生物化学ppt 第三章酶.ppt

第四章酶 Enzyme 第一节酶的概念及作用特点第二节酶的命名和分类第三节酶的作用机理第四节影响酶促反应速度的因素第五节酶的活性调节第六节酶的活力测定及分离提纯第七节酶工程简介第八节维生素和辅酶 第一节酶的概念及作用特点 一 酶的概念酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊蛋白质 简单说 酶是一类由活性细胞产生的生物催化剂 酶学研究简史 公元前两千多年 我国已有酿酒记载 一百余年前 Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果 1877年 Kuhne首次提出Enzyme一词 1897年 Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液 实现了发酵 1926年 Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶 证实酶的蛋白质本质 获1946年诺贝尔奖 1982年 Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性 提出核酶 ribozyme 的概念 Cech等获得1989年诺贝尔化学奖 1995年 JackW Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段 称为脱氧核酶 deoxyribozyme 一 酶的催化特点 一 酶与一般催化剂的共性1 本身反应前后无变化酶与一般催化剂一样 在化学反应前后都没有质和量的改变 2 不改变化学反应平衡常数酶只催化热力学允许的化学反应 只能加速可逆反应的进程 而不改变反应的平衡点 作用是缩短反应达到平衡所需的时间 3 降低反应的活化能活化能指的是在一定条件下 能使l摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能 卡 摩尔 活化能 底物分子从初态转变到活化态所需的能量 二 酶的催化特性1 高度的催化效率酶催化效率比非催化反应高108 1020倍 比一般催化剂高107 1013倍 如 碳酸酐酶 每摩尔每分钟能转化3 5 107摩尔底物或每秒钟6 105摩尔底物 2 高度专一性作为一种生物催化剂 酶对其作用的底物有一定的要求 即一种酶只作用于一种或一类特定的底物 酶的专一性分为两大类 绝对特异性 absolutespecificity 只能作用于特定结构的底物 进行一种专一的反应 生成一种特定结构的产物 相对特异性 relativespecificity 作用于一类化合物或一种化学键 立体结构特异性 stereospecificity 作用于立体异构体中的一种 乳酸脱氢酶的底物和酶的三点附着 tree pointattachment 理论 D 乳酸由于 OH COOH的位置正好相反 因此造成与酶的三个基团不能完成结合 故而不能受酶的催化 3 高度的不稳定性 酶易失活多数酶是蛋白质 决定酶的作用条件一般应在温和的条件下 如中性pH 常温和常压下进行 强酸 强碱 高温条件下易使酶失去活性 4 酶的催化活性的可调节性酶促反应受多种因素的调控 以适应机体对不断变化的内外环境和生命活动的需要 其中包括三方面的调节 对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等 5 有的酶需辅助因子有些酶是复合蛋白质 由酶蛋白和非蛋白小分子物质组成 后者称为辅因子 若将它们除去 酶就失去活性 酶在生活细胞中产生 大部分酶在细胞内起催化作用 称为胞内酶 如 线粒体 呼吸酶系叶绿体 光合系统的酶系细胞核 核酸合成的酶系内质网的核糖体上和胞质溶胶中 蛋白质生物合成的酶系有些酶被分泌到细胞外发挥作用 如人和动物消化道以及某些细菌所分泌的水解淀粉 脂肪和蛋白质的酶 这类酶称胞外酶 二 酶专一性 决定于酶的活性中心的构象和性质 1结构专一性概念 酶对所催化的分子 底物 Substrate 化学结构的特殊要求和选择类别 绝对专一性和相对专一性绝对专一性有的酶对底物的化学结构要求非常严格 只作用于一种底物 不作用于其它任何物质 尿素 相对专一性有的酶对底物的化学结构要求比上述绝对专一性略低一些 它们能作用于一类化合物或一种化学键 1 键专一性有的酶只作用于一定的键 而对键两端的基团并无严格要求 2 基团专一性另一些酶 除要求作用于一定的键以外 对键两端的基团还有一定要求 往往是对其中一个基团要求严格 对另一个基团则要求不严格 消化道内几种蛋白酶的专一性 消化道蛋白酶作用的专一性 2立体异构专一性 概念 