后一级中加入萃取剂，故和错流萃取相比，萃取剂之消耗量较少，因而萃取液平均浓度较高。 超临界流体(SCF)即处于临界温度、临界压力以上的流体。在临界温度、压力以上，无论压力多高，气体都不能液化但流体的密度随压力增高而增加。超临界萃取：利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待分离的物料(液体或固体)接触，萃取出目的产物，然后通过降压或升温的方法，使萃取物得到分离。原理：超临界流体具有选择性溶解物质的能力，并随着临界条件（T，P）而变化。超临界流体可从混合物中有选择地溶解其中的某些组分，然后通过减压，升温或吸附将其分离析出。特点：密度接近液体，萃取能力强；粘度接近气体，传质性能好常用萃取剂：极性萃取剂：乙醇、甲醇、水（难）；非极性萃取剂：二氧化碳（易）超临界CO2萃取的特点 ：1、可以在接近室温(35-40)及CO2气体笼罩下进行提取，有效地防止了热敏性物质的氧化和逸散，完整保留生物活性，而且能把高沸点，低挥发渡、 易热解的物质在其沸点温度以下萃取出来。2、由于全过程不用有机溶剂，因此萃取物绝无残留溶媒，同时也防止了提取过程对人体的毒害和对环境的污染，100%的纯天然，符合当今“绿色环保”、“回归自然”的高品位追求。3、控制工艺参数可以分离得到不同的产物，可用来萃取多种产品，而且原料中的重金属、无机物、尘土等都不会被CO2溶解带出。4、蒸馏和萃取合二为一，可以同时完成蒸馏和萃取两个过程，尤其适用于分离难分离的物质，如有机混合物、同系物的分离精制等 。 5、能耗少；热水、冷水全都是闭路循环，无 废水、废渣排放。CO2也是闭路循环，仅在排料时带出少许，不会污染环境。由于能耗少、用人少、物料消耗少，所以运行费用非常低。因此，CO2特别适合天然产物有效成分的提取。对于天然物料的萃取，其产品真正称得上是100%纯天然的“绿色产品”。应用：医药工业：中草药提取；酶，纤维素精制 化学工业：金属离子萃取；烃类分；共沸物分离；高分子化合物分离 食品工业：植物油脂萃取；酒花萃取；植物色素提取 化妆品香料：天然香料萃取；化妆品原料提取精制带电溶剂：？第七章 离子交换法离子交换层析（IEC）是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。原理：主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离。选择适当条件可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质不能被交换，这两种物质就可被分离。带同种电荷的不同离子虽都可以结合到同一介质上，但由于带电量不同，与介质的结合牢度不同，改变洗脱条件可依次被洗脱而达到分离的目的。过程：开始，吸附，解吸附，解吸结束，再生树脂组成：基质，交联剂，电荷基团分类：阴离子交换树脂（强碱性，弱碱性）；阳离子交换树脂（强酸性，弱酸性）操作：1 树脂的选择2 树脂预处理3 离子交换吸附4 洗脱5 再生离子交换法的应用：纯水的制备工艺氨基酸洗脱曲线：蛋白质离子交换分离的基本步骤：平衡，上样吸附，洗脱，再生第八章 层析流动相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。分配系数：K： 指某一组分在固定相与流动相中含量的比值迁移率：Rf：指某一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离的比值。层析：以基质为固定相（柱状或薄层状），以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。 吸附层析：吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物与吸附剂通过连续的吸附与解吸附而完成混合物中的各组分分离。吸附层析在各种层析技术中应用最早，吸附剂来源丰富，价格低廉，易再生，装置简单 ，又具有一定的分辩率，故应用广泛。