芋螺睡眠肽结构和功能研究进展.doc

芋螺睡眠肽结构和功能研究进展第36卷第2期2007血浙江大学学报(医学版)JOURNALOFZHEJIANGUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES)Vol36No22007httptffWWW./med芋螺睡眠肽结构和功能研究进展冯微宏,詹金彪,朱永平综述(1.浙江大学医学院生物化学教研室,浙江杭州310058;2.浙江大学医学院毒理学教研室,浙江杭州310058)摘要芋螺睡眠肽是一类与众不同的芋螺毒素,一级结构有高度同源性,它含有丰富的7一羧基谷氨酸,和其他类芋螺毒素不同的是一般不合二硫键(除了芋螺睡眠肽一R),在结合金属离子后,构像中a一螺旋结构的成分会有不同程度地增加.芋螺睡眠肽是一类非竞争性的N一甲基一D一天门冬氨酸(NmethylDaspartate,NMDA)受体的选择性抑制剂,并且具有受体亚型特异性,颅内注射芋螺睡眠肽后,实验鼠会呈现一种睡眠样症状.序列及结构分析显示,正是芋螺睡眠肽序列中高度保守的氨基酸残基决定了它们的结构及功能,文中对其结构和功能的关系作了综合分析.关键词软体动物毒液类;芋螺毒素类;芋螺睡眠肽;7-羧基谷氨酸;NMDA受体;a一螺旋结构中图分类号R996.3文献标识码A文章编号10089292(2007)02020405AdvancesinstudyofstructuresandfunctionsofconantokinsFENGWeihong,ZHANJinbiao,ZHUYongping(1.DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,CollegeofMedicine,ZhiangUniversity,Hangzhou310058,China;2.DepartmentofToxicology,CollegeofMedicine,ZhiangUniversity,Hangzhou310058,China)AbstractConantokiniSadistinctfamilyofconotoxinsuperfamily.Itsmembersshareconsiderableoverallsequencehomology.Theirdefiningattributesincludeahighrelativecontentofgammacarboxyglutamicacid(Gla).Theyaregenerallydevoidofdisufideloopcontrastedwithotherconotoxins(exceptforconantokinR).Uponbindingtometalions,thecontentof0【一helixconformationincreasesindifferentdegrees.TheyinhibitNMDA(NmethylD-aspartate)receptors;moreover,differentconantokinspeciespresentdifferentNMDAreceptorsubunitspecificity.Itcaninducesleeplikesymptomsinyoungmicewhendeliveredintracranially.Analysisofsequencesandstructuresindicatesthatthehighconservedresiduesofthesepeptidesaredeterminativeintheirstructuresandfunctions.Inthisarticle,therelationshipsoftheirstr1】ct1】resandf11nctionsarereviewedindetai】.-KeywordsMolluskvenoms;Conoloxins;Conantokin;7-carboxyglutamicacid;NMDAreceptor:dhelixconformation收稿日期基金项目作者简介通讯作者JZhejiangUniv(MedicalSci),2007,36(2):204208.:20050922修回日期:20061211:国家重点基础研究专项经费(973项目,2O03CB5154O0).:冯微宏(1975一),男,硕士,从事分子生物学研究.:詹金彪(1963一),男,教授,从事生物化学和分子生物学研究;Email:第2期冯微宏,等.