1丹红注射液对大鼠腹主动脉的舒张作用及机制研究.doc

丹红注射液对大鼠腹主动脉的舒张作用及机制研究崔婷1，智晓文，苏显明，崔长琮，封卫毅2西安交通大学医学院第一附属医院，陕西 西安 710061摘要：目的 研究丹红注射液的扩血管作用及其机制。方法 分别利用大鼠在体后肢血管灌流和腹主动脉环离体灌流模型，考察丹红注射液对去甲肾上腺素NE（110-5mol/L）、氯化钾KCl (30mmol/L)预收缩血管的舒张作用以及血管内皮细胞、血管平滑肌在该效应中的作用。结果 丹红注射液可明显改善高NE（110-5mol/L）引起的大鼠组织血液灌注减少（P0.01），对高钾(30mmol/L)引起的组织血液灌注减少也有一定的改善作用（P0.05）；丹红注射液明显降低高NE（110-5mol/L）和高钾(30mmol/L)尤其由高NE所引起的血管平滑肌张力增加（P0.05）。结论 丹红注射液对高NE引起的血管收缩具有明显的拮抗作用，其机制可能与减少动脉血管平滑肌细胞外钙经受体操纵性钙通道和电压依赖性钙通道、尤其是经受体操纵钙通道的内流有关；丹红注射液的血管舒张作用部分是通过内皮细胞发挥作用。关键词 丹红注射液；大鼠后肢灌流；血管平滑肌；腹主动脉Vasodilatation effect of Danhong Injection on rat abdominal aorta and its mechanismsTing Cui1, Xiaowen Zhi, Xianming Su, Changzong Cui, Weiyi Feng2First affiliated hospital of medical college, Xian Jiaotong University, Xian 710061, China-1. 作者简介：崔婷（1984-），女，陕西宝鸡人，硕士研究生，研究方向：血管新生2 通讯作者：封卫毅（1968-），男，陕西西安人，主任药师，硕士生导师，医学博士，Tel:-mail:基金项目 本课题受陕西省中医药管理局课题（课题编号：jc37）资助。Abstract: Objective To investigate the vasodilatation effect of Danhong Injection and its possible mechanism. Methods To observe the effect of Danhong Injection on norepinephrine 110-5mol/L or potassium chloride 30mmol/L treated blood vessel in vivo and in vitro. The flow rate of arterial perfusion on rat hindlimb and the tensile force of rat aorta ring were measured. Results Danhong Injection significantly rescued the reduction of flow in vessels in vivo caused by norepinephrine 110-5mol/L（P0.01）, and mildly ameliorated the decrease of blood supply induced by high potassium 30mmol/L concentration(P0.05). No effects of potassium channel blockers TEA or 4-Ap on aorta ring tensile force were found. Conclusion Danhong Injection showed a significant vasodilatation effect on contracted vessels induced by norepinephrine. Danhong Injection inhibited norepinephrine-induced arterial contraction by reducing Ca2+ influx through receptor operated calcium channel and voltage-dependent calcium