3张汉平动植物检疫.doc

目录1材料与方法21.1材料21.2方法21.2.2 真菌NCY-5最适浓度的确定21.2.3 草甘膦浓度测定方法21.2.4 优势碳氮源选择方法31.2.6 目标菌多因素影响试验32 结果与分析42.1 菌株NCY-5草甘膦最适浓度的确定42.2 草甘膦标准曲线42.2 优势碳源选择结果52.3 优势氮源选择结果62.5 目标菌降解率的综合影响结果73 讨论7参考文献8英文摘要9致谢10碳氮源对草甘膦高效降解菌NCY-5降解效能影响的研究张汉平（安徽农业大学植物保护学院08级动植物检疫，合肥，230036）指导教师：丁婷 副教授（安徽农业大学植物保护学院，合肥230036）摘 要：草甘膦以高效、低毒、经济、生产简易等优势成为中国目前广泛使用的一种有机磷除草剂；其化学性质稳定，长期大量使用造成环境农药污染的加重，近年来研究发现草甘膦对益虫、鱼类及其他水生生物具有较强的毒性，其残留治理成为环境保护的课题之一。本实验在前期工作的基础上，以优势真菌NCY-5为研究对象，利用单因子试验研究不同碳氮源对其降解效能的影响。在供试的5种碳源中，浓度为1%，以蔗糖为碳源时，NCY-5菌株对草甘膦的降解率最高，达到81.30%，以淀粉为碳源源时，NCY-5菌株液体培养所得生物量最高；在供试的5种氮源中，浓度为0.05%，以KNO3为氮源时，NCY-5菌株草甘膦降解率最高达到36.38%，以酵母浸出粉为氮源时，NCY-5菌株培养所得生物量最高。以降解率为筛选指标，真菌NCY-5多因素影响实验发现KH2PO4浓度对降解率影响最显著，并得到初步优化后的液体培养条件。关键词：氮源；碳源；草甘膦；降解效能草甘膦（Glyphosate）是美国孟山都公司在1971年开发的一种芽后灭生性除草剂。它通过内吸传导作用进入植物体，主要通抑制5-烯醇式丙酮酸基莽草酸-3-磷酸酯合成酶（EPSP合成酶）的活性1,2，从而阻碍莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的转化，使蛋白质的合成受到干扰导致植物死亡3,4,5。草甘膦适用于果园、桑园、农田环境，对众多一年生和多年生、草本和灌木等40多科的杂草具有很强的清除作用。草甘膦具有对人畜毒性低和易于生产、储存、运输等优势，在中国得到推广使用。草甘膦的化学名称为N-膦酸甲基-甘氨酸，具有良好的稳定性，长期使用会在环境中积累，造成农药污染，其对水生生物、农田益虫等有一定的毒性6,7，这不符合绿色农业、环保农业的发展要求。残留于环境中的草甘膦主要通过自然缓慢降解、光解以及微生物降解等途径降解8，其中微生物降解是主要的降解途径。微生物降解环境残留草甘膦与其它途径相比具有效率高、无次生污染等优点914，而且具有从微生物中分离出降解活性酶进行单克隆的应用前景。在前期实验中，分离得到一株真菌NCY-5具有较高的降解效能，因此，本研究将以真菌NCY-5为实验材料，以草甘膦降解率为指标，对真菌NCY-5进行液体培养工艺的研究，以期为草甘膦降解菌应用于环境中草甘膦污染的生物修复提供理论基础，也为真菌NCY-5的开发应用提供科学依据1316。1材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株真菌菌株NCY-5。1.1.2 供试药剂 市售重庆树荣化工有限公司生产售的30%草甘膦水剂。1.1.3 培养基基础培养: KH2PO4 0.5g，K2HPO4 1.5g，NaCl 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，CaCl2 0.04g，pH=7.0，1L去离子水。 PDA培养基：马铃薯 200g，琼脂1520g，葡萄糖 1520g，1L水。PD培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水lL。 1.1.4主要仪器设备 紫外分光光度计SHIMADZU UV-1800，离心机，烘箱，恒温培养箱、摇床、高压蒸汽灭菌锅等1.2方法1.2.2 真菌NCY-5最适浓度的确定草甘膦浓度分别为100、200、300、400、600、800、1000、1200、1400、1600、1800mgL-1的PDA平板培养目标菌株NCY-5，每天测量菌落直径，第7天刮下菌丝测干重，依据统计结果可以明确目标菌的最适草甘膦浓度。1.2.3 草甘膦浓度测定方法1.2.3.1草甘膦标准曲线的绘制 采用董文庚等亚硝化紫外分光光度法17，绘制草甘膦标准曲线，并计算出回归方程。1.2.3.2 培养液中草甘膦量的测定将目标菌株活化至对数生长期（3天），以5% 的接入量接种于含草甘膦的液体培养基中，25 、180rpm条件下摇床培养6d，菌液离心上清液稀释10倍后测OD值，参考标准方程，计算出相应的草甘膦浓度。降解率p=(C1-C2)C1100，公式中，C1-草甘膦的原始浓度，即目标菌的最适草甘膦浓度；C2测得的OD值依据标准方程计算出的草甘膦浓度，单位mgL-1。1.2.4 优势碳氮源选择方法碳、氮源选择试验中以培养基的5%接目标菌的母液,菌丝的干重和降解效率作为优势碳、氮源的评价依据。