酶除了对底物分子的化学结构有要求外 对其立体异构也有一定的要求类别 旋光异构专一性和几何异构专一性旋光异构专一性 几何异构专一性 如 延胡索酸水化酶 只能催化延胡索酸即反 丁烯二酸水合生成苹果酸及其逆反应 对顺 丁烯二酸没有催化活性 据酶分子组成分类 单纯蛋白质酶类 脲酶 蛋白酶 淀粉酶 核糖核酸酶等 结合蛋白质酶类 酶蛋白质 辅助因子 辅酶或辅基 金属离子金属有机物小分子有机物 三 酶的化学本质及类别 全酶 holoenzyme 酶蛋白 辅因子 辅酶 与酶蛋白结合比较松弛 用透析法可以除去的小分子有机物 辅基 与酶蛋白结合比较紧密 用透析法不易除去的小分子物质 往往以共价键和酶蛋白结合 如细胞色素氧化酶中的铁卟啉 黄素蛋白中的FAD等 单体酶 只有一条多肽链 属于这一类的酶很少 一般是催化水解反应的酶 相对分子质量为13000一35000 寡聚酶 由几个甚至几十个亚基组成 这些亚基可以是相同的 也可以是不同的 亚基之间以非共价键结合 相对分子质量从35000到几百万 多酶复合体 是由几个酶聚合 嵌合 而成的复合体 相对分子质量一般都在几百万以上 据酶蛋白特征分类 核酶 具有催化活性的RNA分子 第二节 酶的分类及命名 1 酶的分类 每一种酶有一个编号 如乳酸脱氢酶 EC1 1 1 27 EC1 1 1 27大类亚类亚亚类序号 1 氧化 还原酶Oxidoreductase氧化 还原酶催化氧化 还原反应 主要包括脱氢酶 Dehydrogenase 和氧化酶 Oxidase 如 乳酸 Lactate 脱氢酶催化乳酸的脱氢反应 2 转移酶Transferase转移酶催化基团转移反应 即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上 例如 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应 3 水解酶Hydrolase水解酶催化底物的加水分解反应 主要包括淀粉酶 蛋白酶 蔗糖酶及脂肪酶等 例如 脂肪酶 Lipase 催化脂的水解反应 4 裂解酶Lyase裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应 主要包括醛缩酶 水化酶 脱羧酶及脱氨酶等 例如 延胡索酸水合酶催化的反应 5 异构酶Isomerase异构酶催化各种同分异构体的相互转化 即底物分子内基团或原子的重排过程 例如 6 磷酸葡萄糖异构酶催化的反应 6 合成酶LigaseorSynthetase合成酶 又称为连接酶 能够催化C C C O C N以及C S键的形成反应 这类反应必须与ATP分解反应相互偶联 A B ATP AB ADP Pi例如 丙酮酸羧化酶催化的反应丙酮酸 CO2 草酰乙酸 7 核酸酶 催化核酸 Ribozyme核酸酶是唯一的非蛋白酶 它是一类特殊的RNA 能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应 2 酶的命名 1 习惯命名法 根据其催化底物来命名 根据所催化反应的性质来命名 结合上述两个原则来命名 有时在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点 2 国际系统命名法系统名称包括底物名称 构型 反应性质 最后加一个酶字 例如 习惯名称 谷丙转氨酶系统名称 丙氨酸 酮戊二酸氨基转移酶酶催化的反应 谷氨酸 丙酮酸 酮戊二酸 丙氨酸 一些酶的命名举例 第三节酶的作用机理 一 酶的催化作用与分子活化能二 酶催化的中间产物理论三 酶的活性中心和必需基团四 酶作用专一性机理五 与酶的高效率有关的主要因素 一 酶的催化作用与分子活化能 活化能 分子由常态转变为活化态所需的能量 即 活化能指在一定温度下 1mol底物全部进入活化态所需要的自由能 单位是J mol 酶降低反应活化能的机理是通过改变反应途径 使反应沿一个低活化能的途径进行 酶的催化机理是降低活化能 二 酶催化的中间产物理论 酶 E 与底物 S 结合生成不稳定的中间物 ES 再分解成产物 P 并释放出酶 使反应沿一个低活化能的途径进行 降低反应所需活化能 所以能加快反应速度 底物分子结合在酶的底物结合中心 使底物靠拢 使底物分子产生应力 使底物分子电荷变化 概念 酶的活性中心是指酶分子结构中 能直接与底物结合 并和酶催化作用直接有关的部位 酶活性中心是酶分子中具有三维结构的区域 或为裂缝 或为凹陷 深入到酶分子内部 常为氨基酸残基的疏水基团组成的 三 酶的活性中心 必需基团 essentialgroup 酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中 