芋螺睡眠肽结构和功能研究进展芋螺睡眠肽(conantokin,Con)是一类较特殊的芋螺毒素(conotoxin,CTX),是芋螺毒素超家族中一个成员家族.该家族迄今已经发现四个主要成员:芋螺睡眠肽一G(conG),芋螺睡眠肽一T(conT),芋螺睡眠肽一R(conR),芋螺睡眠肽一L(conL).这四个毒素肽序列上显示了高度同源性,除了conR有一个二硫键外,其他三个肽均不含二硫键,而芋螺毒素超家族中其他成员一般均含有二硫键_】.这四个肽序列中都含有一羧基谷氨酸,能够结合二价金属离子.与金属离子结合时,他们的空间构象均呈现高比例的一螺旋结构.这四种毒素都是选择性的NMDA受体非竞争性抑制剂,在实验幼鼠身上可引起睡眠样症状.研究发现人的NMDA受体参与一系列神经系统的病理过程,如阿尔茨海默症,癫痫,中风等,动物试验中发现芋螺睡眠肽对治疗上述病症有较好的疗效.conL发现不久,相关资料不多,这里主要讨论前三类芋螺睡眠肽.1一级结构从图1中可以看出conG序列最短,有17个氨基酸残基,conR最长,有27个氨基酸残基,conT介于两者之间,有21个氨基酸残基组成.conT和conG的C末端残基均被酰胺化,而conR的C末端含有一个包含5个氨基酸残基的双硫环.这三个肽分子内均含有一羧基谷氨酸,它是和金属离子结合的位点.这三个肽最保守的氨基酸残基包括N末端的GlyGla序列,Gla和Gla”(因为conR在第1O位有一个Ala的插入,所以其相应的位置是Gla”和Gla_2),以及最后个Gla前的Arg残基.和conc.n匦夏QvNQ团c.n匝jQKMI固c.n圈VAKMAALsNNEVKKNA一G比,conR和conT在一级序列上有更多的相似性,除掉conRC端七个含双硫键的残基序列,二者有5O残基相同,除了上述的保守残基外,Lys,Met,Leu,Lys是两者共有的氨基酸.这三种肽都是亲水肽,分子呈酸性,其中conG酸性最强.2空间构象在未结合金属离子时,conG呈现一种无规则的结构,conT却呈一螺旋结构,其一螺旋结构比例大于4O(25C)l3,与conT相似,COnR在未结合金属离子,也表现为a一螺旋结构(19),当结合Ca,Mg抖等金属离子后,conG的空间构象发生巨大变化,变成从N端到C端的一螺旋结构,其比例可高达85(25C)l3,而同样情况下,conR及conT空间构象中a一螺旋结构比例仅轻微增加.研究发现,conT之所以在无金属离子结合时能形成一螺旋结构,得益于它肽分子内具有大量的侧链一侧链相互作用,主要包括疏水相互作用,静电斥力,电荷偶极距作用,末端残基封锁效应及氢键连接.在conT的一螺旋结构中心区,包括Gla.一Lys7-Gla-Arg1a-G1a14Lys,每个带电残基至少和另一个带相反电荷的残基侧链发生相互作用(位置配对模式是ii+3或i-i+4)从而构成一个静电作用网,因而稳定了一螺旋结构_3.而conG缺乏类似分布的疏水残基,仅有少数潜在的盐键和离子对,另外,conG的四个带负电残基Glaa-Gla7-GlaO_Gla”都位于分子的同一面,相互之间的静电斥力使之几乎无法形成一螺旋结构4.考虑到一级序列的相似性,和conT一样,conR1到19位残基同样存在类似的侧链一侧链相互作用,所以119位残基形成a一螺旋结构,但由于conR后面七个残基中二硫键以及Gly.这个非极性残基的存在,减弱囝IAKGC.KVNC.YP了整个分子形成一螺旋结构的倾向.就conllG而言,金属离子(Ca,Mg等)与Gla的螯双硫键合,正好起到电力中和作用,使原来排斥的负注:带框部分:三个肽共有的保守残基序列.y:7一羧基谷电残基GIa空间上相互靠近,从而能转变成稳氨酸.带字符:酰胺化的残基.定的0【一螺旋结构.而金属离子和con-T及con图1芋螺睡眠肽成熟肽一级序列一R结合后,只是改变了一些侧链的方向性,从Fig?1Sequenceofmatureconanokinpepide而形成更加明显的0【一螺旋结构.浙江大学学报(医学版)第36卷37一羧基谷氨酸及其与金属离子的结合在芋螺睡眠肽发现之前,7一羧基谷氨酸只存在于一些哺乳动物的骨组织蛋白和凝血因子中,Gla的羧化依靠依赖VitminK的谷氨酸羧化酶,7一羧基谷氨酸和ca的螯合为这些蛋白形成有功能的构像所必须.