色谱柱分类与选择-内部培训资料PPT演示课件.ppt

一 色谱起源 1906年俄国植物学家Tsweet发现色谱分离现象 1 2 高效液相色谱仪的分析原理 高效液相色谱仪的结构色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理 高压泵 进样器 检测器 色谱工作站 色谱柱 1Basicprincipleofchromatographicseparation1 1色谱分离基本原理 PartitioncoefficientK分配系数 3 硅胶颗粒基质合成步骤 1 合成硅胶基质2 键合配体 键合相 3 端基封尾end capped 4 以传统方式制造硅胶色谱填料的过程 起始原料为矿物硅酸盐 如泡花碱 即A类硅胶 90年代以后方式 organosilicapolymer有机单晶硅聚合的硅胶 即B类硅胶 5 6 填料的端基封尾 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量 0 1 1 C18键合并端基封尾后还能看见什么 硅羟基 即使进行高密度键合 硅胶表面仍将残留约50 硅羟基 SiOH 7 单 双 三官能团键合 三官能团键合 二官能团键合 单官能团键合 8 键合 9 常用封尾end capped 三甲基硅氧烷 极性封尾 增加极性保留 HypersilODS即没有封尾HypersilODS 2有封尾 由于空间位阻的存在 键合反应最多只能覆盖50 的硅羟基 超过一半硅羟基是活性硅羟基 与碱性基团会发生离子交换作用 增加了保留 导致峰形拖尾 用短链氯硅烷 如三甲基氯硅烷 键合活性的硅羟基 可以减小这种影响 这种操作被称为封尾 封端 封口 封尾 10 封尾 11 空间位阻 异丙基硅氧烷 异丁基硅氧烷 12 空间位阻 13 极性嵌入polarembedded 14 问题 下列色谱柱如何选择 amidohexadecylsilylsilicagelColumn size l 0 25m 4 6mm stationaryphase diisopropylcyanopropylsilylsilicagelforchromatographyR 5 m withaspecificsurfaceareaof180m2 gandaporesizeof8nm stationaryphase sphericaloctadecylsilylsilicagelforchromatographyR 5 m withaspecificsurfaceareaof170m2 gandaporesizeof12nm stationaryphase aminopropylsilylsilicagelforchromatographyR 5 m stationaryphase end cappedoctadecylsilylsilicagelforchromatographyR 5 m stationaryphase base deactivatedoctadecylsilylsilicagelforchromatographyR 3 m stationaryphase octylsilylbase deactivatedsilicagelforchromatographyR 4 m withaporesizeof6nm stationaryphase end cappedpolar embeddedoctadecylsilylamorphousorganosilicapolymerR 5 m MobilephaseMix35volumesofacetonitrileRand65volumesofa5 23g lsolutionofdipotassiumhydrogenphosphateRpreviouslyadjustedtopH7 0withphosphoricacidR 答案见备注信息 15 以传统方式制造硅胶 A类硅胶 色谱填料的过程 起始原料为矿物硅酸盐 如泡花碱 Na2SiO3 矿物 2H Si OH 4 silicicacid 2Na 硅胶颗粒 含金属杂质 C18 C8bonding endcapping C18 C8ReversedPhases 最终仍带金属杂质 16 与键合相的疏水性作用 双重保留机理 1 与键合相的的疏水性作用 2 与残余硅醇基间的离子交换作用 O Si O Si O O Si O Si O O Si O O Si O Si O Si O O Si O Si O Si O Si OH O Si O Si OH O Si OH O Si O Si O Si OH O Si O Si 当流动相pH值小于3时 硅醇基呈中性 