一些与酶活性密切相关的化学基团 这些必需基团在一级结构上可能相距很远 但在空间结构上彼此靠近 组成具有特定空间结构的区域 能与底物特异地结合并将底物转化为产物 对于结合酶来说 辅酶或辅基参与酶活性中心的组成 活性中心内的必需基团 位于活性中心以外 维持酶活性中心应有的空间构象所必需 活性中心外的必需基团 常见 His 咪唑基 Ser 羟基 Cys 巯基 Glu 羧基 与催化作用相关的结构特点 1 活性中心 酶分子中直接和底物结合并起催化反应的空间局限 部位 结合部位 Bindingsite 酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位 催化部位 Catalyticsite 酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位 通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心 结合部位决定酶的专一性 催化部位决定酶所催化反应的性质 调控部位 Regulatorysite 酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位 从而引起酶分子空间构象的变化 对酶起激活或抑制作用 底物 活性中心以外的必需基团 结合基团 催化基团 活性中心 Asp His Ser 胰凝乳蛋白酶的活性中心 活性中心重要基团 His57 Asp102 Ser195 为Tyr248为Arg145为Glu270为底物 Zn 羧肽酶活性中心示意图 四 酶作用专一性机理 锁钥学说 将酶的活性中心比喻作锁孔 底物分子象钥匙 底物能专一性地插入到酶的活性中心 诱导契合学说 酶的活性中心在结构上具柔性 底物接近活性中心时 可诱导酶蛋白构象发生变化 这样就使酶活性中心有关基团正确排列和定向 使之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行 酶专一性的 锁钥学说 酶专一性的 诱导契合学说 五 与酶的高效率有关的主要因素 1 邻近与定向效应 2 诱导契合与底物扭曲变形 3 酶分子中可作为亲核基团和酸碱催化的功能基团 胰凝乳蛋白酶分子中催化三联体构象 六 胰凝乳蛋白酶的催化机理 六 胰凝乳蛋白酶反应的详细机制 1 结合底物 His57质子供体 形成共价ES复合物 C N键断裂 底物 胰凝乳蛋白酶反应的详细机制 2 酰基产物释放 四面体中间物的瓦解 水亲核攻击 羧基产物释放 胰蛋白酶 弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的比较 相同点 1 一级结构相似 40 同 特别是活性部位中195位Ser周围的氨基酸顺序 都是Gly Asp Ser Gly Pro2 X射线分析揭示出的三个酶的活性中心构象十分相似 3 三个酶中都存在Asp102 His57 Ser195的催化三联体组合结构 因而具有相同的催化机制 4 三个酶合成后分泌出来均为无活性前体形式 经单一肽键断裂而被激活 不同点 底物专一性完全不同 专一性的差异与活性中心底物结合部位的氨基酸序列特性有关 胰凝乳蛋白酶为一个较宽大的 疏水的 口袋 主要由非极性氨基酸组成 口袋 上部为两个Gly 利于芳香族氨基酸进入 胰蛋白酶的 口袋 上部的构象与胰凝乳蛋白酶相似 但 口袋 底部的残基Asp189 有利于带正电的碱性氨基酸结合 弹性蛋白酶 口袋 上部为Val126和Thr226 口袋较小 可防止大侧链的氨基酸进入 而只是允许小的丙氨酸进入 七 溶菌酶的作用机制 溶菌酶催化作用中既有活性中心基团的酸碱催化 也有底物敏感键的扭曲变形和微环境影响 八 酶原和酶原的激活 酶原 没有活性的酶的前体 酶原的激活 酶原在一定条件下经适当的物质作用可转变成有活性的酶 酶原转变成酶的过程称为酶原的激活 本质 酶原的激活实质上是酶活性部位形成或暴露的过程 酶原激活的机理 胰蛋白酶原的激活过程 在组织细胞中 某些酶以酶原形式存在 具有重要的生物学意义 一则可保护分泌酶原的组织不被水解破坏 二则酶原激活是有机体调控酶活的一种形式 酶原激活进一步说明了酶的功能是以酶的结构为基础的 第四节影响酶促反应速度的因素 酶促反应动力学 一 酶促反应速度的测定测定单位时间内底物的消耗量或产物的成量 二 影响酶反应速度的因素 当S足够过量 其它条件固定且无不利因素时 v k E 二 影响对酶反应速度的因素 2 底物浓度3 pH 最适pH的概念 4 温度 最适温度的概念 5 激活剂6 抑制剂 1 酶浓度 2 底物浓度对酶反应速度的影响 1 酶反应速度与底物浓度的关系曲线 Michaelis Menten曲线 