channel on smooth muscle cells in blood vessel. Danhong Injection showed a significant vasodilatation effect on norepinephrine or potassium chloride treated aorta rings with endothium.Key Words: Danhong Injection; hindlimb perfusion; endothelial cell; abdominal aorta丹红注射液是丹参和红花的提取物，含有丹参酮、丹参酸、丹参酚酸及红花黄色素、红花酚苷和儿茶酚等化学成分，具有活血化瘀、通脉舒络之功效。临床上1将其大量应用于动脉粥样硬化、心肌梗死等心脑血管疾病的治疗，可以明显缓解脏器组织供血不足、改善血液流变学指标。然而，目前对于丹红注射液治疗作用的研究多为临床资料，对于丹红注射液发挥临床治疗效果的药理学基础则知之不多。因此，本研究拟以大鼠在体后肢灌流模型和离体大鼠腹主动脉环为模型，观察丹红注射液舒张血管的作用及其机制，为丹红注射液治疗微循环等疾病提供理论参考。1 材料1.1 动物Sprague-Dawly（SD）大鼠，体重180-220g 81只， 兼用，由西安交通大学实验动物中心提供。合格证：SCXK(陕)2007-001号。1.2 仪器设备PowerLab数据记录和分析系统，包括软件Chart 510 以及硬件8 通道桥式放大器(AD Instruments Co. , Australia) ；FT03C张力换能器( Grass Instrument Co. Quincy，Mass.，USA) ；Myograp恒温浴漕 (DMT，Denmark) ； 体视显微镜（Nikon SMZ-1500）。1.3 药品及试剂丹红注射液（国药准字Z20026866，为淡红褐色透明液体，菏泽步长制药有限公司，批号：090114，规格：10ml/支）；重酒石酸去甲肾上腺素注射液（NE，上海禾丰制药有限公司产品，批号：100302）；甲磺酸酚妥拉明注射液（Phentolamine Mesilate Injection，上海旭东海普药业有限公司）；阿托品（天津金耀氨基酸有限公司产品）；咖啡因(caffeine，熔点标准品，陕西省药品检验所馈赠）；四氨基吡啶（4-Ap）和四乙胺(TEA)均为Sigma公司产品。1.4 统计学方法 实验数据除特殊标注外，其余均以平均值标准差()表示，组间均数的两两比较采用t检验。2试验方法及结果2.1. 丹红注射液对在体大鼠后肢灌流血管阻力的影响2,3将乌拉坦（1g/kg,ip）麻醉的大鼠置于实验台固定，沿腹部正中切开，分离腹主动脉与静脉，在肾血管水平向远心端插管，并结扎近心端。腹主动脉插管灌注37氧饱和的Krebs灌流液，调节灌流压至50mmHg，平衡0.5h后，依次用含有不同浓度药物的灌流液灌流，经腹主静脉插管回收灌流液，测定单位时间内回收灌流液的体积。更换药物前，均用空白灌流液平衡灌流0.5h,使灌流速度恢复至用药前水平。以空白灌流液平衡状态下的灌流速度作为100%，计算在同一标本上药物灌流时的相对流速。相对流速含药灌流液灌流流速/空白灌流液灌流流速100%2.1.1 丹红注射液对正常大鼠后肢血管灌流的影响结果如表1所示，阳性对照药110-5 molL-1阿托品可显著增加大鼠后肢血管灌流速度，而丹红注射液在0.1至10mlL-1浓度下对大鼠后肢灌流速度均无明显影响，仅在高浓度（30 mlL-1）时对灌流速度的增加具有统计学意义。表1. 丹红注射液对正常大鼠后肢血管灌流速度的影响（n=8）Table 1 Effect of Danhong Injection on the flow rate of arterial perfusion on normal rat hindlimb (n=8)组别空白对照丹红注射液阿托品0.1ml/L0.3ml/L1ml/L3ml/L10ml/L30ml/L110-5M相对流速10010419108231062797311043613330*274184* 注：与空白对照组相比，* p0.05；* p0.01Comment：compare to control，* p0.05；* p0.012.1.2 丹红注射液对KCL预收缩大鼠后肢灌流血管阻力的影响以Krebs液冲洗平衡标本，再用含30 mmolL-1 KCl的Krebs液灌流40min，使血管预收缩至稳定状态，随后观察不同浓度丹红注射液对灌流速度的影响。