未解离 Base Base 对碱性化合物的保留及严重拖尾 两实验使用相同的传统C8硅胶柱 离子交换作用 碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理 当流动相为pH6 8时 硅醇基带负电性 大部解离 17 既然pH 3时硅醇基离解受抑制 为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离 低pH可导致分离选择性的完全丧失 18 硅胶晶格中杂质铝对硅醇基酸度的影响 质子酸 H 金属嵌入硅胶晶格中 使硅醇基的酸性大大增强 19 硅胶中金属杂质含量对螯合性化合物Hinokitiol峰形的影响 Minutes 2 4 6 8 流动相 20mMPhosphateBufferpH3 6 含0 05 EDTA Acetonitrile 50 50 低金属杂质 高金属杂质含量 20 金属杂质的存在可使得硅醇基过度活化 以至某些碱性化合物在酸性条件下仍呈现拖尾峰 分析物 Chlorpheniramine 杂质铝含量 ppm 1 2 3 4 0 100 200 300 400 拖尾因子 高纯硅胶 区 流动相 乙腈 KH2PO4pH3 0 20 80 21 传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响 Minutes 5 15 25 35 45 Amitriptyline Acenaphthene PropranololandButylparaben Naphthalene 铝杂质含量 375ppmTfUSP 6 5 流动相pH7 22 如何解决碱性化合物和螯合物的峰形问题 从修饰流动相着手改善峰形 例如使用竞争性碱TEA或离子对色谱 1970 1980年代策略从改善反相填料着手降低硅醇基活性自1990年代起至今 23 现代色谱柱三大技术平台 亲水AQ柱ECOSILODS AQAtlantisDc18 T3SynergiHydro RPHILIC柱Zic HILICHypersilGOLDHILICAtlantisHILIC柱目的 提高极性化合物保留 宽pH色谱柱ECOSILODS ExtendXbridge XterraC18 C8GeminiC18ZorbaxODS Extend目的 提高色谱柱pH使用范围 纯硅胶柱ECOSILODS SHPurospherSTARRP18eSymmetryC18极性嵌入柱ECOSILODS EPSZorbax BonusRP18SymmetryshieldRP18目的 改善峰形 24 Tetraethoxysilane TEOS Polyethoxysilane PEOS B类超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成过程 无金属杂质的超纯起始原料 25 常见品牌C18柱在pH7下的性能比较 品牌 Acenaph k Amitrip Acenap a Amitriptyline 拖尾因子 美国药典法 EcosilC18 SH 16 1 3 1 4 InertsilODS 2 16 1 4 2 5 PuresilC18 14 1 5 3 3 ZorbaxRxC18 16 1 8 6 0 PurospherRP 18 16 4 8 6 0 KromasilC18AlltimaC18 1923 1 53 5 9 413 Nova PakC18 16 2 3 5 5 NucleosilC18 15 4 3 10 HypersilODS 11 2 8 10 ZorbaxODS 21 无法测得结果 26 2 6 常见品牌C18柱在pH3下的性能比较 27 对碱性化合物的峰对称性 pH7 pH3 Symmetry Symmetry 极佳 Inertsil Purospher LiChrospherRP selectB Alltima YMCbasic Inertsil Puresil kromasil Purospher YMCbasic ZorbaxRx ZorbaxRx Nova Pak LiChrospherRP selectB kromasil Puresil Alltima Nova Pak Nucleosil Nucleosil Hypersil Zorbax Zorbax Hypersil 差 常见品牌柱在pH3和pH7下的峰形优劣排序 EcosilODS SH EcosilODS SH 28 具有极性嵌入基团的反相填料结构示意 29 内嵌极性基团固定相 水表面层可能机理 水 屏蔽 层 改善与水的浸润性 100 水溶液兼容降低了碱性化合物的保留降低了拖尾现象 