2 米氏方程的提出及推导3 米氏常数的意义4 米氏常数的测定 1 酶反应速度与底物浓度的关系曲线 2 单分子酶促反应的米氏方程及Km 推导原则 从测定反应的初速度 酶被底物饱和的现象出发 按照 稳态平衡 假说的设想进行推导 米氏方程 米氏常数 米氏方程的推导 令 将 4 代入 3 则 ES 生成速度 ES 分解速度 即 则 由于酶促反应速度由 ES 决定 即 将 2 代入 1 得 3 当酶反应体系处于恒态时 当 Et ES 时 3 米氏常数的意义 当v Vmax 2时 Km S Km的单位为浓度单位 mol L 米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度 是酶在一定条件下的特征物理常数 通过测定Km的数值 可鉴别酶 当k 1 k2可近似表示酶和底物亲合力 Km愈小 E对S的亲合力愈大 Km愈大 E对S的亲合力愈小 在已知Km的情况下 应用米氏方程可计算任意 s 时的v 或任何v下的 s 用Km的倍数表示 练习题 已知某酶的Km值为0 05mol L 1 要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80 时底物的浓度应为多少 4 米氏常数的测定 基本原则 将米氏方程变化成相当于y ax b的直线方程 再用作图法求出Km 例 双倒数作图法 Lineweaver Burk法 米氏方程的双倒数形式 1Km11 vVmax S Vmax 酶动力学的双倒数图线 1Km11 vVmax S Vmax 3 pH对酶反应速度的影响 酶的最适PH不是固定的常数 其数值受酶的纯度 底物的种类和浓度 缓冲液的种类和浓度等的影响 因此酶的最适PH只在一定条件下才有意义 过酸过碱导致酶蛋白变性 影响底物分子解离状态 影响酶分子解离状态 影响酶的活性中心构象 pH 最适pH v 4 温度与酶反应速度的关系 在达到最适温度以前 反应速度随温度升高而加快 酶是蛋白质 其变性速度亦随温度上升而加快 酶的最适温度不是一个固定不变的常数 5 激活剂对酶作用的影响 类别金属离子 K Na Mg2 Cu2 Mn2 Zn2 Se3 Co2 Fe2 阴离子 Cl Br 有机分子还原剂 抗坏血酸 半胱氨酸 谷胱甘肽金属螯合剂 EDTA 凡是能提高酶活性的物质 称为酶的激活剂 activator 有些物质能与酶分子上某些必须基团结合 作用 使酶的活性中心的化学性质发生改变 导致酶活力下降或丧失 这种物质称为酶的抑制剂 凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的作用称为酶的抑制作用 inhibitor 酶的抑制剂一般具备两个方面的特点 a 在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似 b 能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物 6 抑制剂对酶作用的影响 抑制作用的类型 不可逆性抑制 irreversibleinhibition 可逆性抑制 reversibleinhibition 竞争性抑制 competitiveinhibition 非竞争性抑制 non competitiveinhibition 反竞争性抑制 uncompetitiveinhibition 区别于酶的变性 抑制剂对酶有一定选择性引起变性的因素对酶没有选择性 1 不可逆性抑制作用 概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合 使酶失活 举例有机磷化合物 羟基酶解毒 解磷定 PAM 重金属离子及砷化合物 巯基酶解毒 二巯基丙醇 BAL 非专一性不可逆抑制剂 抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团 这些基团中包含了必需基团 因而引起酶失活 类型 有机磷化合物 路易士气 失活的酶 羟基酶 失活的酶 酸 巯基酶 失活的酶 酸 BAL 二巯基丙醇 巯基酶 BAL与砷剂结合物 专一性不可逆抑制剂 这类抑制剂选择性很强 它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合 引起酶的活性丧失 实例 有机磷杀虫剂 Ser OH 二 可逆性抑制作用 概念抑制剂通常以非共价键与酶或酶 底物复合物可逆性结合 使酶的活性降低或丧失 抑制剂可用透析 超滤等方法除去 竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制 类型 竞争性抑制作用 反应模式 