如表2-1和表2-2所示，在加入KCl后，灌流速度有明显降低，平均流量减少约34%；阳性对照药阿托品可明显对抗高钾所引起的灌流速度降低。丹红注射液对KCl引起的血管收缩有轻微对抗作用，但仅3 mlL-1浓度组表现出具有统计学意义，显示对抗高钾引起的血管阻力升高作用较弱。表2-1高钾条件对大鼠后肢灌流速度的影响（n=8）Table 2-1 Effect of high K+ induced the flow rate of arterial perfusion on rat hindlimb (n=8).组别空白对照组高钾组(30mM/L)灌流速度（ml/min）1.9*注：与空白对照组相比，* p0.05Comment：compare to control，* p0.05表2-2 丹红注射液对高钾条件下大鼠后肢灌流速度的影响（n=8）Table 2-2 Effect of Danhong Injection on High K+ induced the flow rate of arterial perfusion on rat hindlimb（n=8）.组别空白对照组高K+组模型对照组30 （mmolL-1）高K+ +丹红注射液高K+ +异丙肾0.3ml/L组1.0ml/L组3.0ml/L组110-5M相对流速207551001151011124812726*18064*注：与模型对照组相比，* p0.05；* p0.01Comment：compare to model，* p0.05；* p0.012.1.3 丹红注射液对NE预收缩大鼠后肢灌流血管阻力的影响如表3-1和表3-2所示，含有110-6 molL-1 NE的Krebs液可引起灌流速度的急剧降低，显示血管阻力明显增加；与受体阻断剂酚妥拉明相似，0.3 mlL-13 mlL-1浓度的丹红注射液可以明显对抗NE导致的灌流速度降低，显示可显著缓解NE引起的血管阻力增加。表3-1 高NE条件下大鼠后肢灌流速度的影响(n=9)Table 3-1 Effect of high norepinephrine induced the flow rate of arterial perfusion on rat hindlimb (n=9).组别正常灌流（n=9）110-6 molL-1 NE灌流（n=9）灌流速度ml/min07*注：与正常灌流组相比， * p0.05Comment：compare to control，* p0.05表3-2 丹红注射液对高NE引起的大鼠后肢灌流速度的影响（n=9）Table 3-2 Effect of Danhong Injection on high norepinephrine induced the flow rate of arterial perfusion on rat hindlimb (n=9).组别正常灌流NE灌流模型对照组110-6mol/LNE+丹红注射液NE+酚妥拉明0.3ml/L组1.0ml/L组3.0ml/L组110-5M相对流速17332177*10018580*222145*371235*437254*注：与模型对照组相比，* p0.05；* p0.01Comment：compare to model，* p0.05；* p0.012.2 丹红注射液改善组织血流供应的机制研究4,5大鼠断头处死后迅速取出动脉血管，浸入冷Krebs液中在显微镜下剥离血管周围组织。以Ach（1105 molL-1）检验内皮功能，若舒张率75%则表明内皮完整，舒张率10%则显示内皮已被完全去除。用于去内皮试验的血管标本在实验前用0.1%的Trinton X-100灌注5s，然后再用Krebs液灌注10s。将处理好的血管剪成1mm长的动脉环，套在两个L型的金属针上，一端连接FT03C张力换能器，另一端连接调节负荷张力的微调装置，并将连接好的动脉环置于37恒温氧饱和的Krebs灌流液中。实验前，调节动脉环静息负荷至2mN，每20min换液一次，稳定1.5h。以K+-Krebs液（含60mmolL-1K+）检验动脉环收缩性，两次收缩幅度变化小于10%的标本用于实验。用四乙胺（TEA）或四氨基吡啶（4-Ap）预孵育0.5h后，以NE（1105 molL-1）预收缩血管，收缩稳定后累加浓度法加入丹红注射液或等体积灌流液，对比观察药物的作用。