1.2.4.1 优势碳、氮源试验方法含1%碳元素的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、可溶性淀粉的基础液体培养基培养目标菌株，每组碳源设置3个重复，对照组用基础液体培养基，对照组和试验组草甘膦浓度均为目标菌的最适浓度，25摇床培养6天。培养后的菌液8000rpm离心10min，下层菌丝90烘干称重，上层清液利用分光光度法测其中草甘膦的浓度，依照标准方程可以计算出对应碳源下的降解率。含0.05%氮元素的KNO3、蛋白胨、酵母浸出粉、(NH4)2SO4、NH4Cl的基础含碳上一步中的最佳碳源液体培养基培养目标菌株，每组氮源设置3个重复，对照组用基础液体培养基，对照组和试验组草甘膦浓度均为目标菌的最适浓度，25摇床培养6天。菌液的处理同优势碳源筛选试验，计算得到相应氮源下目标菌的的降解率。1.2.6 目标菌多因素影响试验探讨菌株NCY-5在四因素、三水平条件下的草甘膦降解效能。试验因素分别是优势氮源、优势碳源、KH2PO4、K2HPO4，DPS软件设计18的试验方案如表1。表1 四因素、三水平试验设计表Table 1 four factors, three levels of test design table处理号N含量/%C含量/%KH2PO4 / gL-1K2HPO4/gL-110.051.00.51.520.051.51.02.030.052.01.52.540.101.01.02.550.101.51.51.560.102.00.52.070.151.01.52.080.151.50.52.590.152.01.01.5将活化后的目标菌接入含草甘膦浓度为目标菌的最适浓度的各处理组， 25下摇床培养6d，菌液8000rpm离心10 min ，菌丝体烘干称重，上清液利用分光光度法测OD值，依标准方程计算其中草甘膦浓度。试验结果通过DPS软件可以分析出各个因素及水平对菌生长与降解率的影响，依据降解效率选择优势液体发酵条件。2 结果与分析2.1菌株NCY-5草甘膦最适浓度的确定通过设置11个草甘膦浓度梯度进行试验，所得的结果如图1。如图所知，草甘膦含量从100mg.L-1 增加到1800mg.L-1的过程中，菌株在含草甘磷的马铃薯琼脂培养基平板上的生长状况有明显的变化。随着草甘嶙含量的增加，菌株的长势较好；当草甘磷含量为400 mg.L-1时，菌株的生长情况达到最佳；当草甘磷含量继续增加，菌株生长明显受到阻碍。由此可知，目标菌NCY-5在草甘膦浓度为400mg.L-1时菌丝的生长直径和菌丝干重最大。综上分析，菌株对于草甘磷有一定的耐受能力，当草甘麟含量为400 mg.L-1时，菌株耐受性最强，长势最好。因此，在其他实验中，将草甘磷含量设定为400 mg.L-1，以下实验中培养基中草甘膦的浓度均指菌株NCY-5的最适浓度。图1 最适浓度试验结果图Figure 1 The optimal concentration of test results in Figure2.2 草甘膦标准曲线草甘膦分析纯标准样配制标准溶液，测其OD值如下表：表2 标准溶液OD值表Table 2 Standard solution OD values in table浓度 /mgL-1OD值0080.364160.627240.846321.143401.356依据标准溶液OD值作图图2 草甘膦标准曲线Figure 2 Glyphosate standard curve董文庚等亚硝化紫外吸光光度法在测溶液草甘膦时要求其浓度范围为040mgL-1，标准曲线方程为y=0.0333x+0.0558,R2=0.9937。样液在稀释10倍后用此方法测其OD值，并依据标准方程计算样液草甘膦的浓度。2.2 优势碳源选择结果菌株NCY-5在碳含量为1%的不同碳源培养基中培养6天，得到的结果如下图3。由图可知，菌株在没有添加碳源和添加5种不同碳源的培养基中降解草甘磷的能力有明显不同。没有添加碳源时，菌株的降解率较低，只有33.35%。而以蔗糖为碳源时，降解草甘磷的能力最强，为81.30%。其次是麦芽糖、乳糖、葡萄糖，降解率分别54.36%、49.17%、40.85%。以淀粉为碳源时，降解率最低，为26.01%，甚至低于没有添加碳源的空白对照，分析原因可能是淀粉不稳定，在高温灭菌时发生了性状改变。因此选用蔗糖为唯一碳源，在后续实验中，研究蔗糖在不同浓度梯度下对降解率的影响。注：对照组没有添加碳源物质的含草甘膦基础液体培养液。图3 五种碳源试验结果Figure 3 The results of five kinds of carbon sources2.3 优势氮源选择结果目标菌在碳含量为0.05%的不同氮源（碳源选用蔗糖）培养基中培养6天，得到的结果如下图4。由图可以看出，菌株在不同氮源的影响下，对草甘麟的降解率有明显不同，降解率由大到小的次序是:硝酸钾 酵母浸出粉 蛋白胨 硫酸铵 氯化铵 无氮。其中菌株在以硝酸钾为氮源时，草甘膦的降解率最高，为36.38%，故选用硝酸钾为唯一氮源，在后续实验中，研究硝酸钾在不同浓度梯度下对降解率的影响。图4 五种氮源试验结果Figure 4: The five nitrogen test results2.5 目标菌降解率的综合影响结果利用极差分析法对菌株正交试验的结果进行分析（表3），结果表明:菌株在研究的四个影响降解的因素中，KH2PO4 (c因素)的极差最大，为0.2223。由此可知KH2PO4浓度高低变化对降解效能的大小影响最显著。