定义抑制剂与底物的结构相似 能与底物竞争酶的活性中心 从而阻碍酶底物复合物的形成 使酶的活性降低 这种抑制作用称为竞争性抑制作用 竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度 即提高底物的竞争能力来消除 有竞争性抑制剂存在时 Km值增大 1 I Ki 倍 且Km值随 I 的增高而增大 在 E 固定时 当 S Km 1 I Ki Km 1 I Ki 项可忽略不计 则v Vmax 即最大反应速度不变 竞争性抑制作用的速度方程 特点 抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及底物浓度 I与S结构类似 竞争酶的活性中心 动力学特点 Vmax不变 表观Km 增大 举例 丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶 琥珀酸 延胡索酸 丙二酸戊二酸 草酸草酰乙酸 磺胺类药物的抑菌机制与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶 2非竞争性抑制 酶可同时与底物及抑制剂结合 引起酶分子构象变化 并导至酶活性下降 由于这类物质并不是与底物竞争与活性中心的结合 所以称为非竞争性抑制剂 如某些金属离子 Cu2 Ag Hg2 以及EDTA等 通常能与酶分子的调控部位中的 SH基团作用 改变酶的空间构象 引起非竞争性抑制 非竟争性抑制不能通过增大底物浓度的方法来消除 反应模式 有非竞争性抑制剂存在时 V值减小 1 I Ki 倍 且V值随 I 的增高而降低 Km值不变 非竞争性抑制作用的速度方程 非竞争性抑制作用的Lineweaver Burk图 特点 抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合 底物与抑制剂之间无竞争关系 抑制程度取决于抑制剂的浓度 动力学特点 Vmax降低 表观Km 不变 反竞争性抑制 反应模式 抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合 使ES的量下降 反竞争性抑制曲线 特点 抑制剂只与酶 底物复合物结合 抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度 动力学特点 Vmax降低 表观Km 降低 各种可逆性抑制作用的比较 第五节酶的活性调节 一 别构酶及酶的别构 变构 效应 二 酶的多种分子形式 同工酶 isoenzyme 一 酶的别构 变构 效应 概念 有些酶分子表面除了具有活性中心外 还存在被称为调节位点 或变构位点 的调节物特异结合位点 调节物结合到调节位点上引起酶的构象发生变化 导致酶的活性提高或下降 这种现象称为别构效应 allostericeffect 具有上述特点的酶称别构酶 allostericenzyme 变构激活剂变构效应剂 allostericeffector 变构抑制剂 别构酶 Allostericenzyme 的特点 一般是寡聚酶 由多亚基组成 包括催化部位和调节 别构 部位 具有别构效应 指酶和一个配体 底物 调节物 结合后可以影响酶和另一个配体 底物 的结合能力 相同 均为底物 同促效应 homotropiceffect 不同 效应调节物 异促效应 heterotropiceffect 根据配体结合后对后继配体的影响 根据配体性质 正协同效应 positivecooperativeeffect 负协同效应 negativecooperativeeffect 动力学特点 不符合米曼方程双曲线 酶的别构 变构 效应示意图 别构酶的动力学曲线 别构酶举例 天冬氨酸转氨甲酰酶 简称ATCase 综上所述 对于ATcase来说 底物 CTP ATP都是它的别构效应剂 可以通过别构效应影响酶的催化活性 从而有效地调节体内嘧啶核苷酸的生物合成 ATCase的结构及其催化链的别构过度作用 别构酶的序变模型 别构酶活性调节机理 序变模型和齐变模型 别构酶的齐变模型 二 酶的多种分子形式 同工酶 概念 存在于同一种属或不同种属 同一个体的不同组织或同一组织 同一细胞 具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶 称之为同工酶 isoenzyme 类别 原级同工酶 次级同工酶实例 乳酸脱氢酶研究意义 作为遗传的标志 作为临床诊断指标 研究某些代谢调节机制 乳酸脱氢酶同工酶形成示意图 多肽 亚基 mRNA 四聚体 结构基因 ab 不同组织中LDH同工酶的电泳图谱 生理及临床意义在代谢调节上起着重要的作用 