2.2.1 丹红注射液对大鼠腹主动脉环基础张力的影响标本平衡灌流待基线稳定后，浓度累加法加入丹红注射液或Krebs液平行操作，观察丹红注射液对大鼠腹主动脉血管环基础张力的影响。结果如图1所示，丹红注射液从3ml/L开始，舒张血管作用与空白对照组相比表现出统计学意义（P0.05）。然而在此浓度范围内，虽然药物影响的统计学意义明显，但对正常血管的张力幅度实际影响较小，血管平均张力降低幅度均不超过12%（图2）。图1. 丹红注射液对对大鼠腹主动脉血管环基础张力影响（n=8）Fig 1 Effect of Danhong Injection on basic tension of rat abdominal aortic rings (n=8).注：与空白对照组相比，* p0.05；* p0.01Comment : compare to control，* p0.05；* p0.01图2：丹红注射液对大鼠腹主动脉环基础张力的平均相对张力(n=8)Fig 2The average relative tension of Danhong Injection on basic tension of rat abdominal aortic rings (n=8).2.2.2 丹红注射液对NE预收缩含内皮或去内皮腹主动脉环的舒张作用以110-6 molL-1浓度NE预收缩血管，稳定后浓度累加法加入丹红注射液或空白对照Krebs液。如图3所示，丹红注射液既能浓度依赖性地舒张NE预收缩含内皮的血管环(P0.01)，也能够浓度依赖性地舒张NE预收缩的去除内皮的血管环(P0.05），但相对于各自的内皮完整和去内皮空白对照组，在3 mlL-1、10 mlL-1、20 mlL-1、30 mlL-1、40 mlL-1浓度下两组相对张力降低的幅度之间存在明显性差异(P0.05)（图4）。上述结果表明，丹红注射液对腹主动脉血管环的舒张除通过平滑肌起作用外，内皮细胞也发挥一定的作用。其中：相对张力降低的幅度=给药组相对张力对照组相对张力图3丹红注射液对NE预收缩含内皮和去内皮大鼠腹主动脉张力的影响（n=8）与含内皮对照组相比，* p0.01；与去内皮空白对照组相比，# p0.01Fig 3Effect of Danhong Injection on high norepinephrine treated the tension of rat abdominal aortic rings with or without endothelia (n=8).Comment: compare to endothelia (+) control，* p0.01；compare to endothelia () control，# p0.01图4 丹红注射液对含内皮和去内皮大鼠腹主动脉环张力降低幅度的影响（n=8）与去内皮组相比，* p0.05，* p0.01Fig 4 The decreased range of Dan Hong Injection on rat abdominal aortic rings with or without endothelia（n=8）.Comment：compare to endothelia()，* p0.05，* p0.012.2.3 丹红注射液对KCl预收缩大鼠腹主动脉环的舒张作用内皮完整的腹主动脉血管环，稳定灌流1.5h，加入KCl（终浓度60mmolL-1）稳定40min后，累积法依次加入丹红注射液或空白对照Krebs液。如图5所示，丹红注射液可舒张KCl预收缩的血管环，且呈浓度依赖性。图5. 丹红注射液对KCl预收缩腹主动脉血管环相对张力的影响（n=8）注：与含空白对照组比，* p0.01Fig 5 Effect of Danhong Injection on KCL-preconstricted rat aortic rings（n=8）Comment: compare to control，* p0.012.2.4 在腹主动脉上钾离子通道阻滞剂TEA或4-Ap对丹红注射液拮抗高NE血管收缩作用的影响腹主动脉环平衡灌流1.5h后，用K+（60mmolL-1）检验血管活性，合格后分别以四乙胺(TEA)110-3 molL-1或四氨基吡啶(4-Ap)110-4 molL-1预孵育内皮完整的腹主动脉环0.5h，加入110-6 molL-1浓度NE预收缩大鼠腹主动脉，稳定后按浓度梯度法加入丹红注射液或空白对照Krebs液，对比观察丹红注射液的血管舒张效应。