芋螺睡眠肽中的Gla的羧化同样地依靠芋螺分泌的毒液中依赖VitaminK的谷氨酸羧化酶的作用.Gla的羧化作用在高浓度的硫化铵存在时能大大增强,这和哺乳动物中的情况一样5.研究发现,凝血因子序列中包含有和羧化酶相互作用的序列,被称为了一羧化识别序列(7一CRS).有人认为类似的识别序列存在于conG的前体肽序列内,即信号肽和成熟肽之间的序列.另外,Gla相对于这个识别位点的方向性也可能决定了它是否被羧化,这就是为什么芋螺睡眠肽中仍存在未被羧化的Glu6.通过遗传算法模拟,等温滴定量热法(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)发现芋螺睡眠肽分子中可能存在多个金属离子结合位点,不同金属离子其与位点的亲和力也是不同的,虽然不同金属离子引起的分子结构变化是类似的.现举Ca,Mg,Zn抖为例,最主要的位点有Gla和Gla组成,金属离子(Ca抖,Mg抖,Zn)和Gla的羧基上的氧原子螯合,这个位点对金属离子的亲和力较强.第二个亲和力较弱的位点由Gla.,Gla,Gla的羧基氧所构成(conG),或Gla.的二个羧基和Gln的羰基构成(conT).第三位点只发现于conG,由Gla的二个羧基维持4.试验证明,当Gla,Gla被取代为Ala时,分子结合金属离子的能力大大降低,而Gla.,Gla,Gla作同样替代时,结合力仅轻微降低.Ca,Mg,Zn对分子的亲合力也不尽相同,其中Zn最强,ca最弱.举conG为例,Mg和第一位点及第二位点的结合力比ca分别大175和9倍,第三位点只在Zn结合能观察到7.Zn亲合力最高的解释是它有着全满的电子轨域以及较高的电荷密度.另外有趣的是,当Zn浓度逐渐升高时,分子的a一螺旋结构有松弛的现象,分子间有形成二聚物的趋向7,这可能是由于Gla的残基封锁效应,在Zn浓度增高时,Gla侧链由原先与主链的相互作用,转而与Gla.相互作用以维持第二位点(较弱位点)和Zn的结合,从而使N端的a一螺旋结构失去稳定性,引起螺旋的解聚.有研究证明,不只是二价金属离子.,有些三价的镧系元素也能和芋螺睡眠肽作用,引起结构转变为a一螺旋,只是a一螺旋结构的比例较低,可能是由于它们的离子半径较大8.4NMDA受体结合的亚基选择性NMDA受体包含三个亚基家族,一个亚基家族由单基因(NR1)表达,产生八个不同的变构体(NR1ah),另一个亚基家族由多基因(NR2AD)表达,分别形成四种蛋白(NR2AD),还有一个亚基家族由NR3基因表达,至少包括二个变构体(NR3一l,NR3一S),在哺乳动物中,NR1和NR31的表达是普遍存在的,而NR2和NR3一S的表达以发育时段和所在部位不同而异.NMDA受体一般存在至少三个不同的亚基一NR1,NR2A,NR2B,虽然NRl亚基构成的同聚肽已具有NMDA受体的所有功能.NMDA受体至少有一个活性位点,二个受体兴奋剂结合位点(一个结合Glu,一个结合Gly),一个多胺调控位点(结合精胺或亚精胺),还有三个离子结合位点,分别结合Zn抖,Mg抖和H,结合后能抑制受体兴奋引起的离子内流(主要是Ca),只有二个受体兴奋位点同时结合不同的兴奋剂时,受体才能表现出兴奋.芋螺睡眠肽主要结合在NMDR受体的Glu位点,在有精胺或亚精胺结合于多胺调控位点,芋螺睡眠肽和受体的亲合力增强.三种芋螺睡眠肽对受体的亲和力是不同的,其中conR最强,conG最弱.芋螺睡眠肽和受体结合后能抑制离子内流引起的细胞损伤.三种芋螺睡眠肽表现出不同的受体亚型选择性,conG主要作用于NR1a/NR2B构成的受体聚合体,对NRla/NR2A组成的受体没有效应1.,而conT和conR相似,主要作用于含NRla/NR2A及NRla/NR2B的受体聚合体.研究证明,芋螺睡眠肽的第五位残基对它的亚型选择性起了关键作用1,氨基酸替代试验证明,在第五位的残基被取代后,这三种各自特异性的受体亚型亲和力都有不同程度的降低,如conG(L5Y,5位第2期冯微宏,等.芋螺睡眠肽结构和功能研究进展Leu由Tyr替代)对NR1a/NR2B,conT(Y5V)conR(V5L)对NR1a/NR2A,NR1a/NR2B,除了第五位残基外,它下游附近的残基可能也对亚型选择起一定影响.5构效关系分析用肽C端逐个截去氨基酸的方法发现最短有生物活性序列长度是:conR(18),conG(113),conT(18),表明对生物学活性最有影响的残基位于这些序列内.N端的四个保守残基即Gly,Glu,Gla.,Gla被认为对芋螺睡眠肽的生物活性起非常重要的作用,当用Ala取代后,其在.HMK801结合抑制试验中表现的活性下降最高可达1000倍.