用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断 同工酶可以作为遗传标志 用于遗传分析研究 三 酶的共价 化学 修饰调节 共价修饰 covalentmodification 在其他酶的催化下 酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合 从而改变酶的活性 此过程称为共价修饰 常见类型磷酸化与脱磷酸化 最常见 乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化 SH与 S S互变 酶的磷酸化与脱磷酸化 酶蛋白 SerThrTyr O P ATP ADP Pi H2O 蛋白激酶 蛋白磷酸酶 共价修饰调节的特点 受共价修饰的酶存在有 高 活性和无 低 活性两种形式 具有瀑布效应 级联效应 是体内经济 有效的快速调节方式 瀑布效应 四 酶分子的聚合和解聚 大多数情况下 由于酶与一些小分子调节因子结合从而引起酶的聚合和解聚 使酶在活性和无活性形式间相互转化 如乙酰CoA羧化酶由4种不同亚基组成 柠檬酸 异柠檬酸可使其聚合成多聚体 成为活性形式 第六节 酶的活力测定及分离提纯 一 酶活力的测定1 酶活力 又称为酶活性 一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力 通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示 基本原理 酶是蛋白质 种类多 结构复杂多样 一般对酶的测定 不是直接测定其酶蛋白的浓度 而是测定其催化化学反应的能力 这是基于在最优化条件下 当底物足够 过量 在酶促反应的初始阶段 酶促反应的速度 初速度 与酶的浓度成正比 即V K E 故酶活力测定的是化学反应速度 一定条件下可代表酶活性分子浓度 酶活力测定 酶活力测定就是测定一定量的酶 在单位时间内产物 P 的生成 增加 量或底物 S 的消耗 减少 量 即测定时确定三种量 加入一定量的酶 一定时间间隔 物质的增减量 酶反应条件优化 测酶活所用的反应条件应该是最适条件 所谓最适条件包括最适温度 最适pH 足够大的底物浓度 适宜的离子强度 适当稀释的酶液及严格的反应时间 抑制剂不可有 辅助因子不可缺 测定酶活力常有以下几种方法 在一个反应体系中 加入一定量的酶液 开始计时反应 经一定时间反应后 终止反应 测定在这一时间间隔内发生的化学反应量 终止时与起始时的浓度差 这时测得的是初速度 在一定条件下 加入一定量底物 规定 再加入合适量的酶液 测定完成该反应 底物反应完 所需的时间 非初速度 为一平均速度 动态连续测定法 在反应体系中 加入酶 用仪器连续监测整个酶促反应过程中底物的消耗或产物的生成 快速反应追踪法 近年来 追踪极短时间 10 3s以下 内反应过程的方法和装置已经应用 其代表有停流法 stopped flow 和温度跃变法 temperaturejump 酶活力测定方法 反应计时 终止酶反应 常使酶立刻变性 最常用的方法是加入三氯乙酸或过氯酸使酶蛋白沉淀 也可用SDS使酶变性 或迅速加热使酶变性 有些酶可用非变性法来停止反应或用破坏其辅因子来停止反应 反应量的测定 测底物减少量或产物生成量均可 在反应过程中产物是从无到有 变化量明显 极利于测定 所以大都测定产物的生成量 具体物质量的测定 据被测定物质的物理化学性质通过定量分析法测定 常用的方法有 光谱分析法 酶将产物转变为 直接或间接 一个可用分光光度法或荧光光度法测出的化合物 化学法 利用化学反应使产物变成一个可用某种物理方法测出的化合物 然后再反过来算出酶的活性 放射性化学法 用同位素标记的底物 经酶作用后生成含放射性的产物 在一定时间内 生成的放射性产物量与酶活性成正比 2 酶活力的表示方法 活力单位 activeunit 习惯单位 U 底物 或产物 变化量 单位时间国际单位 IU 1 moL变化量 分钟Katal Kat 1moL变化量 秒 转换系数 Kcat 底物 moL 秒 每个酶分子 比活力 specificactivity 酶活力单位酶活力可用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量表示 单位为mol min等 酶活力单位的基本定义为 规定条件 最适条件 下一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量 据不同情况有几种酶活力单位 activityunit 或又称酶单位 enzymeunit 国际单位 一般用活力单位U Unit 表示 许多酶活力单位都是以最佳条件或某一固定条件下每分钟催化生成1 