其次是碳源蔗糖(B因素) 和氮源硝酸钾(A因素)，而K2HPO4对降解率的影响相对最小。由此可以得到菌株降解草甘膦的最佳培养组合为A2B3C1D2，即硝酸钾0.10%(N含量)，蔗糖2.0%(C含量)，KH2PO4 0.5 gL-1，K2HPO4 2.0 gL-1。表3 四因素试验结果Table 3 four-factor test results试验号因素降解率/%平均/%ABCD1111148.7750.2242.080.47022122215.6718.9220.7206420.6526.820.23374212337.8841.2244.350.41155223117.8521.6619.060.19526231257.8353.4552.770.54687313227.7830.4432.660.30298321339.6933.5641.280.38189332131.2225.4827.960.28220.29610.39490.46630.31590.38450.25380.29270.34470.32230.35420.24390.3423R0.08840.14110.22230.02883 讨论3.1 在该研究中探究了菌株NCY-5培养时最适草甘膦浓度，比较草甘膦浓度的高低对菌生长的具体影响。比较结果表明：就生物量而言，首先菌株NCY-5在仅含草甘膦的基础液体培养基中能以草甘膦作为其生长所需的碳氮源，具体表现为草甘膦浓度在100400 mgL-1范围内，随浓度的升高，菌株NCY-5生物量也增加；其次菌株NCY-5对草甘膦的耐受力有限，当草甘膦浓度超过400 mgL-时，草甘膦浓度增加菌丝生物量反而降低。最适浓度试验找到菌株NCY-5对草甘膦的耐受限度，保证菌株处于生长状态良好是进行碳氮源筛选实验的必要前提。3.2 本实验比较了5种碳源和5种氮源对菌株NCY-5降解效率及生物量的影响。碳源筛选结果：以生物量为筛选指标，淀粉最佳，乳糖其次；若以菌株NCY-5降解率为指标，蔗糖效果最佳。综合评价以降解率为主要依据，并且在蔗糖为碳源时菌丝量未显著下降，所以蔗糖为菌株NCY-5的最佳液体碳源。氮源筛选结果：以生物量为筛选指标，酵母浸出粉最佳，硝酸钾其次；若以降解率为指标，硝酸钾最佳，酵母浸出粉其次。综合评估以降解率为主要依据，因此硝酸钾为菌株NCY-5的最佳液体氮源。3.3 菌株NCY-5降解率综合影响实验可知，真菌菌株NCY-5降解率受KH2PO4浓度影响最为显著，其次受氮源硝酸钾浓度的影响较显著。菌株NCY-5液体培养降解草甘膦的最佳培养配方为硝酸钾0.10%(N含量)，蔗糖2.0%(C含量)，KH2PO4 0.5 gL-1，K2HPO4 2.0 gL-1，此配方培养基培养是菌株NCY-5的降解率为54.68%。3.4 针对本试验优化后的液体培养方案的降解率低于仅蔗糖的碳源培养的降解率，在培养液营养丰富时，菌株NCY-5的降解率反而会下降的这种现象，这一现象是否是因为菌株NCY-5对草甘膦的降解效能是在缺乏营养和草甘膦共同诱导下产生的，当营养条件改变时，诱导强度产生变化而导致降解率下降又或是降解草甘膦的酶系是一种诱导酶，在碳、氮源等营养充足的条件下降解酶合成减少或活性降低。这一现象有待于作进一步的研究证明。此外，试验中只对影响菌株NCY-5的少量因素进行了探究，碳氮源浓度、盐浓度、pH值等因素对菌株NCY-5降解率的影响没有考察，将在后续研究中作深入研究。3.5草甘膦施用到农田、果园等环境下的残留主要通过土壤微生物进行降解，实验条件下菌株NCY-5降解率可以达到81.30%，但在自然条件下微生物受到多方面因素的影响，降解能力受限，需要做进一步的实验进行完善。本试验从土壤中获得对草甘膦具有降解活性的目标真菌NCY-5，并探寻其在不同因素影响下降解效能的改变，形态学鉴定为半知菌类瓶霉属真菌。微生物对于草甘膦的代谢分解是通过一系列的酶促进行的，后续的工作可以通过对目标菌中蛋白的分析，找出具有降解效能的酶，对应的序列也可以找到，通过基因工程的方法可以生产出高效的草甘膦环境治理微生物。参考文献1 石成春,郭养浩,王大奈,等.草甘膦曲霉生物降解的动力学研究J.中国环境科学,2005,25(3):361-365.2 苏少泉.草甘膦述评.农药J,2005,44 (4): 148-148.3 刘攀.草甘膦对水生生物的毒性效应及环境安全性研究.吉林大学硕士论文.20094 Alejandro P V, Gildal M, Luis H E, et al. Cloning and sequencing of the genes involved in glyphosate utilization by pseudomonas pseudomalleiJ.Applied and Environmental Microbiology,1995,61(2): 538-543. 5 Suna Y C,Yan L ,Hai Z G,et al. Reconstitution of the enzyme A roA and its glyphosate to lerance by fragment complementationJ. FEBS Letters,2006,580:1521-1527.6宋辉，胡好远等. 啶虫脒和草甘膦及其复合污染对水螅的毒性作用.