操作：层析柱的选择，吸附剂及其用量选择，装柱，上样，洗脱。常用的吸附剂有极性的和非极性的两种。羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者，活性炭属后者。在实践中不论选择那种类型的吸附剂，都应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。为了便于解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂，反之亦然。洗脱剂选择：纯度较高；稳定性好；能较完全洗脱所分离的成分；黏度小；易和所需要的成分分开。 分配层析：分配层析是利用各组分的分配系数不同而予以分离的方法。 分配系数(K)是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值： K=固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度 原理：在分配层析中，通常用多孔性固体支持物如滤纸、硅胶等吸着一种溶剂作为固定相，另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂沿固定相流动构成流动相，某溶质在流动相的带动下流经固定相时，会在两相间进行连续的动态分配。当样品中含有多种分配系数各不相同的组分时，分配系数越小的组分，随流动相迁移的越快。两个组分的分配系数差别越大，在两相中分配的 次数越多，越容易被彻底分离。 操作：样品处理，点样，平衡，展开，显色，定性分析，定量分析纸层析属于典型的分配层析，且系统简单，使用方便，在生物化学的发展中发挥过极其重要的作用。凝胶层析：凝胶层析，又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相，利用混合液中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。其设备简单，操作方便，不需要再生处理即可反复使用，适用于不同相对分子质量的各种物质的分离，已广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域。 原理：当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。常用凝胶的有：葡聚糖凝胶（Sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）、琼脂糖凝胶（Sepharose）以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。操作：层析柱的选择，装柱，加样（样品体积一般为柱体积的1%-10%），洗脱，应用：生物大分子的纯化，分子量的测定，脱盐及去除小分子杂质的，去热源物质，溶液的浓缩。特点：操作简便，所需设备简单；分离效果好，重复性高；分离条件缓和；应用广泛；分辨率不高，分离操作较慢。热源物质：是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。亲和层析：亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。 原理：生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。操作：（1）装柱：均匀，无气泡；（2）平衡（equilibrium)：缓冲液,pH, 盐浓度；（3）上样(loading)：蛋白浓度，pH, 盐浓度，缓冲液；（4）洗涤(washing)：pH, 盐浓度，洗涤剂，缓冲液；（5）洗脱(elution)：条件与吸附相反；（6）清洗(cleaning)：弱酸，弱碱，蛋白质变性剂（尿素，盐酸胍，硫氰酸盐）；（7）再生：与平衡条件相同制备吸附剂：基质的选择，基质的活化，间隔壁分子（手臂）的引入，配体的选择，配体与基质的偶联优缺点：1. 