第五位残基虽然三者不同,但对芋螺睡眠肽的抑制活性和亚型选择性非常重要,已如前述.conT和conR的第七位同样是Lys,在这二种肽里都起了稳定a一螺旋构象的作用,替换后,会出现apoa一螺旋(未结合Ca时的a一螺旋)的比例降低,但对其功能却无多大影响.Met在conR和conT中相同,它对二者的功能有重要影响LlL.研究证明,GIn.对conG的抑制活性是必不可少的,而在conR和conT中相同位置的残基却并非必须.这三种肽的第12位残基被认为也参与了和NMDA受体的相互作用.Arg(相应的conR是Arg)对二级结构稳定性的维持起一定作用,但对生物学活性没有影响.另外Gla,Gla,Gla(conG)是金属离子的结合位点,突变后,对其结合金属离子的能力有影响,但对抑制活性没有影响,除上述位置之外的残基也并?非是功能所必需,可以用Ala替代.conR的C末端还有一个5个氨基酸组成的双硫环,和其他芋螺毒素中双硫环一样,可能是维持分子的稳定性和刚性,增加分子在体内的半衰期,溶解度口,研究发现,conL和conR序列有高度同源性(除C末端外),但它的抗惊厥/癫痫作用明显不如后者,提示conR的C末端序列可能对其发挥抗惊厥/癫痫作用有很大贡献_l.从上面的实验结果看出,a一螺旋结构的稳定性及是否结合金属离子和分子发挥功能并没有必然的联系,那些对稳定螺旋结构重要和结合金属离子的氨基酸残基(Arg,Gla!.,Gla等)却并非直接发挥抑制功能所必需.芋螺睡眠肽的a一螺旋结构和金属离子的结合属性的生理学意义有待进一步研究.这三个肽一级序列中,高度保守的氨基酸残基对维持它们的结构和功能起了最关键的作用.6应用进展及展望研究已知,兴奋性氨基酸(excitatoryanimoacid,EAA)是中枢神经系统的主要兴奋性神经递质,它们对缺血脑细胞具有兴奋毒性作用,是缺血脑损害的重要环节.EAA受体可分为五种,但以NMDA受体为主.NMDA受体在介导活性氨基酸释放方面起着重要作用,而且可增llCa内流,而这种Ca内流是缺血脑损害的关键环节,NMDA受体抑制剂芋螺睡眠肽可能正是由于能阻断这种Ca内流及活性氨基酸的释放,而具有较强的神经保护作用的LJ引,此外,在实施中脑动脉阻塞的小鼠梗塞模型中,使用conG有效的缩小梗塞范围,能有效地抑制缺血性脑损伤引起的受损脑细胞中ffos,bax,bcl一2基因的大量表达Ll.有文献报道,芋螺睡眠肽还有良好的抗疼痛作用,和O,Jconotoxins类似,用福尔马林诱导的组织损伤模型对比conG和SNX一111(ct,一conotoxinMA)的抗疼痛效果发现,conG达到完全有效的剂量要远远低于它产生锥体系副作用的剂量,而SNX一111在实验中部分有效时,已产生比较明显的运动功能的损害,并且conG对于神经受损引起的痛觉超敏有很强的抑制作用u.在小鼠实验中,conR对于声音诱发的癫痫有很好的保护作用,它在不产生毒副作用的剂量下就能有效抑制癫痫引起的阵挛,相比另一种NMDA受体抑制剂MK一801,在有效时已达到或超过损害运动功能的剂量Ll.另外,芋螺睡眠肽可以用于药物依赖性的治疗_1,我们实验室的工作初步证明conG可以防止吗啡诱导的精神依赖.展望未来的应用研究可能将集中在芋螺睡眠肽在这些疾病中发挥作用的机制上,相信在不久的将来,有望开发出治疗这些疾病的高效,安全的药物L2.我国的芋螺资源丰富,但芋螺毒素的研究还处于初期.我们应积极抢占这个独特的生物资源,加紧研究和开发,赶上国外研发水平.?208?浙江大学学报(医学版)第36卷References:1OLIVERABM,CRUZLJ.Conantoxins,inretrospectEJ.Toxicon,2001,39:7-14.E2BLANDLT,WARDERSE,PROROKM,eta1.StructurefunctionRelationshipsofNMDAReceptorantagonistpeptide,conantokinRJ.FEBSLett,2000,470(2):139146.3wARDERSE,CHENZ,ZHUY,eta1.TheNMRsolutionstructureofNMDAreceptorantagonist,conantokinT,intheabsenceofdivalentmetalionsJ.FEBSlett,1997