mol产物所需要的酶量为一个酶活力单位 一个 Katal 单位是指在一定条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量 Kat和U的换算关系 1Kat 6 107U 1U 16067nKat在 U 和 kat 酶活力单位的定义和应用中 酶催化底物的分子量必须是已知的 否则将无法计算 习惯单位 在实际使用中 结果测定和应用都比较方便 直观 规定的酶活力单位 不同酶有各自的规定 如 淀粉酶活力单位 每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位 QB546 80 也有规定每小时分解1mL2 可溶性淀粉溶液为无色糊精的酶量为一个酶单位 糖化酶活力单位 在规定条件下 每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖 以葡萄糖计 所需的酶量为一个酶单位 蛋白酶 规定条件下 每分钟分解底物酪蛋白产生1 g酪氨酸所需的酶量 DNA限制性内切酶 推荐反应条件下 一小时内可完全消化1 g纯化的DNA所需的酶量 比活力 specificactivity 酶的比活力是每单位 一般是mg 蛋白质中的酶活力单位数 如 酶单位 mg蛋白 实际应用中也用每单位制剂中含有的酶活力数表示 如 酶单位 mL 液体制剂 酶单位 g 固体制剂 对同一种酶来讲 比活力愈高则表示酶的纯度越高 含杂质越少 必要条件 所以比活力是评价酶纯度高低的一个指标 在评价纯化酶的纯化操作中 还有一个概念就是回收率 回收率 某纯化操作后的总活力 某纯化操作前的总活力 总活力 比活力 总体积 总重量 基本原则 提取过程中避免酶变性而失去活性 防止强酸 强碱 高温和剧烈搅拌等 要求在低温下操作 加入的化学试剂不使酶变性 操作中加入缓冲溶液 基本操作程序 选材 微生物 微生物发酵物 胞内酶 胞外酶 动物 动物器脏 消化酶 血液 SOD酶 尿液 尿激酶等 植物 木瓜蛋白酶 菠萝蛋白酶等 抽提 加入提取液提取 胞内酶先要进行细胞破碎 机械研磨 超声波破碎 反复冻融或自溶等 分离 先进行净化处理 过滤 絮凝 离心脱色 再采用沉淀法分离 盐析法 有机溶剂沉淀法 超离心等 纯化 可采用离子交换层析 凝胶过滤 液相色谱 亲和色谱和超滤等方法 二 酶的分离纯化 第六节酶工程简介 将酶学和工程学相结合 产生了酶工程 enzymeengineering 这样一个新的领域 酶工程是围绕着酶所特有的生物催化性能使其在工农业 医学及其它方面发挥作用的一门应用技术 是酶学基本原理与化学工程技术及DNA重组技术有机结合的产物 广义地讲 酶工程还应包括酶的生产 分离和纯化 酶工程主要研究酶的生产 纯化 固定化技术 酶分子结构的修饰和改造以及在工农业 医药卫生和理论研究等方面的应用 一 化学酶工程 天然酶 固定化酶 化学修饰酶 人工模拟酶二 生物酶工程 克隆酶 突变酶 新酶 固定化酶 将水溶性酶用物理或化学方法处理 固定于高分子支持物 或载体 上而成为不溶于水 但仍有酶活性的一种酶制剂形式 称固定化酶 immobilizedenzyme 共价偶联法 交联法 溴化氰亚氨碳酸基偶联法 OH OH BrCN H2O O O C N E O CO NH E OH O C NH ENH OH H2N E 多羟基载体 O CONH2 OH 惰性 O O C NH 活泼 O C N OH 戊二醛交联法 H2N E 酶的改造和模拟 酶的改造 功能基团的化学修饰酶酶蛋白侧链的化学修饰酶分子内或间的交联反应酶的模拟 根据酶作用的原理摸拟酶的活性中心和催化机理 用化学方法制备结构较简单 高效 高选择性 稳定性能好的新型催化剂 可以是无机化合物 有机化合物或小肽 生物酶工程示意图 酶的蛋白质结构功能 新酶分子蓝图 选择性修饰方案 突变酶 新酶 克隆酶 产品 效用 发展 酶基因 遗传设计 遗传修饰 DNA重组技术 DNA重组技术 第七节维生素和辅酶 一 维生素及其与辅酶的关系 维生素 vitamin 维持机体正常生命活动不可缺少的一类小分子有机化合物 人和动物不能合成它们 必须从食物中摄取 维生素可分为脂溶性 A D K E 和水溶性两大类 多数水溶性维生素作为辅酶的主要成分 或本身就是辅酶参与体内代谢过程 维生素的缺乏和中毒 引起维生素缺乏症的常见原因维生素摄入不足机体吸收利用率降低维生素需要量增高食物以外的维生素供给不足 水溶性维生素摄入过多时 多以原型从尿中排除体外 不易引起机体中毒 脂溶性维生素大量储存于体内可导致中毒 二 主要可溶性维生素和相应辅酶 维生素辅酶功能1 B1 硫胺素 TPP 酮酸氧化脱羧2 B2 核黄素 FMN