安徽农业科学J.30(20):10811-10813.7欧阳凤.2种农药对牛蛙蝌蚪的急性毒性试验研究.新乡学院学报(自然科学版)J.27(4):63-64.8 朱玉,于中连,林敏.草甘膦生物抗性和生物降解及其转基因研究.分子植物育种J,2003,1 (4):435-441.9 Araujo A S F,Monteiro R T R,Abarkeli R B. Effect of glyphosate on the microbial activity of two Brazilian soils J.Chemosphere,2003,52:799-804.10 朱国念，楼正云等.草甘膦对水生生物的毒性效应及环境安全性研究.浙江大学学报(农业与生命科学版)J，2000，26( 3) : 309312.11 Stephan Brosillon,Dominique Wolbert,Marguerite Lemasle,et al. Chlorination kinetics of glyphosate and its by-products modeling approachJ. Water Research,2006,40:2113-2124.12 Busse Man D,Ratclif Alice W,Shestak Carol J,et a1. Glyphosate toxicity and the efects of long-term vegetation control on soil microbial communitiesJ.Soil Biology and Biochemistry,2001,33:1777-1789.13 S A E Kools,M van Roovert,C A M van Gestel,et al.Glyphosate degradation as a soil health indicator for heavy metal polluted soilsJ. Soil Biology and Biochemistry, 2005,37:1303-1307.14 虞云龙, 樊德方, 陈鹤鑫. 农药微生物降解的研究现状与发展策略J. 环境科学进展, 1996, 4(3):2836.15 吴红萍,郑服丛.微生物降解有机磷农药研究进展J.广西农业科学,2007,38（6）:637642.16 梁伊丽,曾富华,卢向阳.有机磷农药的微生物降解研究进展J.微生物学杂志,2004,24（6）:5155.17 董文庚, 陈学诚, 郎志敏, 等. 吸光光度法测定废水中草甘膦J. 理化检验化学分册，1997, 33(8): 347-348.18（美）耿旭,（美）希尔斯（Hills,F.J.）著;高明尉等译. 农业科学生物统计M. 北京:农业出版社, 1988.08.英文摘要Study on Optimizing the Carbon and Nitrogen Source of Fermention Medium of NCY-5 Strain Hanping Zhang（2008grade of animal and plant quarantine of plant protection College of Anhui agricultural university,Hefei 230036)Instructor: Professor Ding Ting（College of Plant Protection, Anhui Agricultural University, He Fei 230036）Abstract: Glyphosate as an organophosphate herbicide widely used in China which is high efficiency, economy, production of simple and other advantages; its chemically stable, long-term heavy use caused the aggravation of environmental pesticide contamination in recent years, research found that glyphosate phosphine had a strong toxicity to beneficial insects, fish and other aquatic organisms, the residual governance was one of the topics of environmental protection. On the basis of preparatory studies, the glyphosate-degrading strain NCY-5 was researched, the effects of diferent nitrogen and carbon sources on the strain NCY-5 degtradation were studied by single factor experimentThe results showed at the concentration of 1 percent