屏蔽了带负电的硅羟基 极性基团增加了表面层水的浓度 30 C18键合相硅胶柱填料需要合适的湿润度 注意 需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度 反之停流速后易出现 疏水塌陷 问题 31 未湿润的孔 湿润的孔 注意 保留时间与填料表面积与配体有关 然而 如果硅胶表面未湿润 那么有效的色谱表面积会减少95 因此 减少被分析物的保留时间即等于 疏水塌陷 记住 几乎所有的表面积都在孔内 低比例有机溶剂或纯水溶液流动相 C18硅胶 什么是 疏水塌陷 32 分 流动相 0 1 醋酸水溶液 阿莫西林 Vo 被分析物没有保留 湿润时 去湿后 疏水塌陷 33 停流速后 孔去湿 3 流动相 0 1 醋酸水溶液 极性嵌入色谱柱 无疏水塌陷现象发生 内嵌极性基团键合相 使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定 34 EcosilC18 EPSTfUSP 1 1 阿米替林 EcosilC18 SHTfUSP 1 4 注意 对碱性化合物而言 可以减少保留时间并且改善色谱峰形 相同硅胶基质 配体不同 内嵌极性基团的配体与直链烷烃配体的比较 35 注 使用相同的流动相 EcosilC8 EPS EcosilC8 SH 选择性不同 呋喃唑酮 痢特灵 杂质分析 36 极性基团嵌入技术 屏蔽技术 的历史沿革 1990 Supelcosil pKb 100 嵌入酰胺键 专利 两步合成法 1992 Prism RP 嵌入脲结构 和Supelcosil LC ABZ 两步合成法 1993 Supelcosil ABZ Plus 两步合成法 1995 1996 WatersSymmetryShield RP18 RP8 氨基甲酸酯结构 专利 一步合成法 1999 WatersXterra RP18 RP8 氨基甲酸酯结构 专利 一步合成法 1998 1999 Supelco放弃了基于酰胺键嵌入技术的两步合成法专利 Discovery RPAmideC16 一步合成法 许多其他公司开始仿制 2000 ECOSILC18 EPS C8 EPS 酰胺基十六烷基结构 一步合成法 37 多种品牌色谱柱对碱性化合物的峰形比较 USPTailingFactor amitriptyline pH7 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 4 1 4 1 4 1 5 1 6 1 8 1 8 1 8 1 9 2 1 2 4 2 6 3 4 4 3 5 5 6 6 4 9 10 1 3 5 7 9 EcosilC8 EPS EcosilC18 EPS SymmetryShield RP8 SymmetryShield RP18 YMC Pack PolymericC18 Luna C18 2 Supelcosil ABZ Plus Discovery RPAmideC16 ECOSILC18SH Luna C18 Zorbax BonusRP YMC Pack CN Nova Pak CNHP YMC Pack ProC8 Symmetry C18 Symmetry C8 YMC Pack ProC18 Nova Pak Phenyl Zorbax ExtendC18 YMC Pack Phenyl YMC Pack ODS A WatersSpherisorb ODSB Nova Pak C18 WatersSpherisorb ODS2 Bondapak C18 38 Atlantis dC18Column 揭开人类酿酒历史之谜 2004 古埃及十二世王Tutankhamen 约公元前1346 1327 1922年发掘Tut王墓葬时所发现的具象形文字的残片 疑为盛酒器皿上的标签说明 TartaricAcid 酒石酸 SyringicAcid 丁香酸 是红葡萄中的两个内源性标记物 39 AQ柱的极性保留秘诀 表面峰端 键合密度 键合相连接方式 微孔大小 防微孔脱水 峰形 保留性能 柱寿命 1 极性封尾2 极性嵌入3 低碳载量4 保留硅羟基5 增加极性嵌入键合相 AQ色谱柱的特点 对极性与非极性化合物的优异保留特性在100 水溶液流动相中运行保持色谱性能稳定峰形优异超低键合相流失 质谱兼容酸性条件下稳定性良好在高水相 低pH条件下具有较长的色谱柱寿命极佳的色谱柱间重现性 41 Atlantis dC18柱对极性化合物的优异保留性能 对嘌呤碱表现良好峰形 因对填料进行了彻底封端 Compounds 1 Cytosine2 5 Fluorocytosine3 