,411:19-26.r4CHENZ,BLANDLT,PROROKM,eta1.ConformationalchangesinconantokinGinduceduponbindingofcalciumandmagnesiumasrevealedbyNMRstructuralanalysisJ.JBiolChem,1998,273(26):1624816258.r5STANLEYTB,OLIVERABM,BANDYOPADHYAYPK.IdentificationofavitaminKdependentcarboxylaseinthevenomductofaConussnailJ.FEBSLett,1997,407(1):8588.r6BANDYOPADHYAYPK,COLLEDGECJ,WALKERCS,eta1.ConantokinGprecursoranditsroleingammacarboxylationbyavitaminKdependentcarboxylasefromaConussnailJ.JBiolChem,1998,273(10):54475450.r7ROROKM,CASTELLINOFJ.Thermodynamicsofbindingofcalcium,magnesium,andzinctotheN-methyl-Daspartatereceptorionchannelpeptidicinhibitors,conantonkinGandconantokinTJ.JBiolChem,1998,273(31):1957319578.8BLANDLT,ZAJICEKJ,PROROKM,eta1.Metal-ion-bindingpropertiesofsyntheticconantokinGJ.BiochemJ,1997,328(Pt3):777783.r9KLEINRC,PROROKM,CASTELLINOFJ.DirectbindingpropertiesofconantokinstonativeNmethyld-aspartatereceptorsJ.JPeptRes,2003,61(6):307317.r1ODONEVANSD,McCABERT.ConantokinGisanNR2BselectivecompetitiveantagonistofNmethylDaspartatereceptorsJ.MolPharmacol,2000,58(3):614623.r11KLEINRC,PROROKM,GALDZICKIZ,eta1.Theaminoacidresidueatsequenceposition5intheconantokinpeptidespartiallygovernssubunit.selectiveantagonismofrecombinantN.methylDaspartatereceptorsJ.JBiolChem,2001,276(29):2686026867.12BLANDLT,ZZJICEKJ,PROROKM,eta1.131415161718192O21SequencerequirementsfortheN-methyl-D-aspartatereceptorantagonistactivityofconantokinRJ.JBiolChem,2001,276(10):73917396.WARDERSE,BLANDLT,KLEINRC,eta1.AminoaciddeterminantsforNMDAreceptorinhibitionbyconantokinTJ.JNeurochem,2001,77(3):812-822.JIMENEZEC,D0NEVANS,WALKERC,eta1.ConantokinL.anewNMDAreceptorantagonist:determinantsforanticonvulsantpotencyJ.EpilepsyRes,2002,51(12):73-80.WILLIAMSAJ,LINGG,McCABERT,eta1.1ntrathecalCGX一1007iSneuroDrotectiveinaratmodeloffocalcerebralischemiaJ.Neuroreport,2002,13(6):821824.WILLIAMSAJ,LINGG,BERTIR,eta1.Treatmentwiththes