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。2. 是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。3. 除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误识别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。4. 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。应用：主要为生物大分子的分离和纯化。抗原和抗体，生物素和亲和素，激素和受体蛋白，凝集素和糖蛋白，辅酶和酶，金属螯合色谱。第九章 产品精制蒸发：用加热的方法，使溶液中部分溶剂汽化除去，从而提高溶液的浓度，或使溶液浓缩到饱和而析出溶质的一种操作过程。结晶：物质从液态(溶液或熔融体)或气态形成晶体的过程，是获得纯净固态物质的重要方法之一干燥：从湿物料中除去湿分(水分或其它溶剂)的各种单元操作。 生蒸汽：蒸发过程中所用的加热蒸汽。二次蒸汽：蒸发过程中，物料中的水分汽化所形成的蒸汽称二次蒸汽。单效蒸发：产生的二次蒸汽不加利用，直接冷凝排出。多效蒸发：把蒸发产生的二次蒸气引至另一操作压力较低的蒸发器作为加热蒸气，并把若干个蒸发器串联组合使用，这种操作称为多效蒸发。初次成核：过饱和溶液中的自发成核现象二次成核：向介稳态过饱和溶液中加入晶种，会有新晶核产生溶解度曲线：溶解度曲线由于固体物质的溶解度随温度变化而变化，随温度一定而一定，这种变化可以用溶解度曲线来表示。我们用纵坐标表示溶解度，横坐标表示温度，绘出固体物质的溶解度随温度变化的曲线，这种曲线叫做溶解度曲线。过饱和曲线：溶液饱和时溶质不能析出。溶质浓度超过该条件下的溶解度时，该溶液称为过饱和溶液。过饱和溶液达到一定浓度时会有溶质析出，开始形成新的固相时，过饱和浓度和温度的关系可用过饱和曲线描述。蒸发操作的特点：（1）溶液沸点升高 被蒸发的料液是含有非挥发性溶质的溶液，由拉乌尔定律可知，在相同的温度下，溶液的蒸汽压低于纯溶剂的蒸气压。换言之，在相同压力下，溶液的沸点高于纯溶剂的沸点。因此，当加热蒸汽温度一定，蒸发溶液时的传热温度差要小于蒸发溶剂时的温度差。溶液的浓度越高，这种影响也越显著。在进行蒸发设备的计算时，必须考虑溶液沸点上升的这种影响。（2）物料的工艺特性 蒸发过程中，溶液的某些性质随着溶液的浓缩而改变。有些物料在浓缩过程中可能结垢、析出结晶或产生泡沫；有些物料是热敏性的，在高温下易变性或分解；有些 物料具有较大的腐蚀性或较高的粘度等等。因此，在选择蒸发的方法和设备时，必须考虑物料的这些工艺特性。（3）能量利用与回收 蒸发时需消耗大量的加热蒸汽，而溶液汽化又产生大量的二次蒸汽，如何充分利用二次蒸汽的潜热，提高加热蒸汽的经济程度，也是蒸发器设计中的重要问题。提高加热蒸汽效率：(1) 额外蒸汽的引出：在多效蒸发中，可在前几效引出部分二次蒸气，作为其它加热设备的热源。引出额外蒸气时，生蒸气的消耗量增加，但所增加的生蒸气量小于引出的额外蒸气总量，从总体来看，生蒸气的经济性提高了。(2) 冷凝水的闪蒸：上一效的冷凝水温度较高，可将其通过闪蒸器减压至下一效加热室的压力，则冷凝水由于过热将闪蒸，产生部分蒸气。将它和上一效的二次蒸气一起作为下一效的加热蒸气，就相当于提高了生蒸气的经济性。 (3)热泵蒸发：单效蒸发时，可将二次蒸气绝热压缩以提高其温度，然后送回加热室作为加热蒸气重新利用。热泵蒸发的节能效果一般可相当于35效的多效蒸发。该方法不适用于沸点升高较大物料的蒸发。另外，压缩机的投资费用较高等，限制了它的应用。蒸发设备：（1）循环型蒸发器：a.中央循环管式蒸发器，b.悬筐式蒸发器c.外热式蒸发器，d.列文式蒸发器e.强制循环蒸发器。（2）非循环型（单程型）蒸发器：a.升膜式蒸发器，b.降膜式蒸发器，c.刮板式蒸发器。 