计算相对张力降低幅度。相对张力降低幅度=对照组相对张力值（%）丹红组相对张力值（%）结果如图6和图8所示，无论钾离子通道阻滞剂TEA或4-Ap存在与否，NE对腹主动脉的的收缩作用均无明显变化，显示TEA和4-Ap对NE收缩腹主动脉的作用均无明显影响；在TEA或4-Ap存在下，与空白对照组相比，丹红注射液均可显著性拮抗NE引起的血管收缩 (P0.05）（见图7和图9）。由以上结果可知，在腹主动脉上钾离子通道阻滞剂TEA和4-Ap对丹红注射液拮抗高NE血管收缩的作用均无明显影响，丹红注射液舒张血管作用在腹主动脉上与钾离子通道无关。图6. 在腹主动脉环上TEA对丹红注射液拮抗高NE血管收缩作用的影响(n=8)注：与含空白对照组比，* p0.05，* p0.01；与无TEA对照组比，# p0.01Fig 6Effect of K+ channel blocker TEA for high NE vasoconstriction caused by antagonism of Danhong injection. (n=8)Comment: compare to control, * p0.05，* p0.01；compare to control(TEA)，# p0.01图7. 在腹主动脉环上TEA对丹红注射液拮抗高NE血管收缩作用的影响(n=8)注：与丹红组比，* p0.05Fig 7Effect of K+ channel blocker TEA for high NE vasoconstriction caused by antagonism of Danhong injection. (n=8)Comment：compare to Danhong Injection，* p0.05图8. 在腹主动脉环上4-Ap对丹红注射液拮抗高NE血管收缩作用的影响(n=8)注：与空白对照组比，* p0.05，* p0.01；与无4-Ap对照组比，# p0.01Fig 8Effect of K+ channel blocker 4-Ap for high NE vasoconstriction caused by antagonism of Danhong injection. (n=8)Comment：compare to control，* p0.05，* p0.01；compare to control （4-Ap），# p0.01图9. 在腹主动脉环上4-Ap对丹红注射液拮抗高NE血管收缩作用的影响(n=8)注：与丹红组相比，* p0.05Fig 9Effect of K+ channel blocker 4-Ap for high NE vasoconstriction caused by antagonism of Danhong injection. (n=8)Comment：compare to Danhong Injection，* p0.052.2.5 丹红注射液对NE诱导的腹主动脉平滑肌细胞内钙释放以及外钙经ROCC内流的影响内皮完整的腹主动脉血管环，平衡1.5h后，用无钙Krebs液（正常Krebs液中无Cacl2并加入Ca2+络合剂110-4 molL-1 EDTA）孵育5min，然后加入110-5 molL-1的NE，可见动脉环产生迅速而短暂的收缩，平稳后加入1mmolL-1的CaCl2，可见动脉环再次收缩并达峰值，作为药前对照。然后用Krebs液反复冲洗5次，平衡45min，加入无钙的Krebs液的同时加入20ml/L的丹红注射液作用5min，重复上述实验。观察丹红注射液对无钙Krebs液中NE或CaCl2缩血管效应的影响。结果如表4所示，丹红注射液对无钙灌流条件下NE引起的血管平滑肌收缩有轻度抑制作用，相对张力下降约13.0%，且未达到统计学显著性意义（P0.05）；但丹红注射液对外钙经受体操纵性钙通道进入平滑肌细胞所引起的收缩张力增加表现出了明显的抑制效果，相对张力下降约24.2%，具有非常显著性统计学意义(P0.001)。提示在腹主动脉上丹红注射液对抗NE的扩血管作用主要与阻滞外钙内流有关。表4丹红注射液对NE诱导的腹主动脉血管平滑肌细胞内钙释放和外钙内流的影响（n=8）Table 4 Effect of Danhong injection on NE-induced intracellular calcium release and extracellular ccalcium influx in vascular smooth muscle cells (n=8).