Uracil4 5 Fluorouracil5 Guanine6 Thymine7 Adenine ConditionsColumn AtlantisTMdC184 6x150mm 5 mMobilePhaseA H20MobilePhaseB ACNMobilePhaseC 100mMCH3COONH4 pH5 0FlowRate 1 0mL minGradient TimeProfile min A B C0 09001010 084610InjectionVolume 10 LTemperature 30oCDetection UV 254nmInstrument AllianceTM2695 2996PDA 尿嘧啶 Uracil 是测试反相柱最广泛采用的死体积标记物 但在Atlantis dC18柱上具显著保留 42 AtlantisdC18 丙毒 丙烯酰胺 分析 色谱柱 AtlantisdC18色谱柱5 m 2 1 150mm流动相 0 1 甲酸 甲醇 98 2流速 0 2mL min进样体积 20ml 数据来源 北京CDC 43 条件色谱柱 AtlantisTMdC184 6x150mm 5 m流动相A 0 1 TFA水溶液流动相B 0 1 TFA乙腈溶液流速 1 4mL min梯度 时间梯度组成 min A B0 010005 09736 0851510 0802012 0010025 00100进样体积 10 0 L温度 30oC检测 UV 268nm仪器 AllianceTM2695 2996PDA 极性与非极性化合物保留的完美平衡 化合物 浓度 g mL 1 L 抗坏血酸 VC 19 62 烟酸 niacin 9 83 硫胺 VB1 19 64 吡哆醛39 25 吡哆醇 VB6 39 26 叶酸 VB11 23 57 咖啡因9 88 核黄素 VB2 3 99 视黄醇 VA 19 610 生育酚 VE 39 211 麦角钙化甾醇 VD2 9 8 Grumbach Diehl 对于水溶性维生素的极佳保留 对于脂溶性维生素不过度保留 注 无需离子对试剂 44 问题 AQ柱有哪些不足之处 45 HILIC HydrophilicInteractionLiquidChromatography HILIC 亲水作用液相色谱 其他HILC柱硅胶柱氨基柱丙基酰胺柱亲水键合硅胶柱 多羟基等 问题 为什么不考虑SCX或SAX HILIC柱特性 HILIC柱用于在AQ柱上依然无有效保留的场合分离机制为 反反相色谱 技术HILIC柱与C18柱上的出峰顺序刚好相反由于使用含高有机溶剂成分的流动相进行分离 在LC MS应用中的检测灵敏度比AQ柱上显著提高可直接将样品溶于纯有机溶剂中进样 省却了将样品溶剂蒸干再定容的麻烦 HILIC保留特性1 固定水 利用氢键作用2 离子交换作用 洗脱能力 water methanol ethanol propanol acetonitrile acetone 三聚氰胺和三聚氰酸同时检测 FDA推荐Zic HILIC 49 突破高纯硅胶柱局限性的必要性 硅胶柱pH适用极限 0 10 20 30 40 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 k pH 硅醇基解离 带负电荷 硅醇基未解离 碱性化合物具良好峰形但保留不足 对碱性化合物的保留增强 但需严格控制流动相pH值 封端不佳的反相柱会面临峰拖尾的问题 硅醇基完全解离 硅胶基体逐步溶解 碱性化合物呈中性 保留强 峰性佳 需要全新的柱技术 50 宽pH值色谱柱突破硅胶柱应用禁区的有力手段 优点 缺点 无机基质 C18 硅胶 机械强度高柱效高保留稳定 有限的pH应用范围对碱性分析物拖尾化学不稳定性 有机基质 高聚物 很宽的pH应用范围无离子型作用化学稳定性好 机械强度不佳柱效低保留行为难以预测 宽pH值色谱柱 51 宽pH值色谱柱的几种类型 双齿键合 Agilent 52 四乙氧基硅烷 TEOS 硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷 MPEOS 甲基三乙氧基硅烷 MTEOS Waters专利技术荣获2000年全球R D100大奖 杂化颗粒柱 XTerra 的合成过程示意 53 第二代杂化颗粒技术 54 高pH条件下柱稳定性的强化测试结果柱寿命比超纯硅胶柱提高十倍以上 55 pH对填料稳定性的影响 高pH实验pH 8时 许多C18硅胶基质过早地丧失柱效由于填料颗粒溶解 色谱柱内产生空隙随着键合相覆盖率的增加 色谱柱寿命延长低pH实验pH 2时 许多C18硅胶基质过早地丧失柱效由于键合相之水解作用 