FAD氢载体3 PP 尼克酸 酰胺 NAD NADP 氢载体4 泛酸 遍多酸 CoASH酰基载体5 B6 吡哆醇 醛 酸 磷酸吡哆醇 醛 转氨 脱羧 消旋6 叶酸FH4 THFA 一碳基团载体7 生物素羧化辅酶8 C 抗坏血酸 氧化还原作用硫辛酸酰基载体 氢载体B12 氰钴氨素 变位酶辅酶一碳基团载体 共同特点 易溶于水 故易随尿液排出 体内不易储存 必须经常从食物中摄取 水溶性维生素概述 种类B族维生素和维生素C 1 维生素B1 维生素B1又名硫胺素 thiamine 体内活性形式为焦磷酸硫胺素 TPP 1 化学本质及性质 焦磷酸硫胺素 TPP TPP是催化丙酮酸或 酮戊二酸脱羧反应酶的辅酶 又称脱羧辅酶 TPP是 酮酸氧化脱羧酶的辅酶 也是转酮醇酶的辅酶 在神经传导中起一定的作用 抑制胆碱酯酶的活性 2 生化作用及缺乏症 生化作用 缺乏症 脚气病 末梢神经炎 2 维生素B2 2 生化作用及缺乏症 生化作用 FMN及FAD是体内氧化还原酶的辅基 主要起氢传递体的作用 缺乏症 口角炎 唇炎 阴囊炎等 1 化学本质及性质 维生素B2又名核黄素 riboflavin 体内活性形式为黄素单核苷酸 FMN 黄素腺嘌呤二核苷酸 FAD FMN AMP 核黄素 维生素B2和黄素单核苷酸 FMN 黄素腺嘌呤二核苷 FAD VitB2 3 泛酸 1 化学本质及性质 泛酸 pantothenicacid 又名遍多酸 体内活性形式为辅酶A CoA 酰基载体蛋白 ACP 2 生化作用及缺乏症 CoA及ACP是酰基转移酶的辅酶 参与酰基的转移作用 泛酸和CoA的结构式 SH 4 维生素PP 维生素PP包括尼克酸 nicotinicacid 尼克酰胺 nicotinamide 体内活性形式尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 NADP 1 化学本质及性质 NAD R为H NADP R为 尼克酰胺 维生素pp和尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸 NAD P 生化作用 NAD 及NADP 是体内多种脱氢酶 如苹果酸脱氢酶 乳酸脱氢酶 的辅酶 起传递氢的作用 2 生化作用及缺乏症 缺乏症 癞皮病 5 维生素B6 1 化学本质及性质 维生素B6包括吡哆醇 吡哆醛及吡哆胺 体内活性形式为磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺 2 生化作用及缺乏症 磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺是氨基酸转氨基 脱羧和消旋作用的辅酶 维生素B6和磷酸吡哆醛 磷酸吡哆胺 6 生物素 生化作用生物素 biotin 是多种羧化酶 如丙酮酸羧化酶 的辅酶 参与CO2的羧化过程 与羧基结合生成羧基生物素 与赖氨酸残基 氨基结合成生物胞素 7 叶酸 生化作用 FH4是一碳单位转移酶的辅酶 一碳单位的转移在氨基酸代谢 嘌呤 嘧啶合成中占重要地位 缺乏症 巨幼红细胞贫血 1 化学本质及性质 2 生化作用及缺乏症 叶酸 folicacid 又称蝶酰谷氨酸 体内活性形式为四氢叶酸 FH4 叶酸 对氨基苯甲酸 谷氨酸 蝶呤 8 维生素B12 生化作用 参与体内甲基转移作用 缺乏症 巨幼红细胞贫血 神经疾患 1 化学本质及性质 维生素B12又称钴胺素 coholamine 体内活性形式为甲基钴胺素5 脱氧腺苷钴胺素 2 生化作用及缺乏症 R 5 脱氧腺苷5 脱氧腺苷钴胺素R OH羟钴胺素R CH3甲基钴胺素R CN氰钴胺素 维生素B12 9 维生素C 生化作用 参与氧化还原反应 参与体内羟化反应 促进胶原蛋白的合成 促进铁的吸收 缺乏症 坏血病 1 化学本质及性质 维生素C又称L 抗坏血酸 ascorbicacid 2 生化作用及缺乏症 维生素C 10 硫辛酸 生化作用硫辛酸 lipoicacid 是硫辛酸乙酰转移酶的辅酶 起转酰基作用 C H 2 C H 2 C H S S CH 2 4 HOOC 2H 2H C H 2 C H 2 C H S H S H CH 2 4 HOOC 氧化型 脂溶 还原型 水溶 三 脂溶性维生素维生素A D E K均溶于脂类溶剂 不溶于水 在食物中通常与脂肪一起存在 吸收它们 需要脂肪和胆汁酸 维生素A维生素A分A1 A2两种 是不饱和一元醇类 维生素A1又称为视黄醇 A2称为脱氢视黄醇 主要功能 维持上皮组织健康及正常视觉 促进年幼动物的正常生长 维生素D维生素D是固醇类化合物 主要有D2 D3 D4 D5 其中D2 D3活性最高 维生素D的结构在生物体内 D2和D3本身不具有生物活性