结晶过程中的相平衡与溶解度：将一种溶质放入溶剂中,由于分子的热运动,必然发生两个过程: 固体的溶解,即溶质分子扩散进入液体内部;物质的沉积,即溶质分子从液体中扩散到固体表面进行沉积。 一定时间后,这两种分子扩散过程达到动态平衡。在给定温度条件下,与一种特定溶质达到平衡的溶液称为该物质的饱和溶液。溶质与其溶液间的这种相平衡关系,通常可用溶质在溶剂中的溶解度来表示。物质的溶解度与其化学性质、溶剂的性质及温度有关。一定物质在一定溶剂中的溶解度主要随温度变化,而随压力的变化很小,常可忽略不计。 溶解度数据可用溶解度对温度所标绘的曲线来表示,可通过实验确定,右图为某些无机盐在水中的溶解度曲线。溶解度曲线对结晶操作具有很重要的指导意义。对于溶解度曲线（饱和曲线）随温度变化敏感的物质，可选用变温方法结晶分离；对于溶解度随温度变化缓慢的物质，可用移除一部分溶剂的方法结晶分离。溶液结晶的类型：溶液结晶按过饱和形成的方式不同可将溶液结晶分为两大类。 冷却结晶法：不移除溶剂的结晶法亦称为不移除溶剂的结晶法,基本上不除去溶剂,而是使溶液冷却而成为过饱和溶液而结晶。适用于溶解度随温度下降而显著减小的物系,如硝酸钾、硝酸钠、硫酸镁等溶液。 移除部分溶剂的结晶法：移除部分溶剂的结晶法又可分为蒸发结晶法和真空结晶法,蒸发结晶是将溶剂部分汽化,使溶液达到过饱和而结晶。此法适用于溶解度随温度变化不大的物系或温度升高溶解度降低的物系,如氯化纳、无水硫酸钠等溶液。 真空冷却结晶是使溶液在真空状态下绝热蒸发,一部分溶剂被除去,溶液则因为溶剂汽化带走了一部分潜热而降低了温度。此法实质上兼有蒸发结晶和冷却结晶共有的特点,适用于具有中等溶解度的物系如氯化钾、硫酸镁等溶液。晶核的形成 晶核是过饱和溶液中初始生成的微小晶粒,是晶体成长过程必不可少的核心。晶核形成的过程可能是这样进行的:在溶液中,质点元素不断地作不规则的运动,随着温度的降低或溶剂量的减少,不同质点元素间的引力相对地越来越大,以至达到不能再分离的程度,它们将首先结合成线晶,线晶结合成面晶,面晶结合成按一定规则排列的细小晶体(见图),这就形成所谓的晶胚。晶胚极不稳定,有可能继续长大,也可能重新分解为晶线或质点元素。若晶胚进一步长大则可成为稳定的晶核。晶核形成过程的原因可分为初级成核和二次成核两种情况(1) 初级成核:过饱和溶液中的自发成核现象：a 均相成核：没有外来微粒的均相溶液中；b 非均相成核：有外来微粒的溶液中(2) 二次成核：向介稳态过饱和溶液中加入晶种，会有新晶核产生。机理: 附着在晶体表面的微小晶体受到剪切作用，或碰撞而脱离晶体，形成新的晶核。在没有晶体存在的过饱和溶液中自发产生晶核的过程称为初级成核。初级成核又根据饱和溶液中有、无自生或外来的微粒划分为均相和非均相两类。 在介稳区内,洁净的过饱和溶液还不能自发地产生晶核,只有进入不稳区后,晶核才能自发地产生,这种在均相过饱和溶液中自发产生晶核的过程称为均相初级成核;如果溶液中混入外来固体杂质,如空气中的灰尘或其他人为引入的固体粒子,它们对初级成核有诱导作用,这种在非均相过饱和溶液中自发产生晶核的过程称为非均相初级成核。二次成核是指在过饱和溶液中因存在晶体而进行成核过程。 二次成核的机理已有许多学者作了不同的解释,目前人们普遍认可的二次成核机理是碰撞成核和流体剪切成核。 碰撞成核是指由于采用各种方法搅拌溶液,使晶体之间或晶体与其他固体物之间碰撞而破碎形成新的晶核;流体剪切成核是指当过饱和溶液以较大的速度流过晶体时,在流体边界层上的剪切力会将一些附着在晶体表面的小 粒子断开,从而形成新的晶核。晶体生长过程的影响因素可归纳为以下几点。(1) 过饱和度的影响 过饱和度是结晶过程的推动力,是产生结晶产品的先决条件,也是影响结晶操作的最主要因素。过饱和度增高一般使晶体生长速率增大,但同时会引起溶液粘度增加,结晶速率受阻。因此,存在一个最优化的过饱和度的选择问题。 (2) 冷却(蒸发)速度的影响 实现溶液过饱和的方法一般有三种：冷却、蒸发和化学反应。前两种方法在实际生产中最常使用。快速的冷却或蒸发将使溶液很快地达到过饱和状态