被测物丧失保留行为使用三官能团键合相可获得最佳的稳定性 56 灵敏度与选择性的改变 色谱柱 XTerra RP18 4 6 x150mm 3 5 m检测 254nm 相同进样量 流动相 50 乙腈 40 水 10 含100mMCAPSO pH10流动相 30 乙腈 60 水 10 含100mM磷酸钠 pH2 0 Minutes pH10 色谱图重叠 pH2与10 阿司咪唑与酮康唑分析 57 简化方法开发过程 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 pH 中间pH硅胶柱 低pH硅胶柱 高pH聚合物基质柱 宽pH范围填料色谱柱 宽pH值色谱柱之宽pH范围 以一当三 58 温度 pH 宽pH值色谱柱 高温稳定性 59 高温寿命试验 Conditions Column XTerra RP18 5 m 4 6X150mmMobilePhase 40 pH7 10mMNa2PO4 60 ACNColumnTemp 60 CFlowRate 1 5mL minDetector 254nm 三环抗抑郁药物分离 60 宽pH值色谱柱的优点 为方法开发提供了极其有效且方便的工具宽pH范围良好色谱峰形高稳定性 61 基于杂化颗粒的XTerraRP18柱与普通C18硅胶柱在分离酸性 碱性化合物时的拖尾因子比较 62 为何杂化颗粒柱可增强在高pH下的柱寿命 硅胶快速溶解严重的柱失效柱寿命短暂 SurfacemodifiedSilicaParticles 因嵌入硅甲基的阻挡 颗粒表面溶解速度明显减缓柱寿命大大延长 XTerra HybridParticles 普通硅胶柱 基于杂化颗粒的Xterra柱 63 基质溶解度 ppm 1234567891012 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 pH 基质溶解度曲线 传统硅胶柱适用范围pH2 7 各种基质的液相柱在高pH中溶解速率的比较 液相柱基体材料的溶解导致柱前端形成空腔 由此而造成色谱峰畸形 分叉 现代超纯硅胶柱适用范围pH2 8 宽pH值色谱柱适用范围pH1 12 64 宽pH值色谱柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值 Note ColumnParticle Temperatureand OrganicHeldConstant 0 1 1 10 100 0 2 4 6 8 10 12 14 pH k Acetaminophen Ibuprofen Nortriptyline Lidocaine Doxepin Imipramine p Toluamide MobilePhase 35 MeCN 65 20mMBuffer 硅胶柱 宽pH值色谱柱 Dibucaine 局部麻醉药 碱性化合物 美国药典USP28上所推荐的色谱方法淋洗剂 1 2g十二烷基磺酸钠 SDS 0 2g醋酸钠 2 0ml三乙基胺溶于300ml水中 调pH至5 6 然后加700ml甲醇3 9x300mmL1柱 要求拖尾因子 3 0 SDS 表面活性剂 离子对试剂TEA 竞争碱为对抗峰拖尾而加入 文献pKa 8 9 66 Minutes 0 12 分析柱 XTerra RP18 4 6 x150mm 3 5 m检测波长 254nm流动相 50 ACN 40 Water 10 aqueous100mMNH4HCO3 pH10 3 USPTF1 02 6 GoodPeakShapeNoAdditivesSimplemobilephase 用杂化柱在高pH下分析Dibucaine拖尾问题迎刃而解 67 Altretamine 三嗪类抗癌药物 强碱性化合物 美国药典USP28上所推荐的色谱方法流动相 制备甲醇与缓冲液的混合液 790mg碳酸铵 NH4 2CO3溶于1000mL水中 调节pH至8 0 0 05 65 35 色谱柱 一根以USPL1填制的4 6 mmx30 cm分析柱 USP拖尾因子不得大于1 5 pKa 10 3 正确的做法是用碳酸氢铵而不是碳酸铵来配制缓冲液pH需要控制在 0 05范围内 68 分析柱 XTerra RP18 4 6 x150mm 3 5 m检测波长 227nm流动相 50 ACN 40 Water 10 aqueous100mMNH4HCO3 pH10 0 USPTF 1 08 用杂化柱在高pH下分析Altretamine柱寿命 峰拖尾和方法重现性问题迎刃而解 69 您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题 ProductQuality