组别血管平滑肌相对张力内钙释放外钙内流空白对照组34872110.78.1丹红注射液组3026983.98.6*注：与空白对照组相比，* p0.01Comment : compare to control，* p0.012.2.6 丹红注射液对咖啡因缩腹主动脉血管效应的影响内皮完整的腹主动脉血管环，于无钙Krebs液中加入30m molL-1咖啡因，可见动脉环产生迅速而短暂的收缩，以此作为药前对照。再在无钙Krebs液中加入20ml/L的丹红注射液或作为空白对照的的等量无钙Krebs液，观察动脉环的张力变化。与空白对照组相比，在腹主动脉上，丹红注射液组的相对张力有轻微上升，但无统计学意义。结果见表5和图10。表5. 在腹主动脉上丹红注射液对咖啡因缩血管效应的影响（n=8）Table 5 Effect of Danhong Injection on Caffeine preconstricted rat aortic rings（n=8）.空白对照组丹红注射液组相对张力（%）1291014621注：与空白对照组相比，* p0.05 Comment : compare to control，* p0.05图10腹主动脉上丹红注射液对咖啡因缩血管效应的影响（n=8）Fig 10 Effect of Danhong Injection on Caffeine preconstricted rat aortic rings（n=8）3. 讨论 本次研究结果发现，丹红注射液对正常灌流条件下大鼠在体血管流量影响较小，仅在高剂量条件下有轻度的增加作用；对高浓度钾离子引起的大鼠组织血管流量减小影响较小，仅在较高浓度下对大鼠后肢灌流有轻度的增加；对高NE引起的大鼠组织灌流减少有非常显著的拮抗作用；可明显舒张由NE收缩的在体血管直径。交感神经兴奋和循环血液中的高儿茶酚胺状态既是引起组织血液灌流减少和微循环障碍的重要原因之一，也是中医上“血瘀”发生的重要的病理学基础。因此，这一观察结果提示，拮抗高NE的缩血管效应可能是丹红注射液改善组织血流供应和微循环以及发挥“活血化淤”功效的重要途径。为了探讨丹红注射液舒张血管的作用机制，本研究选择了较大的腹主动脉作为观察对象，采用大鼠离体腹主动脉环研究模型。结果发现，无论是内皮完整的还是去内皮的血管环，丹红注射液都可以拮抗NE引起的血管收缩，其中内皮完整血管的舒张幅度稍高于去内皮血管，从而提示丹红注射液的舒张血管作用除直接作用于血管平滑肌产生作用外，也通过内皮细胞发挥一定作用。KCl可以激活电压依赖性钙通道，导致细胞外钙内流而引起动脉环收缩6。丹红注射液能够舒张KCl预收缩的动脉环，提示丹红注射液可通过抑制电压依赖性钙通道，阻止钙内流而起到舒张血管的作用。钾离子通道阻滞剂TEA和4-Ap对丹红注射液拮抗高NE收缩血管的作用均无明显影响，提示丹红注射液扩张血管作用与钾通道无关。NE和咖啡因均为平滑肌钙通道研究的工具药物。在无钙液灌流条件下，NE和咖啡因均可通过促进平滑肌细胞内Ca2+释放而因引起的快速而短暂的收缩；细胞内Ca2+释放通过IP3和Ryanodine两种受体Ca2+释放途径。在含钙液灌流条件下，NE能够通过激活细胞膜上的受体操纵钙通道增强外钙内流，诱发血管收缩7,8。本次实验发现，丹红注射液对于无钙灌流条件下咖啡因引起的动脉血管平滑肌收缩的抑制作用影响较小或未见有抑制作用，提示丹红注射液发挥作用主要通过抑制IP3受体中介的钙释放，而对Ryanodine受体途径没有影响；对于无钙灌流条件下NE引起的动脉血管平滑肌收缩的抑制作用在腹主动脉上未见明显影响；对含钙灌流条件下NE诱发血管收缩有显著的抑制作用，从而提示丹红注射液可通过抑制经受体操纵钙通道的外钙内流发挥血管舒张作用。综上所述，丹红注射液对高NE引起的大鼠组织血液灌注减少和微循环降低有明显的改善作用；丹红注射液可以拮抗高NE和高钾（其中主要是高NE）所引起的血管平滑肌收缩；内皮细胞在丹红注射液的血管舒张作用中发挥一定作用；其机制可能主要与减少动脉血管平滑肌细胞外钙经受体操纵钙通道和电压依赖性钙通道、尤其是经受体操纵钙通道的内流有关。参考文献1 董立丽.丹红注射液的临床应用进展. 海南医学J,2010,21(2):115-117.,2 Bone