RNAI原理及应用2.ppt

RNAi的原理与应用 刘小军 背景 DNADoubleHelix 1953 FrancisH CrickJamesD Watson 中心法则 分子生物学的基本法则 Genome mRNA Protein Cellularresponses miRNAsiRNA rRNAtRNA 人类基因组绝大部分都被转录成RNA细胞内非编码RNA的数量是编码RNA的上百倍生物体复杂性被隐藏在它们所输出的非编码RNA内 而非编码序列内 RNA mRNAProtein codingRNA ncRNANon codingRNA TranscribedRNAwithastructural functionalorcatalyticrole rRNARibosomalRNAParticipateinproteinsynthesis tRNATransferRNAInterfacebetweenmRNA aminoacids snRNASmallnuclearRNAIncl RNAthatformpartofthespliceosome snoRNASmallnucleolarRNAFoundinnucleolus involvedinmodificationofrRNA RNAiRNAinterferenceSmallnon codingRNAinvolvedinregulationofexpression OtherIncludinglargeRNAwithrolesinchromatinstructureandimprinting siRNASmallinterferingRNAActivemoleculesinRNAinterference miRNAMicroRNASmallRNAinvolvedinregulationofexpression ModifiedfromGENESVIII p 301 324 703 RNA的种类 RNAi的发现 转录后基因沉默 PTGS 的发现 目的 1990年美国人纳波里利用转基因技术将一种催生红色素的CHS基因插入牵牛花中 期望得到更艳丽的花朵 结果 原来开紫花的花色没有加深 花瓣变成了白色 或杂色 ThePlantCell 2 279 289 1990 Inhibitionbyinjectedanti senseRNA SenseRNAhadsimilareffects Double strandedRNAnottested thatwashowtoloseaNobelprize Co suppression PTGS 推断 导入的chs基因与同源的内源chs基因的表达均受到抑制 Co suppressionPTGS post transcriptionalgenesilencing转录后的基因沉默 另一次意外的发现 1995年 利用反义RNA anti senseRNA 技术特异性地阻断线虫par 1基因的表达 同时在对照实验中给线虫注射正义RNA senseRNA 以期观察到基因表达的增强 结果 二者都同样地切断了par 1基因的表达途径 SuGuo博士康乃尔大学 单链RNA导致 同源基因沉默 的现象 与传统上对反义RNA技术的解释正好相反 Double strandedRNAisthetrick Effectofmex 3RNAinterferenceonlevelsofendogenousmRNANegativecontrolNormalpatternofmex3expression embryofromaparent uninjectedc EmbryofromaparentinjectedwithantisenseRNAd EmbryofromaparentinjectedwithdsRNA Fire Xu Montgomery Kostas Driver Mello 1998 Nature391 806 811 Figure2 Theeffectonmex 3mRNAcontentinembryosafterinjectionofsingle strandedordouble strandedmex 3RNAintothegonadofC elegans mex 3mRNAisabundantinthegonadsandearlyembryos ThemRNAwaslostafterinjectionofdouble strandedRNA whileinjectionofantisenseRNAonlyreducedthecontentofmRNAtosomeextent TheextentofbrowncolourreflectstheamountofmRNApresent 14 Yrd Do Dr ErdalBalcan Figure1 Phenotypiceffectafterinjectionofsingle strandedordouble strandedunc 22RNAintothegonadofC elegans Theunc 22geneencodesamyofilamentprotein Decreaseinunc 22activityisknowntoproduceseveretwitchingmovements Injecteddouble strandedRNA butnotsingle strandedRNA inducedthetwitchingphenotypeintheprogeny 15 Yrd Do Dr ErdalBalcan 单链RNA纯化后注射线虫 基因抑制效应十分微弱 双链RNA能够高效特异性阻断相应基因的表达 RNAi RNAinterference 的首次报道 AndrewZ Fire CraigC MelloSuGuo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象 以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断 都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起 1体外转录所得单链RNA中污染了微量双链RNA而引起 2双链RNA的基因抑制作用更为强大 Hunter的实验 1999年 将dsRNA去除后 再将正义或反义的ssRNA注入线虫卵中 没有产生基因沉默现象 如果将上述正义及反义ssRNA混合 经退火复性后得到的dsRNA注人线虫卵中可以显著地产生基因沉默现象 印证了Fire等提出的RNAi作用是由dsRNA引起的结论 RNAivssiRNA RNAinterference由双链RNA诱导的同源mRNA的降解过程可以使基因的表达受到抑制在转录后水平抑制基因表达一种研究基因功能的有力工具 SmallinterferingRNA是一种小RNA分子 21 25核苷酸 由Dicer加工而成 siRNA是siRISC的主要成员 激发与之互补的目标mRNA的沉默 可直接人工合成也可为dsRNA和shRNA被酶切而成 RNAi的生物学作用 抵抗病毒的防御机制沉默过表达的mRNA保护基因组免受转座子的破坏 RNAi的用途 功能基因组学研究治疗肿瘤寄生虫病毒 RNAi的重要意义 科学 杂志 Science 在2001年将其列为十大科学成就之一 科学 杂志 Science 在2002年又将其列为当年十大科学成就之首 自然 杂志 Nature 在2002也将小RNA评为当年重大科技成果之一 RNAi的作用机制 RNAi的过程 生成 倍增 RNAi的过程 RISC RNA inducedsilencingcomplex Caplen GeneticsBranch CCR NCI NCAB December2008 8 21 Theinductionofgene specificRNAiagainstcancer associatedgenes EfficacySpecificity AssaysmRNAProtein DeliverysiRNAshRNA Function Kassner CombChem11 175 2008 Dicer RNaseIII 解旋酶 RISC RNA诱导的沉默复合体 具有解旋酶 内切酶及外切酶活性 RNAinterference RNAi siRNA 小分子干扰RNA RNAinterference RNAi Yrd Do Dr ErdalBalcan DICER的结构 35 Yrd Do Dr ErdalBalcan DicercontainstwoRNAseIIIdomains siRNAs longdsRNA ThePAZdomainbindsthe2nt3 overhangofadsRNAterminus TheRNaseIIIdomainsformapseudo dimer Eachdomainhydrolyzesonestrandofthesubstrate ThebindingsiteofthedsRBDisnotdefined Hammond 2005 FEBSLett579 5822 5829 ModelforDicercatalysis Yrd Do Dr ErdalBalcan ZhangH KolbFA JaskiewiczL WesthofE FilipowiczW SingleprocessingcentermodelsforhumanDicerandbacterialRNaseIII Cell 2004Jul9 118 1 57 68 Dicer的结构 38 Yrd Do Dr ErdalBalcan processingthedsRNAinto21 23ntfragments Tuschl 2001 小干扰RNA结构特点 19 nt双链2