Price Waters PeakTailing RetentionReproducibility 峰拖尾 28 保留时间不重现 25 分离不佳 24 柱寿命太短11 极性化合物保留不佳 12 70 我的色谱分离为何重现性不佳 仪器系统问题泵精度 维修保养状况色谱柱是否置于恒温箱中系统滞后体积发生改变 仅影响梯度分离 柱与柱间分离表现发生改变您的色谱柱是否购自可靠的生产和销售厂家 源自方法本身的问题流动相的配制方法在无意中发生了改变分离可离子化化合物 酸 碱 未在流动相中使用缓冲液 或缓冲液的浓度不足 流动相的pH值与被分析酸性 碱性化合物的pKa相近 71 梯度分离时系统滞后体积变化对分离时间的影响 10 00 15 00 20 00 25 00 123 4 5 10 00 15 00 20 00 25 00 Minutes 123 4 5 系统A 泵滞后体积800 L 系统B 泵滞后体积 1000 L 分离在同一根色谱柱上进行 解决方案 1 在梯度表的每一个时间段中加入相应的补偿时间2 在Empower软件上启动 柱前体积 功能 72 需指明哪个溶剂先加 如将甲醇加入水中还是水加入甲醇中 关于流动相pH的提醒 缓冲液的pH需在加入有机溶剂前调试 流动相的配制顺序 您常常忽视的细节 73 pH 0 1 1 10 100 0 2 4 6 8 10 12 14 保留因子 k 酸 未离子化 中性化合物 碱1 碱1 2 完全离子化 酸 完全离子化 碱2 未离子化 B1 N A B2 pH5 5 pH6 0 您的分析方法为何重现性不佳 流动相缓冲pH值是否靠近分析物的pKa范围 如图所示 在靠近中性pH区间分析可离子化化合物时需要对流动相pH进行非常仔细的控制 74 1 p Toluamide2 Lidocaine3 Ibuprofen Grumbach Diehl 分析方法对pH敏感度的测试 糟糕的结果 Column XTerra RP184 6x100mm 5 mMobilePhaseA 20mMAmmoniumAcetate pH5 0to5 8 or20mMAmmoniumBicarbonate pH6 8to7 0 MobilePhaseB ACNFlowRate 0 5mL minIsocraticMobilePhaseComposition 40 A 60 BInjectionvolume 10 LTemperature 30oCDetection UV 230nmInstrument AllianceTM2690 996PDA 75 1 p Toluamide2 Lidocaine3 Ibuprofen Grumbach Diehl Column XTerra RP184 6x100mm 5 mMobilePhaseA 20mMAmmoniumAcetate pH5 0to5 8 or20mMAmmoniumBicarbonate pH6 8to7 0 MobilePhaseB ACNFlowRate 0 5mL minIsocraticMobilePhaseComposition 40 A 60 BInjectionvolume 10 LTemperature 30oCDetection UV 230nmInstrument AllianceTM2690 996PDA 分析方法对pH敏感度的测试 糟糕的结果 76 分析方法对pH敏感度的测试 优异的结果 77 杂化颗粒柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值 Note ColumnParticle Temperatureand OrganicHeldConstant 0 1 1 10 100 0 2 4 6 8 10 12 14 pH k Acetaminophen Ibuprofen Nortriptyline Lidocaine Doxepin Imipramine p Toluamide MobilePhase 35 MeCN 65 20mMBuffer 硅胶柱 Xterra X Bridge杂化颗粒柱 您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题 ProductQuality Price Waters PeakTailing RetentionReproducibility 峰拖尾 28 保留时间重现性不佳 25 分离不佳 24 柱寿命太短11 极性化合物保留不佳 12 79 我的色谱柱寿命为何不长 您是否有恰当的样品前处理手段 样品前处理 净化和富集 的好坏不仅影响分析结果的灵敏度和可靠性 而且直接影响色谱柱的寿命您的色谱柱是否有适当的保护措施 在线过滤器保护柱您的色谱柱是否曾暴露在过于剧烈的分离条件 使用某些对填料基体有腐蚀性的高浓度缓冲盐 如在中性或碱性pH区域使用高浓度缓冲盐的磷酸盐或硼酸盐 柱温过高将色谱柱暴露在极端pH的流动相中 80 您在日常HPLC分析工作中所面临的常见问题 ProductQuality Price Waters PeakTailing RetentionReproducibility 峰拖尾 28 保留时间不重现 25 分离不佳 24 柱寿命太短11 极性化合物保留不佳 12 81 影响分离度的若干因素 柱效N 2 R 40 分离选择性 方法开发归根结底是如何使得a 1 保留因子K最佳 5 82 如何在实践中调控 a 这是方法开发的根本 83 溶剂选择性 常用溶剂 甲醇 MeOH 乙腈 MeCN 其他溶剂 异丙醇 IPA 乙醇 EtOH THF Tetrahydrofuran 使用不同溶剂 可以改变选择性和洗脱强度 84 反相色谱中选择性的调节工具 1不同类型2不同键合相3不同品牌 85 色谱柱选择 86 反相色谱中选择性的调节工具 87 选择性与pH 仅影响带离子型官能团的待测物如 胺 羧酸及酚类等pH不影响不能发生电离的中性物质的保留大多数药物含有一个或多个离子型官能团pH变化引起的选择性变化最大 88 pH带来的保留与选择性变化 化合物从离子化状态变化到非离子化状态其保留因子变化10到30倍上述变化相当于有机溶剂的比例变化20 pH带来最显著的选择性变化pH是方法开发最强有力的选择性调节工具 89 方法开发的基本思路 哪一根色谱柱可以在低PH下得到 所有杂质峰基线分离 所有杂质峰之峰形良好 主峰与杂质完全分离 用PDA或MS确定峰纯度 次要色谱峰足够的信噪比 S N 如果答案是肯定的 则选择此色谱柱 并在此基础上进一步优化方法 有机相比例 如果答案是否定的 尝试使用高pH分离条件 90 90 运行低pH快梯度 在选择性不同的所有色谱柱上 确定等度分离条件 在选择性不同的几根色谱柱上运行低pH等度分离实验 药物破坏性实验产物 降解原料药 对上述结果满意吗 运行高pH快梯度 硅胶基质色谱柱 pH7杂化基质色谱柱 pH10 确定等度分离条件 在选择性不同的几根色谱柱上运行高pH等度分离实验 药物破坏性实验产物 降解原料药 对上述结果满意吗 选择色谱柱并优化等度方法 选择色谱柱并优化等度方法 是 是 否 其他选择 1 考虑用甲醇替换乙腈2 考虑采用更高的温度 否 HPLC方法开发思路 91 91 频繁切换分析柱 流动相溶剂和缓冲液过于繁琐 自动方法开发系统 AMDSsystem 可帮您解决问题 A C B D SolventSelector ControlledviaContactClosures D3 D2 D1 MobilePhases AH2OBMeCNCMeOHD1pH3NH4COOHD2pH10NH4HCO3D310 MeCN valvewash Totalof6bottlescanbeusedforlineD 3 6columnselector Note Forfullcontrolviacomputer upgradetoEmpowersoftware 92 探索性HPLC方法开发 93 色谱条件 色谱柱规格4 6mmx50mm 3 5mm梯度洗脱0 to80 tg 15minMeOH和MeCNpH3 甲酸铵缓冲液 或pH9 碳酸氢铵缓冲液 流速 2mL min温度 30oCAlliance HPLC系统 94 例 利尿剂 分离极性相差很大的9种物质用梯度方法考察pH 固定相 及流动相对分离的影响选择最佳色谱条件 最终获得梯度分离结果 95 梯度分离测试混合物 利尿剂 5Benzthiazide WA 8Bumetanide Z 7利尿酸 Ethacrynicacid A 6丙磺舒 Probenecid A 4利尿磺胺 Furosemide Z 2氯噻酮 Chlorthalidone WA 9Canrenoicacid A 1氨苯喋啶 Triamterene B 3Althiazide WA 96 利尿剂 使用乙腈的起始梯度分离 pH3 64pH9 0 Wagrowski Tran 97 pH3 64pH9 0 Wagrowski Tran 利尿剂 使用甲醇的起始梯度分离 98 两种条件下的分离结果考察 没有任何起始条件可以完全分离所有化合物pH带来最大的选择性变化碱性pH条件下色谱峰间隔较小酸性pH条件下色谱峰的分离度较大 99 利尿剂酸性pH条件下的起始梯度分离比较 Wagrowski Tran 乙腈甲醇 100 甲醇体系 最终梯度优化结果 色谱柱 XTerra MSC18 4 6x5